Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Identifikasjon av homologe rekombinasjon hendelser i mus embryonale stamceller Southern Blotting og polymerasekjedereaksjons

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58467
Automatic Translation
*1,2, *1, *3, 1, 1, 1, 4, 5, 3, 1
1Lab of Animal Models and Functional Genomics (LAMFG), The Key Laboratory of Animal Vaccine & Protein Engineering, College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University (HUNAU), 2Department of Pathology, Georgetown University Medical School, 3College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University (HUNAU), 4Lab of Molecular Cardiology (LMC), National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH), 5Transgenic Core, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH)
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en detaljert protokoll for å identifisere homologe rekombinasjon hendelsene skjedde i mus embryonale stamceller bruker Southern blotting og/eller PCR. Denne metoden er eksemplifisert ved generering av nonmuscle myosin II genetisk erstatning musen modeller med tradisjonelle embryonale stamcelleforskningen-baserte homologe rekombinasjon-mediert teknologi.

Abstract

Forhold til saker av off-målet effekter og vanskelighetene med å sette inn en lang DNA-fragment i anvendelsen av designer nucleases for genomet redigering, embryonic stem (ES) cellebasert genet målretting teknologi har ikke disse svakhetene og mye brukes til å endre dyr/mus genomet mellom store slettinger/innsettinger single nukleotid erstatninger. Spesielt, ønsket identifisere relativt få homologe rekombinasjon (HR) hendelsene nødvendig for å oppnå ES kloner er et viktig skritt, som krever nøyaktig og pålitelig. Southern blotting og/eller konvensjonelle PCR benyttes ofte til dette formålet. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer for å bruke disse to metodene til å identifisere HR hendelsene skjedde i musen ES celler som endogene Myh9 genet er ment å være forstyrret og erstattet av cDNAs andre nonmuscle myosin tunge kjeden IIs (NMHC IIs)-koding. Hele prosedyren for Southern blotting omfatter bygging av vector(s), electroporation, stoff utvalg, utvidelse og lagring av ES celler/kloner, forberedelse, fordøyelse og blotting genomisk DNA (gDNA), hybridization og Vask av probe(s), og en siste trinnet i autoradiography på X-ray filmer. PCR kan utføres direkte med forberedt og utvannet gDNA. For å oppnå perfekt resultat, bør sonder og begrensning enzym (RE) kutte nettsteder for Southern blotting og primere for PCR være nøye planlagt. Om gjennomføring av Southern blotting er tidkrevende og arbeidskrevende og PCR resultater har falske positiver, riktig identifikasjon av Southern blotting og rask screening av PCR tillater alene eller kombinert bruk av metodene beskrevet i denne utredningen å bli mye brukt og konsultert av de fleste laboratorier i identifikasjon av genotyper ES celler og genetisk endret dyr.

Introduction

Teknologien av genet målretting av HR i murine ES celler inneholder et kraftig verktøy for dissekere mobilnettet konsekvensene av bestemte genetiske mutasjoner1,2. Betydningen og betydningen av denne teknologien gjenspeiles i anerkjennelsen av 2007 Nobelprisen i medisin3,4; i mellomtiden representerer ankomsten av moderne tid genet engineering5. Gene målretting gjennom HR kan benyttes for å ingeniør nesten endringer mellom punkt mutasjoner store chromosomal rearrangements i genomet mus ES celler6,7. Det er velkjent at før fremveksten av såkalte genomet redigeringsverktøy, generering av genet knockout mus kreves bruk av genet målretting teknologi i ES celler8,9,10. I løpet av de siste to tiårene, ble mer enn 5000 genet målrettede mus produsert av denne tilnærmingen for modellering menneskelige sykdommer eller studere genet funksjoner11. En genomet hele knockout innsats er opprettet for å distribuere genet målretting vektorer, målrettet ES cellen kloner og levende mus til vitenskapelige samfunnet2,12,13,14 , 15. utvilsomt ES cellebasert HR-mediert genet målretting teknologien har sterkt avansert vår forståelse av funksjonene av gener i fysiologiske eller patologisk kontekst.

Fordi HR er en relativt sjelden hendelse i pattedyr celler16,17, viktig og neste trinn etter er genet målretting i murine ES celler å analysere mange ES koloniene for å identifisere noen kloner mutasjoner som følge av HR med målretting vektor18. Gull metodene for å identifisere HR hendelser inkluderer Southern blotting og PCR19,20. Fordelene med tilnærminger inkluderer at Southern blotting kan identifisere riktig målrettet ES kloner og tillater forskere å analysere strukturen i genet målrettede eventen en verifisering av en enkelt kopi innsetting av Konstruer, mens en PCR-basert strategi tillater rask screening for HR hendelser21,22. Selv om disse metodene har ulemper, slik at de er tidkrevende og kan har falske positiver, combinational bruk av dem er vidt akseptert og brukes av de fleste laboratorier identifisere HR hendelser, særlig i ES celler for generering av genetisk endret dyr.

Tre isoformene av nonmuscle myosin II (NM II) i pattedyr, hver bestående av to identiske NMHC IIs som kodes ved tre forskjellige gener (navngitt Myh9, Myh10 og Myh14) og to par lys kjeder, kalles NM II-A II-B og II-C23. Tidligere studier har indikert at minst isoformene NM II-A og II-B er avgjørende for musen utvikling fordi den i vivo ablation av disse isoformene gir embryonale dødelighet24,25,26. Å omgå dette problemet og få ny innsikt i isoformen-spesifikke funksjonene til NM II-A og II-B i senere stadier av musen utvikling, en genetisk erstatning strategi med ES cellebasert HR-mediert genet målretting teknologi ble vedtatt å generere en rekke musen modeller27. I løpet av identifisere ønsket ES kloner, både Southern blotting og PCR metoder ble brukt, og dette viste seg for å være effektive og pålitelige27,28.

Utredningen har til hensikt å gi en detaljert beskrivelse av Southern blotting og PCR, inkludert utforming av målretting vector(s), probe(s), og grunning og gjennomføring av eksperimenter og analyse av resultater eksemplifisert ved å identifisere HR hendelse forekomst i ES celler for å opprette genetisk erstatning NM II musen modeller og representant. Protokoller av disse to metodene presenteres her kan også vedtas for å identifisere genotyper genmodifiserte celleområde eller dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. prosjektert rettet mot Construct(s), sonder for sørlige Blot og primere for PCR

  1. Velg den første koding ekson (ekson 2) av Myh9 genet for avbrudd eller innsettingspunktet i programmet i knockout/knock-i rapporterte her.
  2. Hente de 5-kb oppstrøms og 5 kb nedstrøms DNA-sekvensene rundt Myh9 ekson 2 fra genome.ucsc.edu nettsted.
  3. Analysere begrensning fordøyelsen mønstre av enzymer (REs) med 1 – 2 kutt i denne 10-kb-regionen med pDRAW programvare for å finne egnet RE(s) å fordøye genomisk DNA for Southern blotting.
    Merk: Dra jeg oppfyller dette kravet og velges for formålet.
  4. Velg et 4 kb fragment umiddelbar oppstrøms Myh9 ekson 2 som venstre homologi armen (LHA) og 1,7 kb fragment umiddelbar nedstrøms serie som høyre homologi armen (helse); Velg et 1 kb fragment 5' oppstrøms av LHA som venstre sonden (LP) for Southern blotting og en 1,2 kb fragment 3' nedstrøms av helse som høyre sonden (RP), basert på vår analyse.
  5. Bruk et primer3 program for å utforme de forover og bakover grunning for forsterke de fire DNA fragmentene av PCR. Design et par primere med fremover primer bodde nær 3 terminalen med et utvalg markør neomyocin motstand (P1) og omvendt primer ligger like utenfor helse (P2).
    Merk: Dette primer paret brukes til å identifisere målrettet ES kloner av PCR29.
  6. Finne en 129Sv BAC klone dekker musen Myh9 gene locus ved å besøke nettsiden bacpac.chori.org (Merk: isogenic DNA foretrekkes). Isolere BAC DNA ved å bruke en kit egnet for rensing store deler av DNA følge instruksjonene fra produsenten.
    Merk: Renset BAC DNA brukes som mal for PCR forsterkning.
  7. Tegne en skjematisk fremstilling av målretting konstruksjoner, prober og primere oppsummere denne informasjonen.

2. generasjon rettet mot Construct(s) og prober for sørlige Blot og utarbeidelse av primere for PCR

  1. Bestill PCR primere beskrevet ovenfor og oppløses dem i en konsentrasjon på 20 µM.
  2. Forsterke homologi armer og sonder av PCR i en reaksjon-løsning inkludert 1 µL frem og 1 µL omvendt primere, 1 µL av BAC DNA (50 ng) som malen, 5 µL av bufferen for Pfu og 1 µL av Pfu ultra som DNA-utvalg , og H2O opp til 50 µL. utføre PCR i en PCR maskin under følgende betingelser: 95 ° C i 3 min; 95 ° C for 30 s; 60 ° C for 30 s; 72 ° C og 1 kb/min; 30 sykluser; til slutt, 72 ° C i 10 min.
  3. Rense PCR produkter med en PCR rengjøring utstyr i henhold til protokollen fra produsenten og elute DNA fragmenter med 40 µL av H2O. Digest renset PCR produktene med forhåndsutformede REs i en reaksjon-løsning som inneholder 5 µL 10 x bufferen for oppløsning , 2,5 µL RE1 og 2,5 µL av RE2 og eluted DNA, ved 37 ° C i 2 h. kjøre en 1% DNA gel eget mål DNA band, avgiftsdirektoratet gel som inneholder målet DNA under UV lys, rense målet DNA fragmenter fra gel bruker en DNA gel utvinning kit ifølge til protokollen fra produsenten, og elute DNA fragmenter med 40 µL av H2O.
  4. Klone homologi armer og legge uttrykket cassette(s) i mpNTKV-LoxP-vektor i henhold til den forsterkes og renset helse, LHA og legge uttrykket cassette(s) fra andre vektorer å få det endelige mål Construct(s). Klone DNA fragmenter av forsterket og renset sonder i T-lett vektoren.
  5. Bekreft nukleotid sekvenser av alle klonet DNA fragmenter av sekvensering27,28.

3. forberedelse rettet mot Construct(s), Electroporation ES celler og forsterkning av ES kloner

  1. Forberede hver målretting konstruere bruker en plasmider maxiprep kit i henhold til protokollen fra produsenten. Linearize hver konstruere plasmider av fordøye det ikke jeg i en 400 µL reaksjon inkludert 40 µL 10 x bufferen for ikke I, 10 µL av ikke jeg, 100 µg av DNA, og H2O opptil 400 µL, på 37 ° C over natten.
  2. Rense den linearisert målretting construct(s).
    1. Ekstra fordøyd reaksjon løsning 1 x med en lik mengde fenol: kloroform: Isoamyl alkohol (25:24:1) og sentrifuge på en styrke på 2000 x g for 10 min.
    2. Overføre nedbryting til en ny 1.5-mL tube, utløse DNA bruker 2,5 ganger etanol og 0,1 x 3M natrium acetate (pH 5.2) (volumkontrollen) og sentrifuge på en styrke på 2000 x g i 10 min.
    3. Fjerne supernatant, vask DNA pellets 1 x med 1 mL av 75% etanol og sentrifuge på en styrke på 2000 x g i 5 min.
    4. Fjern nedbryting og air-dry DNA pellet i 5 min.
    5. Oppløse den linearisert DNA pellet sterilt Tris-EDTA (TE) buffer på en siste konsentrasjon av 1 µg/µL.
  3. Bland 50 µg av hver linearisert målretting konstruksjon med 0.5 x 107 ES celler. Utføre electroporation på 320 V og 250 µF. Plate electroporated ES celler på retter med neo-resistente MEF matere.
  4. Etter 24 timer, Bytt til ES celle medium med 400 µg/mL G418 og 200 µM ganciclovir og fortsette å kultur for 4-5 dager med en daglig medium endring. Hente stoff-resistent ES kloner i 48-vel platene.
    Merk: Vanligvis fire 48-vel plater er brukt per konstruksjon.
  5. Dupliser 48-vel platene.
    Merk: Ett sett med platene er cryopreserved, og det andre settet brukes for genomisk DNA forberedelse.

4. forberedelse av genomisk DNAs og fordøyelsen med Restriction Enzyme(s)

  1. Forberede gDNAs fra ES celler ved hjelp av en kommersiell kit (genomisk DNA rensing kit) med mindre modifikasjoner.
    1. Fjern medier fra ES cellekultur og legge 500 µL av kjerner lysis løsning, inkludert RNaseA, direkte til brønnene til lyse cellene.
      Merk: Cellen lysate kan lagres ved-80 ° C eller behandlet umiddelbart.
    2. Pipetter opp og ned flere ganger til lyse cellene fullt og overføre dem til en ren 1.5-mL tube.
    3. Legge til en tredjedel av volumet av protein nedbør løsning på 1,5 mL tube, vortex kraftig for 20 s, chill prøvene på is 5 min, og deretter virvel i en styrke på 2000 x g for 5 min. overføring nedbryting til en annen ren 1,5 mL tube contai Ning en lik mengde isopropanol; Bland forsiktig løsningen. (Merk at hvite tråd-lignende tråder kan bli sett på dette tidspunktet.) Sentrifuge på en styrke på 2000 x g for 1 min; deretter forkaste nedbryting.
    4. Vask gDNA pellets med 1 mL av 70% etanol i romtemperatur, sentrifuge på en styrke på 2000 x g for 1 min, Sug opp nedbryting nøye og deretter air-dry gDNA pellets for 3 min.
    5. Oppløse gDNAs med 100 µL av DNA rehydrering løsning og deretter ruge på 65 ° C i 1 time eller 4 ° C over natten.
    6. Lagre gDNAs på 2-8 ° C.
  2. Ufullstendig gDNAs med forhåndsdefinerte RE Dra I. satt opp en 30-µL fordøyelsen reaksjon ved å blande 3 µL av 10 x bufferen for Dra I 3 µL av Dra jeg, 10 µg gDNAs/prøve og H2O opptil 30 µL og ruge på 37 ° C over natten.
  3. Sjekk fullstendigheten av fordøyelsen av DNA gel, analysere 5 µL av fordøyd reaksjon, og deretter legge til de 3 µL av 10 x DNA-lasting bufferen for det påfølgende trinnet.

5. Southern Blotting og PCR identifikasjon

  1. Southern blotting screening
    1. Skille fordøyd gDNAs av geleelektroforese og overføre til en membran.
      1. Forberede en 1% agarose geleelektroforese gel med ethidium bromide (EB), laste prøvene fra trinn 4.3 og en 1 kb stige og kjøre gel med en lav spenning (30 – 40 V) over natten.
      2. Ta ut gel og ta et bilde med DNA gel-imaging system etter geleelektroforese. Sjekk om de fordøyd og atskilt gDNAs viser en smear-lignende bilde.
      3. Nyt gel i en skuff med 0,2 N HCl løsning og rist den forsiktig i 20 min ved romtemperatur.
      4. Overføre gel til DNA-denaturing løsning og rist den forsiktig i 20 min ved romtemperatur.
      5. Bytt gel i DNA-nøytralisere løsning og rist den forsiktig i 20 min ved romtemperatur.
        Merk: Gel er utsatt for brudd etter dette trinnet, så det må behandles forsiktig.
      6. Bruke rask nedadgående overføring til å overføre DNAs fra gel til membranen. Montere TurboBlotter og blotting stabelen i henhold til instruksjonene fra produsenten.
        Merk: 10 x eller 20 x saltholdig-natriumsitrat (SSC) løsning brukes som en overføring buffer. Generelt er 3t overføring nok til å overføre 95% av gDNAs fra gel til membran; men er en lengre tid for overføring ufarlige.
      7. Ta ut membranen og vaske det med 2 x SSC for 1 min, absorbere væske med vev og deretter link DNA med membran med en UV-crosslinker.
        Merk: Membranen kan lagres på 4 ° C i en uke.
    2. Etiketten DNA sonder med radioaktivitet.
      1. Rense sonde plasmider bruker en miniprep kit i henhold til protokollen fra produsenten.
      2. Utgivelsen DNA fragmenter av sonder fra plasmider vektoren som EcoR jeg fordøyelsen i en reaksjon-løsning inkludert 5 µL bufferen for EcoR jeg, 2 µL av EcoR jeg enzym, 20 µg av plasmider DNA og H2O opptil 50 µL , 2 h.
      3. Kjøre en 1% DNA gel for å skille sonde DNA fragmenter fra vektoren og rense DNA fragmenter av sonder med en DNA gel utvinning utstyr i henhold til protokollen fra produsenten.
      4. Bruker 1 µL av DNA løsning, måle DNA konsentrasjonen av sonden DNA fragmenter med et spektrofotometer på en bølgelengde på 260/280 nm.
      5. Forberede 40-ng av sonde DNAs i en 1,5 mL tube med 45 µL TE bufferen, kok i 3 minutter, spin kort og deretter plassere lysrør på is 2 min.
      6. Legge til varme-denaturert sonde DNAs røret med ready-to-go DNA-merking perler (-dCTP), Pipetter opp og ned å blande, Legg 5 µL av [α32P] dCTP, og deretter ruge på 37 ° C i 15 min.
      7. Rense merket sonder ved hjelp av G-50 microcolumns i henhold til instruksjonene fra produsenten, og deretter måle radioaktiviteten ved en scintillation teller (valgfritt).
    3. Hybridize membrane(s) med merket sonder.
      1. Prehybridize membranen.
        1. Prewarm hybridisering løsningen på 42 ° C i 30 min. blanding 20 mL prewarmed hybridisering løsning med 200 µg kokt laks sæd DNA i en 50-mL tube.
        2. Plass membranen i hybridisering røret. Legge til blandet prehybridization løsningen hybridisering røret. Plasser den i hybridisering ovnen (sett rullende og temperaturen på 42 ° C) og la prehybridization fortsette i 30 min.
      2. Hybridize membranen med det merket probe(s).
        1. Ta ut hybridisering røret og hell den prehybridization løsningen i en 50 mL tube; legge denaturert sonden (oppvarmet ved 100 ° C i 3 minutter) fra trinn 5.1.2.7 for rør og bland forsiktig.
          Merk: Redusere inducing bobler.
        2. Hjem blandet løsningen til hybridisering røret utføre hybridization på 42 ° C over natten.
    4. Vask membrane(s) for å fjerne nonhybridized sonder.
      1. Plasser membrane(s) i en skuff med 1 x SSC + 0,1% SDS og riste forsiktig på 55-60 ° C i 10 min.
      2. Overføre til membrane(s) til et brett med 0.5 x SSC + 0,1% SDS og riste forsiktig på 55-60 ° C i 10 min.
      3. Sjekk radioaktiviteten på membrane(s) ved hjelp av en bærbar Geiger-teller for å bestemme om en tredje vaskemaskin er nødvendig.
    5. Utsett radioaktiviteten på membranen til X-ray filmer.
      1. Fjern væsken fra vasket membrane(s).
      2. Omgir membrane(s) med plast brytes og fikse den/dem i eksponering kassetten.
      3. Utsett membranen to ark X-ray film i et mørkt rom.
      4. Sett eksponering kassetten ved-80 ° C over natten eller lengre.
    6. Utvikle filmene for å visualisere resultatene. Vurdere om en tilsvarende ES klone er det ønskede ettall med målrettet rekombinasjon eller ikke, i henhold til størrelsen på DNA band oppdaget av sonder.
    7. Rehybridize samme membranen av en annen probe etter stripping av brukte sonden etter følgende: ta ut den brukte membranen, vaske det 1 x med ren H2O og deretter ruge det i striping løsning (55% formamide, 2% SSPE, 1% SDS, H 2 O) på 65 ° C med mild rister for 1-2 h.
  2. PCR identifikasjon
    1. Utføre PCR identifikasjon ønsket ES kloner i en 50-µL reaksjon løsning inkludert 5 µL av 10 x PCR buffer, 2 µL av 50 mM MgSO4, 1 µL av 10 mM dNTP, 1 µL av 20 µM frem primer, 1 µL av 20 µM omvendt primer , 1 µL av Hi-Fi-platina Taq, gDNAs (~ 100 ng), og H2O opptil 50 µL.
    2. Bruk følgende PCR reaksjon: en innledende rødsprit ved 94° C i 3 minutter, 30 sykluser av rødsprit 94° c for 30 s, annealing ved 60° C i 30 s og filtypen på 68° C i 132 s, og en siste trinnet av 68° C i 10 min.
    3. Analysere PCR produktene ved geleelektroforese i 1,0% agarose.
    4. Klone PCR fragmenter med forventede størrelsen i T-enkel vektor og rekkefølge for å bekrefte tilstedeværelse av en delvis sekvens av målet vektoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette papiret, er detaljert protokollen Southern blotting og PCR beskrevet, som brukes til å identifisere HR hendelsene skjedde i musen ES celler for generering av NM II genetisk erstatning musen modellene i ES celler-baserte HR-mediert targeting teknologi. Selv om Southern blotting og PCR, samt tradisjonelle genet målretting teknologi, har vært mye brukt i flere tiår, må bruk av dem planlegges nøye. Minst disse aspektene er må vurderes: lengden på lange og korte armer, posisjoner og lengden på sonder, egnet REs for kutte genomisk DNAs, og primerne for PCR, idet sammenfattet i figur 1, som er nyttig for påfølgende analyse. Som et viktig skritt i Southern blotting, forberedt og fordøyd genomisk DNAs er må skilles på DNA gel for påvisning av sonden. Fordi genomisk DNAs er skåret inn i en masse fragmenter med forskjellige lengder, vise de smøre-lignende statusen på DNA gel, antyder en fullstendig fordøyelsen av genomisk DNAs, som vist i figur 2. Som et siste skritt av Southern blotting vises signaler om en radioaktivitet-merket probe hybridizing med et mål DNA fragment på filmen, noe som gjenspeiler forekomsten av HR hendelser i ES kloner, dermed som angir om en ES-klone er det ønskede ettall. Ifølge predesign i denne studien har ES kloner med mutert allelet to distinkte størrelse band, mens vill-type ES kloner har bare ett band, antyder ønsket ES kloner er heterozygote (Figur 3). Forhold til prosedyren, og resultatene av Southern blotting, drift og resultater av PCR er enkle og direkte. Etter PCR reaksjonen, PCR produktene kan analyseres på DNA gel. Hvis PCR er bestemt og sekvensering klonet PCR produktene bekrefter tilstedeværelsen av en delvis sekvens av målet vektor som en neo-motstand-genet, samt genomisk områder som er like utenfor homologi armen, kan forekomsten av HR hendelser forventet og bekreftet (Figur 4).

Figure 1
Figur 1 : Målretting konstruksjoner. Dette er en skjematisk demonstrere generering av flere målretting konstruksjoner. Vill-type (WT) Myh9 gene allelet, gene målretting vektor, erstatning eksogene uttrykk cassette(s), og den resulterende muterte allele(s), samt sonder (LP, RP) for sørlige blot og primere (P1, P2) for PCR, vises og beskrevet tidligere 27. en pil på ekson 2 angir webområdet translasjonsforskning innvielse. Etter vellykket forekomsten av HR, erstatning uttrykk kassetten og neomycin motstand genet (Neor) settes bare 5' av initiering ATG codon. Derfor endogene Myh9 allelet avbrytes og slo i gene(s) er/er uttrykt i mutant celler og mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Fordøyd genomisk DNAs med Dra I. Genomic DNAs fra ES kloner målrettet med den konstruere erstatte NMHC II-A med II-B er fordøyd med Dra jeg og, deretter skilt på en agarose gel med geleelektroforese. En smear-lignende fordøyd gDNA er observert. C1 - C8 skildrer personlige ES kloner. En komplett fordøyelsen av gDNA produserer mye av DNA med en annen lengde, og dermed vise en smear-lignende bilde. Dette resultatet gjenspeiler også den gode kvaliteten på forberedt gDNAs og fullstendigheten av fordøyelsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Representant resultatene av Southern blotting. Disse skjermbildene viser en Southern blotting screening av genomisk DNAs fra ES kloner målrettet med Konstruer av erstatter NMHC II-A med II-AB, bruke venstre og høyre sonder. Det muterte allelet viser en 12,1 kb eller 6 kb bånd når venstre proben eller høyre sonde, henholdsvis, mens WT viser en 9,7 kb band. M: penn; PC1-PC5: positiv kloner; NC: negative klone. Størrelsen på Southern blotting band er også indikert. Alle prosedyrer for Southern blotting utføres strengt og spesifisitet av sonder er god nok; det skal ingen uspesifikke band forventer for forventet bandene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Representant resultatene av PCR. Dette panelet viser PCR identifikasjon av genomisk DNAs fra ES kloner målrettet med Konstruer av erstatter NMHC II-A med II-BA primer paret P1 + P2. Det muterte allelet gir et 2.1 kb band, mens WT allelet gir ingen band. M: penn; PC1-PC3: positiv kloner; NC: negative klone. Størrelsen på PCR bandet er også indikert. Siden primerne er utformet til bare oppdage det muterte allelet, gjenspeiler utseendet til et enkelt og forventet band spesifisiteten av primerne og den høye kvaliteten på de forberedt gDNAs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Foreløpig erstatte designer nucleases for genomet redigering fortsatt ikke ES cellebasert genet målretting teknologi på grunn av sine problemer av off-målet effekter, og vanskeligheter med å sette inn en lang DNA fragment30,31. Som de gylne metodene for å identifisere HR hendelsene skjedde i musen ES celler, gir denne rapporten detaljert protokollen Southern blotting og PCR for feltet. Vi validert påliteligheten av disse metodene ved å analysere individuelle kloner fra musen ES celler målrettet med en rekke konstruksjoner. Ønsket ES kloner identifisert av disse metodene hadde blitt brukt til å generere tilsvarende musen modeller27.

Selv om andre teknikker for screening av målrettet ES kloner har vært beskrevet19,32, metoder for Southern blotting og PCR helt kan ikke erstattes av etablerte de etter32, fordi disse første teknikker har en lenger anvendt historie og er allment akseptert og bekreftet av vitenskapelige samfunnet, utført av de fleste biologiske laboratorier, og er opprinnelsen til andre teknologier. Viktigst, er de gode resultatene for Southern blotting og PCR i identifikasjon av HR hendelser godt eksemplifisert i tidligere arbeid29. Resultatene fra Southern blotting viser flere unike funksjoner: blant de tilfeldig vist ES Klonene, over 90% av dem er ønsket seg ingen uspesifikke band oppdages og HR oppstod fortrinnsvis på en allelet av Myh9 genet. I mellomtiden bekrefter dataene fra PCR, sammen med sekvensering, at forekomsten av HR hendelser er stedsspesifikke og passer godt med de fra Southern blotting.

Ifølge vår praksis, bør faktorer vurderes når Southern blotting og PCR brukes til å identifisere HR hendelser i ES celler dermed få god og forventede resultater. Den første er lengden på homologi armene; Generelt vil øker homologi arm lengden forbedre effektiviteten av HR33. Men er dette ikke alltid tilfelle. På den ene siden, øke lengre armer vanskeligheten av manipulasjon; på den annen side, resulterte lengden på homologi armene (4 kb for venstre arm og 1,7 kb for den høyre armen) rapporterte her i høyeste HR frekvens oppnådd så langt blant lignende eksperimenter. I tillegg forenkler rimelig lang homologi armene identifikasjon av PCR. Andre er bruken av isogenic DNA for å forberede homologi armer og Southern blotting sonder34. Dette kan tilfredsstilles ved bestilling en BAC klone som inneholder regionen genet av interesse eller genomisk DNA fra cellene skal rettes. Tredje er valg av egnet REs for fordøye genomisk DNAs. Generelt er en RE eller kombinasjonen av to REs som kuttet det vill-type eller mutant allelet bare én eller to ganger rundt målretting regionen foretrukket; Videre resulterende større DNA fragmentet bør ikke overstige 15 kb og størrelsen forskjellen mellom forskjellige DNA fragmenter er over 2 kb. Disse kravene kan lette separasjon og identifikasjon av forventet band av Southern blotting. Fjerde er sonder og minst likheten med andre sekvenser i genomet. Vanligvis er lengden på sonder 500-1000 bp. Likhet med andre sekvenser i genomet kan analyseres med programmet NCBI BLAST. Videre, en programvare som brukes til design sonder for Southern blotting har vært beskrevet35. Den femte faktoren som skal vurderes er å bruke konvensjonelle metoder for å forberede genomisk DNA en styrke avkastning. Genomic DNAs forberedt fra en confluent godt av en 48-vel plate er vanligvis nok for minst to rundene av Southern blotting analyser. Som utformer primerne for PCR, er den beste strategien å bruke en primer tilstede på markøren i forbindelse med en primer utenfor målretting armene. I tillegg er sekvensering PCR produktene viktig for å bevise HR hendelser20,36. Spesielt kan ikke PCR-basert screening helt erstatte informasjonen fra Southern blotting, mens den effektivt kan redusere antall kloner evalueres.

Avslutningsvis er Southern blotting og PCR godt demonstrert metoder for screening ES kloner å identifisere HR-mediert genet målretting hendelser i ES celler. Men detaljert protokollen beskrevet her hovedsakelig fokusert på screening av ønsket NM II genetisk erstatning ES kloner, kan den brukes for genotyperingteknologi mus som genereres senere bruke positiv ES kloner. Det kan enkelt tilpasses til identifisering av HR hendelser i andre celletyper, for eksempel iPS celler eller somatiske celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet fikk støtte fra General programmet av National Natural Science Foundation i Kina (tilskudd nr. 31571432), den menneskelige provinsielle Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 2015JC3097) og den Research Foundation utdanning Bureau av Hunan Provinsen, Kina (Grant No. 15 K 054).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BAC CLONE BACPAC Resources Center (BPRC) bMQ-330E21
QIAGEN Large-Construct Kit QIAGEN 12462
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27104
QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit QIAGEN 12963
PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase Agilent 600382
T-easy vector Promega A1360
Nuclei Lysis Solution Promega A7941
Protein Precipitation Solution Promega A7951
DNA Denaturing Solution VWR 351-013-131
DNA Neutralizing Solution VWR 351-014-131
Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) VWR 27-9240-01
UltraPure SSC, 20x Thermo Fisher 15557036
UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Fisher 15593031
G418 Thermo Fisher 10131035
Salmon Sperm DNA Solution Thermo Fisher 15632011
Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity Thermo Fisher 11304029
Not I Thermo Scientific ER0592
Dra I Thermo Scientific ER0221
EcoR I Thermo Scientific ER0271
Ganciclovir Sigma G2536
Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits Fisher Scientific 09-301-188
[α32P]dCTP PerkinElmer NEG013H100UC
ProbeQuan G-50 Micro Columns GE Healthcare 28-9034-08
Hybrisol I Hybridization Solution Millipore S4040
Kodak X-Ray Film Z&Z Medical 844 5702

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
  2. Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
  3. Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
  4. Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
  5. Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
  6. Van, dW. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
  7. Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
  8. Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
  9. Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
  10. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
  11. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
  12. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
  13. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
  14. Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
  15. Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
  16. Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
  17. Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
  18. Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
  19. Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
  20. Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
  21. Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
  22. Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
  23. Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
  24. Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
  25. Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
  26. Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
  27. Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
  28. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
  29. Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
  30. Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
  31. Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
  32. Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
  33. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
  34. Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
  35. Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
  36. Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).

Tags

Genetikk problemet 141: homologe rekombinasjon gene målretting Southern blotting PCR mus embryonale stamceller sonde primer genetisk erstatning knockout/knock-inn Myh9 genet genomisk DNA
Identifikasjon av homologe rekombinasjon hendelser i mus embryonale stamceller Southern Blotting og polymerasekjedereaksjons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhou, D., Tan, L., Li, J., Liu, T.,… More

Zhou, D., Tan, L., Li, J., Liu, T., Hu, Y., Li, Y., Kawamoto, S., Liu, C., Guo, S., Wang, A. Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (141), e58467, doi:10.3791/58467 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter