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Genetics

Identification des événements de recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de transfert de Southern et la réaction en chaîne par polymérase

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58467
Automatic Translation
*1,2, *1, *3, 1, 1, 1, 4, 5, 3, 1
1Lab of Animal Models and Functional Genomics (LAMFG), The Key Laboratory of Animal Vaccine & Protein Engineering, College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University (HUNAU), 2Department of Pathology, Georgetown University Medical School, 3College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University (HUNAU), 4Lab of Molecular Cardiology (LMC), National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH), 5Transgenic Core, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH)
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole détaillé pour identifier les événements de recombinaison homologue qui s’est produite dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de Southern et/ou PCR. Cette méthode est illustrée par la génération de modèles murins non musculaires myosine II remplacement génétique à l’aide traditionnelle embryonnaire sur les cellules souches homologue induite par la recombinaison technologie de ciblage.

Abstract

Relative aux éditions d’effets hors cible et la difficulté d’insérer un long fragment d’ADN dans l’application des nucléases concepteur pour tige de montage, embryonnaires génome technologie de ciblage de gènes cellulaires (ES) n’a pas ces défauts et est largement permet de modifier le génome de l’animal/souris allant des importantes destructions/insertions aux substitutions nucléotidiques. Notamment, identifier les événements de recombinaison homologue (HR) relativement peu nécessaires à l’obtention désiré clones d’ES est une étape clé, qui exige des méthodes exactes et fiables. Transfert de Southern et/ou PCR classique est souvent utilisé à cet effet. Nous décrivons ici les modalités d’utilisation de ces deux méthodes pour identifier des événements RH qui s’est produite dans les cellules ES de souris dont le gène Myh9 endogène est destiné à être perturbé et remplacé par ADNc codant les autre chaîne lourde de myosine non musculaire IIs (IIs NMHC). L’ensemble de la procédure de transfert de Southern comprend la construction de ciblage vecteur (s), électroporation, sélection de médicaments, l’expansion et le stockage de cellules d’ES/clones, la préparation, la digestion et transfert de l’ADN génomique (ADNg), l’hybridation et lavage des sondes et une étape finale d’autoradiographie sur les films radiographiques. PCR peut être effectuée directement avec ADNg préparé et dilué. Pour un résultat idéal, les sondes et les enzymes de restriction (RE) sites de coupe pour le transfert de Southern et les amorces pour la PCR doivent être soigneusement planifiées. Si l’exécution du transfert de Southern est longues et fastidieuses et PCR résultats faux positifs, l’identification correcte de Southern et le dépistage rapide par PCR permettent l’application seule ou combinée de ces méthodes décrites dans cet article d’être largement utilisé et consulté par la plupart des laboratoires dans la détermination des génotypes des cellules ES et génétiquement modifiés animaux.

Introduction

La technologie de ciblage par HR dans des cellules ES génique fournit un outil puissant pour disséquer les conséquences cellulaires des mutations génétiques spécifiques1,2. L’importance et la signification de cette technologie sont reflètent dans sa reconnaissance par le 2007 Prix Nobel de physiologie ou médecine3,4; pendant ce temps, il représente l’avènement de l’ère moderne du génie génétique5. Ciblage par HR génique peut être utilisé pour pratiquement n’importe quelle modification allant des mutations ponctuelles aux grandes réarrangements chromosomiques dans le génome de souris ES cellules6,7de l’ingénieur. Il est bien connu que, avant l’émergence des outils de montage de ce que l'on appelle génome, la génération d’un gène de souris knock-out a nécessité l’application de la technologie de ciblage de gène dans ES cellules8,9,10. Durant les deux dernières décennies, plus de 5 000 souris gène-cible ont été produites par cette approche pour la modélisation des maladies humaines ou en étudiant les gènes fonctions11. Un effort de Génome-large knockout a été établi pour la distribution des vecteurs de ciblage de gènes ciblés clones de cellules d’ES et souris vivantes à la communauté scientifique2,12,13,14 , 15. sans aucun doute, ES cellulaire induite par le HR-ciblage de gènes technologie a grandement contribué à améliorer notre compréhension des fonctions des gènes a joué dans un contexte physiologique ou pathologique.

Parce que h est un événement relativement rare en mammifères cellules16,17, l’important et l’étape suivante après ciblage de gènes dans des cellules d’ES est d’analyser les nombreuses colonies ES pour identifier quelques clones présentant des mutations résultant de HR avec le ciblage vecteur18. Les méthodes or pour identifier les événements HR comprennent le transfert de Southern et PCR19,20. Les avantages des approches comprennent que Southern peut identifier correctement ciblées ES clones et permet aux chercheurs d’analyser la structure de l’épreuve de gène-cible, comme une vérification d’une insertion de copie unique de la construction, alors qu’un Stratégie axée sur la PCR permet un dépistage plus rapid pour HR événements21,22. Bien que ces méthodes ont des inconvénients, tels que qu’ils prennent du temps et peuvent avoir faux positifs, l’utilisation de combinatoire d’eux est largement acceptés et appliqué par la plupart des laboratoires à identifier les événements RH, notamment dans les cellules ES, pour générer des organismes génétiquement modifiés animaux.

Trois isoformes de myosine non musculaire II (NM II) chez les mammifères, composées chacune de deux IIs de HCNM identiques qui sont codés par trois gènes différents (nommée Myh9, Myh10 et Myh14) et deux paires de chaînes légères, sont dénommés NM II-A, II B et II-C23. Des études antérieures ont indiqué qu’au moins les isoformes de NM II-A et II B sont essentiels pour le développement de la souris car l’ablation in vivo de ces isoformes se traduit par une létalité embryonnaire24,25,26. Pour contourner ce problème et obtenir de nouvelles idées dans les fonctions de l’isoforme spécifique de NM II-A et II B dans les derniers stades de développement chez la souris, un remplacement génétique stratégie technologie ES basés sur les cellules induite par le HR-ciblage de gènes a été adoptée à générer une série de souris modèles27. Au cours de l’identifiant les clones d’ES désirés, transfert de Southern et de méthodes PCR ont été utilisés, et ceux-ci s’est avérée efficace et fiable27,28.

Cet article a l’intention de fournir une description détaillée du sud de buvard et PCR, y compris la conception du ciblage vecteur (s), sondes et d’apprêts et l’exécution d’expériences, ainsi que l’analyse des résultats illustrée en identifiant événement RH présence dans les cellules ES pour la création de souris NM II remplacement génétique modèles et données représentatives. Les protocoles de ces deux méthodes présentées ici peuvent aussi être prises pour identifier le génotype des cellules génétiquement modifiées ou des animaux.

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Protocol

1. conception du ciblage des exigences, sondes pour Southern Blot et amorces pour la PCR

  1. Sélectionnez le premier exon codante (exons 2) du gène Myh9 de perturbation ou d’insertion dans l’application de knockout/knock-in rapporté ici.
  2. Récupérer les 5-Ko en amont et 5-Ko en aval des séquences d’ADN qui entourent l’exon Myh9 2 sur le site genome.ucsc.edu .
  3. Analyser les profils de restriction digestion d’enzymes (REs) 1 – 2 coupes dans cette région de 10 kb en utilisant le logiciel pDRAW pour déterminer vite adapté à digérer l’ADN génomique pour le transfert de Southern.
    NOTE : Dra je répond à cette exigence et est sélectionné pour le but.
  4. Sélectionnez un fragment de 4Ko immédiatement en amont de l’exon Myh9 2 sous le bras gauche d’homologie (LHA) et une séquence en aval immédiat du fragment 1,7 Ko comme le bras droit d’homologie (RHA) ; Choisissez un fragment de 1Ko 5' en amont de la LHA comme la sonde gauche (LP) pour le transfert de Southern et un fragment de 1,2 kb 3' en aval de l’ors que la sonde droite (RP), basé sur l’analyse qui précède.
  5. Utilisez un programme primer3 pour concevoir les amorces et inverses pour amplifier ces quatre fragments d’ADN par PCR. Concevoir une paire d’amorces avec l’apprêt avant résidé près du terminal 3' d’un gène de résistance sélection marqueur neomyocin (P1) et l’amorce de marche arrière situé juste en dehors de l’ors (P2).
    Remarque : Cette paire d’amorces serviront pour l’identification des clones d’ES ciblés par PCR29.
  6. Trouver un clone de BAC 129Sv couvrant le locus du gène Myh9 la souris en visitant le site Web de bacpac.chori.org (note : ADN isogénique est préférable). Isoler l’ADN de BAC à l’aide d’un kit adapté pour la purification de gros morceaux d’ADN suivant les instructions fournies par le fabricant.
    Remarque : L’ADN purifié BAC servira comme modèle pour l’amplification PCR.
  7. Dessiner une représentation schématique du ciblage des constructions, sondes et amorces de résumer ces informations.

2. génération du ciblage des exigences et des sondes pour Southern Blot et la préparation des amorces de PCR

  1. Commandez les amorces PCR décrites ci-dessus et les dissoudre dans une concentration de 20 µM.
  2. Amplifier les bras de l’homologie et les sondes par PCR dans une solution de réaction dont 1 µL µL avant et 1 arrière des amorces, 1 µL d’ADN (50 ng) comme le modèle, 5 µL de tampon de Pfu et 1 µL de Pfu ultra comme l’ADN polymérase , et H2O à 50 µL. effectuer l’ACP dans une machine PCR dans les conditions suivantes : 95 ° C pendant 3 min ; 95 ° C pendant 30 s ; 60 ° C pendant 30 s ; 72 ° C et 1 Ko/min ; 30 cycles ; Enfin, 72 ° C pendant 10 min.
  3. Purifier les produits PCR à l’aide d’un kit de nettoyage PCR selon le protocole prévu par le fabricant et éluer les fragments d’ADN avec 40 µL d’H2O. Digest les produits PCR purifiés avec REs prédéfinis dans une solution de réaction contenant 5 µL de tampon de x 10 pour REs , 2,5 µL de RE1 et 2,5 µL de RE2 et l’ADN éluée, à 37 ° C pendant 2 h. exécuter un gel 1 % d’ADN pour séparer des bandes d’ADN cible, le gel contenant l’ADN sous la lumière UV, cible de l’accise purifier les fragments d’ADN cible du gel en utilisant un ADN gel extraction kit selon au protocole fourni par le fabricant et éluer les fragments d’ADN avec 40 µL d’H2O.
  4. Cloner le bras de l’homologie et remplacement expression barres dans le vecteur mpNTKV-LoxP selon l’ordre de l’amplifié et purifiée RHA, LHA et remplacement expression barres libéré des autres vecteurs pour obtenir le ciblage final exigences. Cloner des fragments d’ADN des sondes amplifiés et purifiés dans le vecteur T-facile.
  5. Confirmer les séquences nucléotidiques de tous les fragments d’ADN clonés par séquençage27,28.

3. préparation du ciblage des exigences, l’électroporation des cellules d’ES et l’Amplification des Clones d’ES

  1. Préparer chaque construction de ciblage en utilisant un plasmide maxiprep kit selon le protocole prévu par le fabricant. Linéariser chaque plasmide construct de digérer il avec pas j’ai une réaction de 400 µL dont 40 µL de tampon de 10 x pour pas je, 10 µL de pas je, 100 µg d’ADN et H2O jusqu'à 400 µL, à 37 ° C durant la nuit.
  2. Purifier les exigences de ciblage linéarisé.
    1. Extraire la solution digérée réaction 1 x avec un volume égal de phénol : chloroforme : isoamylique alcool (25:24:1) et centrifuger à une force de 2 000 x g pendant 10 min.
    2. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL, précipiter l’ADN à l’aide de 2. 5 x 0,1 x 3m et l’éthanol acétate de sodium (pH 5,2) (rapport de volume) et centrifuger à une force de 2 000 x g pendant 10 min.
    3. Retirer le surnageant, lavage l’ADN 1 x 1 ml d’éthanol 75 % de granule et centrifuger à une force de 2 000 x g pendant 5 min.
    4. Retirez le surnageant et sécher le culot d’ADN pendant 5 min.
    5. Dissoudre le culot d’ADN linéarisé dans un tampon Tris-EDTA (TE) stérile à une concentration finale de 1 µg/µL.
  3. Mélanger 50 µg de chaque construction de ciblage linéarisée avec 0,5 x 107 ES cellules. Effectuer l’électroporation à 320 V et 250 µF. plaque les cellules électroporation ES sur vaisselle avec neo-résistant aux mangeoires MEF.
  4. Après 24h, basculez vers un milieu cellulaire ES avec 400 µg/mL G418 et 200µm ganciclovir et continuer à la culture pendant 4 à 5 jours avec une variation moyenne quotidienne. Ramasser pharmacorésistant ES clones en plaques de 48 puits.
    Remarque : Normalement, quatre plaques de 48 puits sont utilisés par construction.
  5. Dupliquer les plaques de 48 puits.
    Remarque : Un jeu de plaques est cryopréservé, et l’autre jeu est utilisé pour la préparation d’ADN génomique.

4. préparation d’ADN génomique et de la Digestion avec Restriction Enzyme(s)

  1. Préparer l’ADNg de cellules d’ES à l’aide d’une trousse commerciale (kit de purification de l’ADN génomique) avec des modifications mineures.
    1. Retirez le support de la culture de cellules d’ES et ajouter 500 µL de solution de lyse de noyaux, notamment RNaseA, directement dans les puits à lyser les cellules.
      NOTE : Le lysat cellulaire peut être conservé à-80 ° C ou traitée immédiatement.
    2. Pipette de haut en bas plusieurs fois de lyser les cellules entièrement et transférez-les sur un tube propre 1,5 mL.
    3. Ajouter un tiers du volume de la solution de précipitation de protéine dans le tube de 1,5 mL, vortex vigoureusement pendant 20 s, refroidir les échantillons sur la glace pendant 5 min et puis, centrifuger à une force de 2 000 x g pendant 5 min. transfert du surnageant à une autre propre 1,5 mL tube contai Ning un volume égal d’isopropanol ; mélanger délicatement la solution. (Notez que les blancs filiformes brins soient visibles en ce moment). Centrifuger à une force de 2 000 x g pendant 1 minute ; Ensuite, jeter le surnageant.
    4. Laver le culot ADNg avec 1 mL d’éthanol à 70 % à la température ambiante, centrifuger à une force de 2 000 x g pendant 1 min et aspirer le surnageant soigneusement puis, sécher le culot ADNg pendant 3 min.
    5. Dissoudre l’ADNg avec 100 µL de solution de réhydratation d’ADN et, ensuite, incuber à 65 ° C pendant 1 h ou à 4 ° C durant la nuit.
    6. Magasin l’ADNg 2 – 8 ° c.
  2. Digest de l’ADNg avec préconçus RE Dra I. définir une réaction de digestion 30 µL en mélangeant 3 µL de 10 x tampon pour Dra I, 3 µL de Dra I, 10 µg d’ADNg/échantillon et H2O jusqu'à 30 µL et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
  3. Vérifier la conformité de la digestion en gel d’ADN, analyse 5 µL de la réaction digérée et ensuite, ajouter les 3 µL de 10 x tampon de chargement d’ADN pour l’étape suivante.

5. transfert de Southern et l’Identification de la PCR

  1. Southern blot dépistage
    1. Séparer l’ADNg digérée par électrophorèse et transfert sur une membrane.
      1. Préparer un gel d’électrophorèse sur agarose à 1 % avec du bromure d’éthidium (EB), charger les échantillons à l’étape 4.3 et une échelle de 1 Ko et exécutez le gel avec une tension faible (30 à 40 V) du jour au lendemain.
      2. Retirez le gel et prendre une photo avec un système d’imagerie gel ADN après électrophorèse. Vérifier si l’ADNg digérées et séparés frottis comme image s’affiche.
      3. Faire tremper le gel dans un plateau avec 0,2 N HCl solution et secouez-le doucement pendant 20 min à température ambiante.
      4. Transférer le gel dans la solution de dénaturation de l’ADN et secouez-le doucement pendant 20 min à température ambiante.
      5. Mettez le gel dans la solution de neutralisation de l’ADN et secouez-le doucement pendant 20 min à température ambiante.
        Remarque : Le gel est sujets à la rupture après cette étape, donc il doit être manipulé avec soin.
      6. Utiliser le système de transfert à la baisse rapide de transférer l’ADN du gel à la membrane. Assembler les TurboBlotter et le buvard pile conformément aux instructions fournies par le fabricant.
        Remarque : x 10 ou 20 solution saline-sodium citrate (SSC) de x est utilisé comme un tampon de transfert. En général, 3 h de transfert est suffisant pour transférer des 95 % d’ADNg gel à membrane ; Cependant, plus de temps de transfert est inoffensif.
      7. Retirez la membrane et lavez-le avec 2 x SSC pendant 1 min, absorber le liquide avec les tissus et réticuler puis l’ADN avec la membrane à l’aide d’une RETICULATION UV.
        Remarque : La membrane peut être stockée à 4 ° C pendant une semaine.
    2. Étiqueter les sondes d’ADN à la radioactivité.
      1. Purifier les plasmides de sonde à l’aide d’un kit de miniprep selon le protocole prévu par le fabricant.
      2. Communiqué de l’ADN fragments des sondes du vecteur plasmidique par EcoR I digestion dans une solution de réaction dont 5 µL de tampon pour EcoR I, 2 µL de EcoR j’ai enzyme, 20 µg d’ADN plasmidique et H2O à 50 µL , pendant 2 h.
      3. Exécuter un 1 % ADN gel pour séparer les fragments d’ADN de sonde du vecteur et de purifier les fragments d’ADN des sondes avec un kit d’extraction de gel ADN selon le protocole prévu par le fabricant.
      4. À l’aide de 1 µL de solution d’ADN, mesurer la concentration d’ADN de fragments d’ADN de la sonde avec un spectrophotomètre sur une longueur d’onde de 260/280 nm.
      5. Préparer 40-ng de sonde ADN dans un tube de 1,5 mL avec 45 µL de tampon TE, faire bouillir pendant 3 min, tourner brièvement et puis, placer les tubes sur la glace pendant 2 min.
      6. Ajouter l’ADN dénaturé par la chaleur de sonde dans le tube contenant le prêt-à-go-marquage ADN perles (-dCTP), pipette de haut en bas pour mélanger, ajouter 5 µL de dCTP [α32P] et ensuite, incuber à 37 ° C pendant 15 min.
      7. Purifier les sondes marquées à l’aide de microcolumns de G-50 conformément aux instructions fournies par le fabricant et, ensuite, mesurer la radioactivité par un compteur à scintillation (facultatif).
    3. S’hybrident à l’eau avec des sondes marquées.
      1. Hatuement de la membrane.
        1. Préchauffer la solution d’hybridation à 42 ° C pendant 30 min. mélanger 20 mL de solution d’hybridation préchauffée avec 200 µg de sperme de saumon bouilli ADN dans un tube de 50 mL.
        2. Placer la membrane dans le tube de l’hybridation. Ajouter la mélange de la solution pré-hybridation dans le tube de l’hybridation. Placez-le dans le four à hybridation (ensemble de roulement et la température à 42 ° C) et laissez la prehybridization procéder pendant 30 min.
      2. Hybrider la membrane avec les sondes marquées.
        1. Retirez le tube d’hybridation et verser la solution de pré-hybridation dans un tube de 50 mL ; Ajouter la sonde dénaturée (chauffée à 100 ° C pendant 3 min) de l’étape 5.1.2.7 à ce tube et mélanger doucement.
          Remarque : Réduire les bulles d’inducteurs.
        2. Solution mixte de retour dans le tube d’hybridation et d’effectuer l’hybridation à 42 ° C pendant la nuit.
    4. Laver à l’eau pour retirer les sondes pures.
      1. Placer l’eau dans un bac avec 1 x SSC + 0.1 % SDS et agiter doucement à 55-60 ° C pendant 10 min.
      2. Transférer de l’eau sur un plateau avec 0,5 x SSC + SDS 0,1 % et agiter doucement à 55-60 ° C pendant 10 min.
      3. Vérifier la radioactivité sur l’eau en utilisant un compteur Geiger portable pour décider si un troisième lavage est nécessaire.
    5. Exposer la radioactivité sur la membrane pour films radiographiques.
      1. Retirer le liquide de l’eau de lavage.
      2. Enveloppent l’eau d’une pellicule plastique et Difficulté/eux dans la cassette de l’exposition.
      3. Exposer la membrane à deux feuilles de film radiographique dans une pièce sombre.
      4. Placez la cassette de l’exposition à-80 ° C une nuit ou plus.
    6. Développer les films afin de visualiser les résultats. Évaluer si un clone de ES correspondant est celle désirée avec la recombinaison ciblée ou non, selon la taille des bandes ADN détectés par les sondes.
    7. Rehybridize la membrane même par une autre sonde après dépouillant la sonde utilisée selon la procédure suivante : Retirez la membrane utilisée, le laver nettoyer H2O 1 x avec et puis, il incuber dans une solution de répartition (55 % formamide, 2 % PESS, 1 % SDS, H 2 O) à 65 ° C sous agitation douce pendant 1 à 2 h.
  2. Identification de la PCR
    1. Effectuer l’identification PCR des clones ES désirés dans une solution de réaction de 50 µL dont 5 µL de tampon de x PCR 10, 2 µL de 50 mM MgSO4, 1 µL de dNTP 10 mM, 1 µL d’apprêt avant de 20 µM, 1 µL d’apprêt inverse de 20 µM , 1 µL de haute fidélité platine Taq, ADNg (~ 100 ng) et H2O à 50 µL.
    2. Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : une dénaturation initiale 94° c pendant 3 min, 30 cycles de dénaturation à 94° C pendant 30 s, recuit à 60° C pendant 30 s et une extension à 68° C pendant 132 s et une dernière étape de 68° C pendant 10 min.
    3. Analyser les produits PCR par électrophorèse en gel d’agarose de 1,0 %.
    4. Cloner des fragments PCR avec leur taille attendue dans le vecteur T-facile et la séquence de confirmer la présence d’une séquence partielle du vecteur cible.

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Representative Results

Dans cet article, un protocole détaillé de Southern et PCR est décrite, qui est utilisé pour identifier des événements RH qui s’est produite dans les cellules ES de souris pour la génération de modèles de souris de remplacement génétique NM II, à l’aide de ES axée sur les cellules HR-mediated technologie de ciblage. Bien que le transfert de Southern et PCR, ainsi que technologie de ciblage de gène traditionnelle, ont été largement utilisée depuis plusieurs décennies, l’application réussie d'entre eux doit être planifiée avec soin. Au moins ces aspects sont tenus à prendre en considération : la longueur des bras longs et courts, les positions et la longueur des sondes, les REs adaptés pour la découpe de l’ADN génomique et les amorces pour la PCR, telles que résumées dans la Figure 1, qui est utile pour analyse ultérieure. Comme une étape importante du transfert de Southern, l’ADN génomique préparées et digérées sont tenus d’être séparés sur gel d’ADN pour la détection par la sonde. Parce que l’ADN génomique est découpées dans un grand nombre de fragments de longueurs différentes, ils affichent l’État frottis-comme sur le gel de l’ADN, ce qui suggère une digestion complète de l’ADN génomique, comme il est indiqué dans la Figure 2. Comme dernière étape du transfert de Southern, les signaux d’une sonde marquée par radioactivité s’hybridant avec un fragment d’ADN cible apparaissent sur le film, qui reflètent la survenue d’événements RH dans les clones d’ES, ce qui indique si un clone d’ES est celle désirée. Selon le predesign dans cette étude, des clones d’ES avec l’allèle muté ont deux bandes de taille distinctes, tandis que sauvage ES clones ont seulement une seule bande, ce qui suggère les clones d’ES désirés sont hétérozygotes (Figure 3). Relative à la procédure et les résultats de transfert de Southern, le fonctionnement et les résultats de la PCR sont simples et directs. La suite de la réaction PCR, les produits PCR peuvent être analysés sur le gel de l’ADN. Si les bandes PCR sont spécifiques et séquençage des produits PCR clonés confirme la présence d’une séquence partielle de vecteur de cible comme un gène de résistance au neo, ainsi que des régions génomiques qui sont juste à l’extérieur du bras d’homologie, la survenue d’événements RH peut être attendus et vérifiés (Figure 4).

Figure 1
Figure 1 : Ciblage des constructions. Il s’agit d’un schéma montrant la génération de multiples constructions de ciblage. L’allèle sauvage de gène Myh9 (WT), vecteur de ciblage de gène, barres de remplacement d’expression exogène et l’allele(s) muté qui en résultent, ainsi que les sondes (LP, RP) pour Southern et les amorces (P1, P2) pour PCR, sont montrés et décrit plus haut 27. une flèche sur l’exon 2 indique le site de déclenchement de la traduction. Après l’événement réussi des RH, la cassette d’expression de remplacement et le gène de résistance à la néomycine (Neor) sont insérés à 5 minutes du codon initiateur ATG. Par conséquent, l’allèle Myh9 endogène est perturbé et frappa dans l’ou les gènes est/sont exprimé dans les cellules mutantes et souris. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Digéré l’ADN génomique avec Dra I. L’ADN génomique de clones d’ES ciblés par la construction remplaçant HCNM II-A II-B est digérés avec Dra I et, ensuite, séparés sur gel d’agarose par électrophorèse. On observe un ADNg digérée frottis ressemblant. C1 - C8 dépeignent des clones d’ES. Une digestion complète d’ADNg produit beaucoup de fragments d’ADN avec une longueur différente, affichant ainsi une image de frottis-like. Ce résultat reflète également la bonne qualité d’ADNg préparés et l’exhaustivité de la digestion. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Les résultats représentatifs du transfert de Southern. Ces panneaux montrent une projection Southern blot de l’ADN génomique de clones d’ES ciblés par la construction du remplacement de HCNM II-a par II-AB, en utilisant les sondes de gauche et de droite. L’allèle muté montre une bande 12,1 kb ou Ko 6 lorsque la sonde gauche ou droite sert, respectivement, tandis que le WT montre une bande de 9,7 kb. M: marqueur ; PC1-PC5 : clones positifs ; NC : clone négatif. Les tailles des bandes Southern blot sont également indiqués. Toutes les procédures de transfert de Southern sont strictement effectués et la spécificité des sondes est suffisante ; il ne devrait y avoir aucun non-spécifique à bandes s’attendre pour les bandes attendus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Des résultats représentatifs de la RCP. Ce panneau indique l’identification de PCR de l’ADN génomique de clones d’ES ciblés par la construction de remplacement HCNM II-A-BA II à l’aide de la paire d’amorces P1 + P2. L’allèle muté donne une bande 2,1 Ko, alors que l’allèle WT rendements sans bande. M: marqueur ; PC1-PC3 : clones positifs ; NC : clone négatif. La taille de la bande PCR est également indiquée. Étant donné que les amorces sont conçus pour détecter uniquement l’allèle muté, l’apparition d’une bande unique et attendue reflète la spécificité des amorces et la qualité de l’ADNg préparés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Actuellement, nucléases concepteur pour l’édition de génome toujours ne peut pas remplacer ES basés sur les cellules-ciblage de gènes technologie en raison de ses problèmes d’effets hors cible et la difficulté en insérant un long DNA fragment30,31. Comme les méthodes or pour identifier les événements RH qui s’est produite dans les cellules de souris ES, ce rapport fournit un protocole détaillé de Southern et PCR pour le champ. Nous avons validé la fiabilité de ces méthodes en analysant différents clones de souris ES cellules ciblées avec une série de constructions. Les clones d’ES désirés identifiés par ces méthodes avaient été utilisées avec succès pour générer des correspondants souris modèles27.

Bien que les autres techniques de dépistage des clones d’ES ciblés ont été décrits19,32, les méthodes de transfert de Southern et PCR ne peut pas être complètement remplacée par ceux qui sont établis par la suite32, parce que ces initiales techniques ont des antécédents plus appliquée et sont largement acceptées et confirment par la société scientifique, interprétée par la plupart des laboratoires biologiques et sont à l’origine d’autres technologies. Ce qui est important, la bonne performance de Southern et PCR dans l’identification des événements RH est bien illustrée dans le précédent travail29. Les résultats provenant de Southern indiquent plusieurs caractéristiques uniques : parmi les clones d’ES sélectionnés au hasard, plus de 90 % d'entre eux sont ceux souhaités, sans bandes non spécifiques sont détectés et le HR est survenue préférentiellement sur un allèle du gène Myh9. Pendant ce temps, les données de PCR et séquençage, confirment que la survenue d’événements RH est spécifique au site et correspondent bien à celles du transfert de Southern.

Plusieurs facteurs doivent être considérés, selon notre pratique, lorsque le transfert de Southern et PCR sont utilisés pour identifier des événements RH dans les cellules ES, ainsi obtenir des résultats satisfaisants attendus. Le premier est la longueur des bras d’homologie ; en général, augmenter la longueur de bras d’homologie permettra d’améliorer l’efficacité des ressources humaines33. Cependant, ce n’est pas toujours le cas. D’une part, les bras plus longs augmentent la difficulté de manipulation ; en revanche, la longueur des bras d’homologie (4 Ko pour le bras gauche et 1,7 kb pour le bras droit) rapportée ici a abouti à la plus haute fréquence de HR obtenue à ce jour parmi des expériences similaires. En outre, une longueur raisonnable des bras de l’homologie facilite l’identification par PCR. Le second est l’utilisation de l’ADN isogénique pour préparer le bras de l’homologie et Southern blot Sondes34. Cela peut être satisfaite en ordonnant un clone BAC contenant la région de la gène d’intérêt ou en utilisant l’ADN génomique des cellules destinées à viser. La troisième est la sélection de REs convenables pour digérer l’ADN génomique. En général, un RE ou la combinaison des deux REs qui coupent l’allèle sauvage ou mutant seulement une ou deux fois autour de la région de ciblage sont préférés ; en outre, le fragment d’ADN plus grand qui en résulte ne doit pas dépasser 15 Ko et la différence de taille entre les fragments d’ADN distinctes n’est plus de 2 Ko. Ces exigences peuvent faciliter la séparation et l’identification des groupes attendus par transfert de Southern. La quatrième est la longueur de la sonde et la moindre similitude avec d’autres séquences dans le génome. En règle générale, la longueur des sondes est 500 – 1 000 bp. La similitude avec d’autres séquences du génome peut être analysée avec le programme de NCBI BLAST. En outre, un logiciel utilisé pour la conception des sondes pour le transfert de Southern a été décrit35. Le cinquième facteur à prendre en considération est d’utiliser les méthodes classiques pour préparer l’ADN génomique pour un rendement de renforcement. ADN génomique préparée à partir d’un puits confluent d’une plaque de 48 puits est généralement assez au moins deux séries de Southern blot analyses. Quant à concevoir les amorces pour la PCR, la meilleure stratégie est d’utiliser une amorce présente sur le marqueur de sélection en conjonction avec un apprêt à l’extérieur des bras de ciblage. En outre, séquençage des produits PCR est important pour démontrer la HR événements20,36. Notamment, dépistage basé sur la PCR ne peut pas remplacer complètement l’information obtenue par le biais de transfert de Southern, alors qu’il peut effectivement réduire le nombre de clones à évaluer.

En conclusion, transfert de Southern et PCR sont bien démontrés méthodes de dépistage des clones d’ES pour identifier HR-mediated des événements de ciblage de gène dans les cellules ES. Bien que le protocole détaillé décrit ici principalement axée sur le contrôle des clones de remplacement génétique ES désirés NM II, il peut être utilisé pour les souris de génotypage qui sont générés par la suite en utilisant les clones d’ES positifs. Il peut être facilement adapté à l’identification des événements RH dans d’autres types de cellules, telles que les cellules iPS ou des cellules somatiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail ont bénéficié du programme général de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions no 31571432), l’humain Provincial Fondation sciences naturelles de Chine (Grant No. 2015JC3097) et la recherche Fondation d’éducation Bureau du Hunan Province, Chine (subvention no 15 K 054).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BAC CLONE BACPAC Resources Center (BPRC) bMQ-330E21
QIAGEN Large-Construct Kit QIAGEN 12462
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27104
QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit QIAGEN 12963
PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase Agilent 600382
T-easy vector Promega A1360
Nuclei Lysis Solution Promega A7941
Protein Precipitation Solution Promega A7951
DNA Denaturing Solution VWR 351-013-131
DNA Neutralizing Solution VWR 351-014-131
Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) VWR 27-9240-01
UltraPure SSC, 20x Thermo Fisher 15557036
UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Fisher 15593031
G418 Thermo Fisher 10131035
Salmon Sperm DNA Solution Thermo Fisher 15632011
Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity Thermo Fisher 11304029
Not I Thermo Scientific ER0592
Dra I Thermo Scientific ER0221
EcoR I Thermo Scientific ER0271
Ganciclovir Sigma G2536
Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits Fisher Scientific 09-301-188
[α32P]dCTP PerkinElmer NEG013H100UC
ProbeQuan G-50 Micro Columns GE Healthcare 28-9034-08
Hybrisol I Hybridization Solution Millipore S4040
Kodak X-Ray Film Z&Z Medical 844 5702

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La recombinaison génétique numéro 141 gène cible Southern blot PCR souris les cellules souches embryonnaires sonde apprêt remplacement génétique knockout/knock-in gène Myh9 ADN génomique
Identification des événements de recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de transfert de Southern et la réaction en chaîne par polymérase
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Zhou, D., Tan, L., Li, J., Liu, T., Hu, Y., Li, Y., Kawamoto, S., Liu, C., Guo, S., Wang, A. Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (141), e58467, doi:10.3791/58467 (2018).

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