Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att identifiera homolog rekombination händelser som inträffat i mus embryonala stamceller använder södra blotting eller PCR. Denna metod exemplifieras av generationen av nonmuscle myosin II genetisk utbyte musmodeller med traditionella embryonala stamceller-baserade homolog rekombination-medierad inriktningsteknik.
Abstract
I förhållande till frågor om off-target effekter och svårigheten att infoga en lång DNA-fragment i tillämpningen av designer nukleaser för genomet redigering, embryonala stamceller (ES) cell-baserad gen-inriktning teknik har inte dessa brister och är allmänt används för att ändra djur/mus genomet alltifrån stora borttagningar/infogningar till enda nukleotid substitutioner. Noterbart önskad att identifiera de relativt få homolog rekombination (HR) händelserna som krävs för att uppnå ES kloner är ett viktigt steg, som kräver korrekta och tillförlitliga metoder. Södra blotting eller konventionella PCR utnyttjas ofta för detta ändamål. Här beskriver vi de detaljerade förfarandena för att använda dessa två metoder för att identifiera HR händelser som inträffat i mus ES-celler där den endogena Myh9-gen är avsett att vara störd och ersättas med cDNAs kodning andra nonmuscle myosin heavy chain IIs (NMHC IIs). Hela förfarandet av södra blotting omfattar byggandet av inriktade vector(s), elektroporation, drog urval, expansion och lagring av ES celler/kloner, förberedelse, matsmältningen och blotting av genomisk DNA (gDNA), hybridisering och tvätt av probe(s) och ett sista steg av autoradiografi med röntgen-filmerna. PCR kan utföras direkt med beredda och utspädda gDNA. För att få perfekt resultat, bör de sonder och restriktionsenzym (RE) skära platser för södra blotting och primers för PCR planeras noggrant. Även utförandet av södra blotting är tidskrävande och arbetsintensiva och PCR-resultaten har falska positiva, genom en korrekt identifiering av södra blotting och snabb screening av PCR tillåta programmet ensam eller i kombination av dessa metoder som beskrivs i denna uppsats att allmänt användas och konsulteras av de flesta labb i identifiering av genotyper av ES-celler och genetiskt modifierade djur.
Introduction
Tekniken för genmodifiering av HR i murina ES-celler erbjuder ett kraftfullt verktyg för att dissekera cellulära konsekvenserna av specifika genetiska mutationer1,2. Vikten och betydelsen av denna teknik reflekteras i dess erkännande av 2007 Nobelpriset i fysiologi eller medicin3,4. under tiden representerar den tillkomsten av den moderna eran av genen engineering5. Genmodifiering genom HR kan utnyttjas för att ingenjör valfri ändring alltifrån punktmutationer till stora kromosomala omflyttningar i genomet av mus ES celler6,7. Det är väl känt att, före uppkomsten av så kallade genomet redigeringsverktyg, generering av en gen knockoutmus krävs tillämpningen av gen-inriktning teknik i ES celler8,9,10. Under de senaste två decennierna producerades mer än 5.000 gen-riktade möss av detta tillvägagångssätt för modellering mänskliga sjukdomar eller studera gen funktioner11. En genome-wide knockout ansträngning har fastställts för att distribuera gen-targeting vektorer, riktade ES cell kloner och levande möss till forskarsamhället2,12,13,14 , 15. utan tvekan ES cellbaserade HR-medierad gen-inriktning teknik kraftigt har avancerad vår förståelse av funktionerna hos gener som spelade i fysiologiska eller patologiska sammanhang.
Eftersom HR är en relativt ovanlig händelse i däggdjurs celler16,17, den viktiga och nästa steg efter är genen inriktning i murina ES-celler att analysera många ES kolonier för att identifiera några kloner med mutationer som följd HR med inriktning vektor18. Guld metoderna för att identifiera HR händelser inkluderar södra blotting och PCR-19,20. Fördelarna med tillvägagångssätt är att södra blotting kan identifiera korrekt riktade ES kloner och tillåter forskare att analysera strukturen av gen-inriktade händelsen, till exempel en kontroll av ett enda exemplar insättning av konstruktionen, medan en PCR-baserad strategi tillåter snabb screening för HR evenemang21,22. Även om dessa metoder har nackdelar, såsom att de är tidskrävande och kan ha falska positiva, Idå användningen av dem är allmänt accepterade och tillämpas av de flesta labb i att identifiera HR händelser, särskilt i ES-celler, för generering av genetiskt modifierade djur.
Tre isoformer av nonmuscle myosin II (NM II) hos däggdjur, vardera bestående av två identiska NMHC IIs som kodas av tre olika gener (namngivna Myh9, Myh10 och Myh14) och två par lätta kedjor, kallas NM II-A, II-B och II-C23. Tidigare studier har visat att åtminstone isoformerna NM II-A och II-B är nödvändiga för mus utveckling eftersom i vivo ablation av dessa isoformer resulterar i embryonal dödlighet24,25,26. Att kringgå detta problem och få nya insikter i isoform-specifika funktioner NM II-A och II-B i de senare stadierna av mus utveckling, en genetisk ersättare antogs strategi med ES cellbaserade HR-medierad gen-inriktning teknik att Generera en rad mus modeller27. I samband med att identifiera önskad ES klonerna, utnyttjades både södra blotting och PCR-metoder, och dessa visade sig vara effektiva och tillförlitliga27,28.
Denna uppsats avser att ge en detaljerad beskrivning av södra blotting och PCR, inklusive utformningen av inriktning vector(s), probe(s), och primers och utförandet av experiment, samt analys av resultaten exemplifieras genom att identifiera HR händelse händelse i ES-celler för att skapa genetiska utbyte NM II mus modeller och representativa uppgifter. Protokoll av dessa två metoder som presenteras här kan också antas för att identifiera genotyperna genetiskt modifierade celler eller djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design av inriktning Construct(s), prober för Southern Blot och Primers för PCR
- Välj den första kodning exon (exon 2) av den Myh9 genen för störningar eller införande i tillämpningen av knockout/inpressning redovisas här.
- Hämta 5-kb uppströms och 5-kb nedströms DNA sekvenser kring den Myh9 exon 2 från webbplatsen genome.ucsc.edu .
- Analysera begränsning matsmältningen mönster av enzymer (REs) med 1 – 2 nedskärningar i denna 10-kb region med pDRAW programvara för att avgöra lämpliga RE(s) att smälta genomisk DNA för södra blotting.
Anmärkning: Dra jag uppfyller detta krav och väljs för ändamålet. - Välj ett 4 kb fragment omedelbart uppströms den Myh9 exon 2 som vänster homologi arm (LHA) och en 1,7 kb fragment omedelbart nedströms sekvens som rätt homologi arm (RHA); Välj ett 1 kb fragment 5' uppströms för LHA som vänster sonden (LP) för södra blotting och ett 1,2 kb fragment 3' nedströms av RHA som rätt sonden (RP), på grundval av ovanstående analys.
- Använd ett primer3 program för att utforma framåt och bakåt primers för att förstärka de fyra DNA-fragment med PCR. Designa ett par grundfärger med forward primer bodde nära terminalen 3' ett urval neomyocin motstånd markörgen (P1) och omvänd primern ligger strax utanför RHA (P2).
Obs: Denna primer par kommer att användas för att identifiera riktade ES kloner av PCR-29. - Hitta en 129Sv BAC klon som täcker mus Myh9 gen locus genom att besöka bacpac.chori.org hemsida (Obs: syngena DNA är att föredra). Isolera BAC DNA med ett kit som är lämpligt för rening av stora bitar av DNA följa instruktionerna som anges av tillverkaren.
Obs: Renat BAC DNA kommer att användas som mall för PCR-amplifiering. - Rita en schematisk representation av den inriktning konstruktioner, sonder och primers att sammanfatta denna information.
2. generation inriktning Construct(s) och sonder för Southern Blot, och utarbetandet av Primers för PCR
- Beställ PCR primers beskrivs ovan och lös upp dem i en koncentration av 20 µM.
- Förstärka homologi armar och sonder med PCR i en reaktion lösning inklusive 1 µL framåt och 1 µL omvänd primers, 1 µL BAC DNA (50 ng) som mallen, 5 µL buffert för Pfu och 1 µL Pfu ultra som DNA polymerase , och H2O upp till 50 µL. utföra PCR i en PCR-maskin på följande villkor: 95 ° C i 3 min. 95 ° C i 30 s; 60 ° C under 30 s; 72 ° C och 1 kb/min; 30 cykler; Slutligen, 72 ° C i 10 min.
- Rena PCR-produkter med hjälp av en PCR-rengöring kit enligt protokollet som tillhandahålls av tillverkaren och eluera DNA fragmenten med 40 µL av H2O. Digest renat PCR-produkterna med fördefinierade REs en reaktion lösning innehållande 5 µL 10 x buffert för REs , 2,5 µL RE1 och 2,5 µL av RE2 och eluerat DNA, vid 37 ° C under 2 h. kör en 1% DNA gel till separata mål DNA band, punktskatter gel som innehåller mål-DNA under UV-ljus, rena målet DNA fragmenten från gelen använder en DNA gel utvinning kit enligt till protokollet som tillhandahålls av tillverkaren, och eluera DNA fragmenten med 40 µL av H2O.
- Klona homologi armar och ersätter uttrycket kassetten(/kassetterna) i den mpNTKV-LoxP vektorn enligt ordningen de förstärks och renat RHA, LHA och ersätter uttrycket kassetten(/kassetterna) frigörs från andra vektorer att erhålla de slutliga inriktning construct(s). Klona DNA-fragment av de förstärkta och renat sonderna i T-lätt vektorn.
- Bekräfta nukleotidsekvenser av alla klonade DNA-fragment av sekvensering27,28.
3. beredning av inriktning Construct(s), elektroporation av ES-celler och förstärkning av ES kloner
- Förbereda varje inriktning konstruktion med en plasmid maxiprep kit enligt protokollet som tillhandahålls av tillverkaren. Linjär varje konstruera plasmid genom uppslutning det med jag inte i en 400 µL reaktion inklusive 40 µL 10 x buffert för inte I, 10 µL inte jag, 100 µg av DNA, och H2O upp till 400 µL, vid 37 ° C över natten.
- Rena det linearized inriktning construct(s).
- Extrahera den smält reaktion lösningen 1 x med en lika stor volym av fenol: kloroform: isopentanol (25:24:1) och centrifugera vid en kraft på 2 000 x g under 10 minuter.
- Överför supernatanten till en ny 1,5 mL tub, fällningen DNA med 2.5 x etanol och 0,1 x 3M natriumacetat (pH 5.2) (volym ratio) och centrifugera vid en kraft på 2 000 x g i 10 min.
- Ta bort supernatanten, tvätten DNA pellet 1 x med 1 mL 75% etanol och centrifugera vid en kraft på 2 000 x g i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och lufttorka DNA pelleten i 5 min.
- Lös den linearized DNA pelleten i steril Tris-EDTA (TE) buffert med en slutlig koncentration på 1 µg/µL.
- Blanda 50 µg varje linearized inriktning konstruktion med 0,5 x 107 ES-celler. Utföra elektroporation på 320 V och 250 µF. platta electroporated ES cellerna på rätter med neo-resistenta MEF matare.
- Efter 24 h, växla till ES cell medium med 400 µg/mL G418 och 200 µM ganciklovir och fortsätta till kultur för 4 – 5 dagar med en daglig medium förändring. Plocka upp resistenta ES kloner i 48-väl plattor.
Obs: Normalt fyra 48 brunnar används per konstruktion. - Duplicera de 48 brunnar.
Obs: En uppsättning plattorna är fryst tillstånd, och den andra uppsättningen används för genomisk DNA förberedelse.
4. beredning av genomisk DNAs och matsmältningen med Restriction Enzyme(s)
- Förbered gDNAs från ES-celler med en kommersiella kit (genomisk DNA rening kit) med mindre modifieringar.
- Ta bort medier från ES cellkulturen och tillsätt 500 µL av atomkärnor lysis lösning, inklusive RNaseA, direkt till brunnarna att lysera celler.
Obs: Cellen lysate kan lagras vid-80 ° C eller behandlas omedelbart. - Pipettera upp och ner flera gånger att lysera cellerna helt och överföra dem till en ren 1,5 mL tub.
- Lägga till en tredjedel av volymen av protein nederbörd lösning på 1,5 mL röret, vortex kraftigt i 20 s, chill proverna på is för 5 min och sedan Centrifugera vid en kraft på 2 000 x g för 5 min. överföring supernatanten till en annan ren 1,5 mL tub kaffesumpbehållaren ning en lika stor volym av isopropanol; Blanda försiktigt lösningen. (Observera att vita tråd-liknande trådar kan ses i nuläget.) Centrifugera vid en kraft på 2 000 x g för 1 min; sedan Kassera supernatanten.
- Tvätta gDNA pelleten med 1 mL 70% etanol vid rumstemperatur, Centrifugera vid en kraft på 2 000 x g under 1 min, Aspirera supernatanten noggrant och sedan lufttorka gDNA pelleten i 3 min.
- Lös upp gDNAs med 100 µL av DNA rehydrering lösning, och sedan, inkubera vid 65 ° C i 1 h eller vid 4 ° C över natten.
- Lagra gDNAs vid 2 – 8 ° C.
- Ta bort medier från ES cellkulturen och tillsätt 500 µL av atomkärnor lysis lösning, inklusive RNaseA, direkt till brunnarna att lysera celler.
- Sammanfattad i gDNAs med fördefinierade RE Dra I. Ställ upp en 30-µL matsmältningen reaktion genom att blanda 3 µL av 10 x buffert för Dra I, 3 µL av Dra jag, 10 µg av gDNAs/prov och H2O upp till 30 µL och inkubera vid 37 ° C över natten.
- Kontrollera att rötning av DNA gel, analysera 5 µL av smält reaktionen, och sedan lägger de 3 µL 10 x DNA-lastning buffert för efterföljande steg.
5. södra Blotting och PCR-identifiering
- Södra blotting screening
- Separera den smälta gDNAs genom elektrofores och överföring till ett membran.
- Förbereda en 1% agaros elektrofores gel med etidiumbromid (EB), läsa in proverna från steg 4,3 och en 1 kb stege och kör gelen med en låg spänning (30 – 40 V) över natten.
- Ta ut gelen och ta en bild med ett DNA gel-imaging system efter elektrofores. Kontrollera om de smält och separerade gDNAs visar en smear-liknande bild.
- Blötlägg gelen i en bricka med 0,2 N HCl-lösning och skaka den försiktigt i 20 min i rumstemperatur.
- Överföra gelen till DNA-denatureringen lösning och skaka den försiktigt i 20 min i rumstemperatur.
- Växla gelen till DNA-neutraliserande lösning och skaka den försiktigt i 20 min i rumstemperatur.
Obs: Gelen är benägna att gå sönder efter detta steg, så den måste hanteras försiktigt. - Använda systemets snabb nedåtgående överföring överföra de utsedda nationella myndigheterna från gelen till membranet. Montera TurboBlotter och blotting stacken enligt anvisningarna från tillverkaren.
Anmärkning: 10 x eller 20 x saltlösning-natriumcitrat (SSC) lösning används som en buffert för överföring. 3 h för överföring är i allmänhet tillräckligt för att överföra 95% av gDNAs från gel till membran; en längre tid av överföringen är dock ofarliga. - Ta ut membranet och tvätta det med 2 x SSC för 1 min, absorbera vätskan med vävnader och sedan tvärbinda DNA med hjälp av en UV crosslinker-membranet.
Obs: Membranet kan lagras vid 4 ° C i en vecka.
- Märka de DNA-proberna med radioaktivitet.
- Rena sonden plasmidsna med en miniprep enligt protokollet som tillhandahålls av tillverkaren.
- Release DNA fragment av sonderna från plasmiden vektorn av EcoR matsmältningen i en reaktion lösning inklusive 5 µL buffert för EcoR I, 2 µL av EcoR jag enzym, 20 µg av plasmid DNA och H2O upp till 50 µL , för 2 h.
- Kör en 1% DNA gel för att separera de sonden DNA-fragment från vektorn och rena DNA fragment av sonderna med en DNA gel extraction kit enligt protokollet som tillhandahålls av tillverkaren.
- Använder 1 µL DNA lösning, mätning av DNA koncentrationen av sonden DNA fragment med en spektrofotometer vid en våglängd på 260/280 nm.
- Förbereda 40-ng för probe DNAs i en 1,5 mL tub med 45 µL av TE buffert, koka i 3 min, snurra kort och sedan placera rör på is i 2 min.
- Tillsätt de värme-denaturerat sonden DNAs till röret som innehåller ready-to-go DNA-märkning pärlor (-dCTP), Pipettera upp och ner för att blanda, tillsätt 5 µL [α32P] dCTP och sedan, inkubera vid 37 ° C i 15 min.
- Rena de märkta sonderna med hjälp G-50 microcolumns enligt anvisningarna från tillverkaren och sedan mäta radioaktiviteten av en scintillationsräknare (valfritt).
- Hybridisera membrane(s) med de märkta sonderna.
- Prehybridize membranet.
- Prewarm hybridisering lösningen vid 42 ° C i 30 min. Blanda 20 mL av förvärmd hybridisering lösning med 200 µg av kokt lax spermier DNA i en 50 mL tub.
- Placera membranet i hybridisering röret. Tillsätt den blanda prehybridization lösningen till hybridisering röret. Placera det i hybridisering ugnen (uppsättning rullande och temperaturen vid 42 ° C) och låt prehybridization fortsätta i 30 min.
- Hybridisera membranet med den märkta probe(s).
- Ta ut hybridisering röret och häll över prehybridization lösningen i en 50 mL tub; lägga till denaturerat sonden (uppvärmd vid 100 ° C för 3 min) från steg 5.1.2.7 detta röret och blanda försiktigt.
Obs: Minska eventuella inducerande bubblor. - Returnera den blanda lösningen till hybridisering röret och utföra hybridisering vid 42 ° C över natten.
- Ta ut hybridisering röret och häll över prehybridization lösningen i en 50 mL tub; lägga till denaturerat sonden (uppvärmd vid 100 ° C för 3 min) från steg 5.1.2.7 detta röret och blanda försiktigt.
- Prehybridize membranet.
- Tvätta membrane(s) för att ta bort nonhybridized sonder.
- Placera membrane(s) i ett fack med 1 x SSC + 0,1% SDS och skaka försiktigt på 55 – 60 ° C i 10 min.
- Överföra membrane(s) till en bricka med 0,5 x SSC + 0,1% SDS och skaka försiktigt på 55 – 60 ° C i 10 min.
- Kontrollera radioaktiviteten på membrane(s) genom att använda en bärbar geigermätare för att avgöra huruvida det krävs en tredje tvätt.
- Exponera radioaktiviteten på membranet till X-ray filmer.
- Avlägsna vätskan från de tvättade membrane(s).
- Omsluta membrane(s) med plastfolie och åtgärda dessa i exponering kassett.
- Exponera membranet till två ark av röntgenfilm i ett mörkt rum.
- Placera kassetten exponering vid-80 ° C över natten eller längre.
- Utveckla filmerna för att visualisera resultaten. Utvärdera om en motsvarande ES-klon är den önskade med den riktade rekombination eller inte, enligt storleken på banden DNA upptäcks av sonderna.
- Rehybridize samma membranet av en annan sonden efter strippning den använda sonden enligt följande procedur: ta ut den använda membranen, tvätta det 1 x med ren H2O, och sedan, inkubera det i striping lösning (55% formamid, 2% Specialföretaget, 1% SDS, H 2 (O) vid 65 ° C med milda skakningar för 1 – 2 h.
- Separera den smälta gDNAs genom elektrofores och överföring till ett membran.
-
PCR-identifiering
- Utför PCR-identifiering av önskad ES kloner i en 50-µL reaktion lösning inklusive 5 µL 10 x PCR buffert, 2 µL av 50 mM MgSO4, 1 µL av 10 mM dNTP, 1 µL 20 µM framåt primer, 1 µL 20 µM reverse primer , 1 µL HiFi-platina Taq, gDNAs (~ 100 ng), och H2O upp till 50 µL.
- Använd följande PCR-reaktion villkor: en inledande denaturering vid 94° C i 3 min, 30 cykler av denaturering vid 94° C för 30 s, glödgning vid 60° C i 30 s och en förlängning vid 68° C för 132 s, och ett sista steg 68° c i 10 min.
- Analysera PCR-produkterna genom elektrofores i 1,0% agaros.
- Klona PCR-fragmenten med deras beräknade storlek in i T-lätt vektor och sekvens för att bekräfta förekomsten av en delsekvens av vektorn som mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta papper beskrivs ett detaljerat protokoll med södra blotting och PCR, som används för att identifiera HR händelser som inträffade i mus ES-celler för generering av NM II genetisk utbyte mus-modeller, med ES celler-baserade HR-medierad inriktning teknik. Även om södra blotting och PCR, samt traditionella gen-inriktning teknik, har använts i flera årtionden, måste en framgångsrik tillämpning av dem planeras noga. Åtminstone dessa aspekter behöver beaktas: längden på långa och korta armar, positioner och längd av sonderna, lämplig REs för att skära de genomiska DNAs och primers för PCR, som sammanfattas i figur 1, som är till hjälp för efterföljande analys. Som ett viktigt steg i södra blotting, de förberedda och smält genomisk DNAs är skyldiga att skiljas på DNA gel för detektion av sonden. Eftersom genomisk DNAs är skuren i en massa fragment med olika längder, visar de en smear-liknande status på DNA gel, vilket tyder på en fullständig nedbrytning av de genomiska DNAs, som anges i figur 2. Som ett sista steg i södra blotting visas signalerar av en radioaktivitet-märkt sond korsa med ett mål DNA fragment på filmen, som återspeglar förekomsten av HR händelser i ES kloner, som därmed visar huruvida en ES-klon är den önskade. Enligt predesign i denna studie har ES kloner med muterade allelen två distinkta storlek band, medan vildtyp ES kloner har bara ett band, vilket tyder på önskad ES klonerna är heterozygot (figur 3). Relativ till förfarandet och resultaten av södra blotting, drift och resultat av PCR är enkla och direkta. Efter PCR-reaktionen, PCR-produkterna kan analyseras på DNA gel. Om PCR-banden är specifika och sekvensering klonade PCR produkterna bekräftar närvaron av delsekvens av målet vektor som en neo-motstånd-gen, samt genetiska regioner som är precis utanför homologi armen, kan HR inträffar vara förväntat och kontrollerade (figur 4).
Figur 1 : Inriktning konstruktioner. Detta är en schematisk visar generationen av flera inriktning konstruktioner. Den vildtyp (WT) Myh9 genen allelen, gen-targeting vektor, ersättare exogena uttryck kassetten(/kassetterna), och den resulterande muterade allele(s), samt sonderna (LP, RP) för Southern blot och primers (P1, P2) för PCR, visas och beskrivs ovan 27. en pil på exon 2 anger webbplatsen translationell initiering. Efter den lyckade förekomsten av HR, ersätter uttrycket kassetten och neomycin motstånd genen (Neor) infogas bara 5' av den initierande ATG-kodon. Därför den endogena Myh9-allelen störs och den knackade-i gene(s) är/uttrycks i den mutanta celler och möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Smält genomisk DNAs med Dra I. Genomisk DNAs från ES kloner inriktad med den konstruktion som ersätter NMHC II-A med II-B är smält med Dra jag och, sedan separeras på en agarosgel genom elektrofores. En smear-liknande smält gDNA observeras. C1 - C8 skildrar enskilda ES kloner. En fullständig nedbrytning av gDNA producerar en massa DNA-fragment med en annan längd, därmed visar en smear-liknande bild. Detta resultat speglar också beredda gDNAs bra kvalitet och fullständighet av matsmältningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativa resultat av södra blotting. Dessa paneler visar en södra blotting screening av de genomiska DNAs från ES kloner inriktad med konstruktionen att ersätta NMHC II-A med II-AB, använda vänster och höger sonderna. Den muterade allelen visar ett 12,1 kb eller 6 kb band när den vänstra sond eller rätt sond används, respektive, medan WT visar en 9,7 kb band. M: markör; PC1-PC5: positiva kloner; NC: negativa klon. Storleken på de södra blotting band är också indicerat. Alla förfaranden av södra blotting genomförs strikt och specificiteten av sonderna är bra nog; Det bör finnas inga nonspecific band förvänta för beräknade band. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa resultat av PCR. I denna panel visas PCR-identifiering av de genomiska DNAs från ES kloner inriktad med konstruktionen att ersätta NMHC II-A med II-BA använder primer paret P1 + P2. Den muterade allelen ger ett 2,1 kb band, medan den WT-allelen ger inga band. M: markör; PC1-PC3: positiva kloner; NC: negativa klon. Storleken på PCR-bandet är också indicerat. Eftersom primers är utformade för att bara upptäcka den muterade allelen, återspeglar uppkomsten av ett enda och förväntade band specificitet primers och den höga kvaliteten på de förberedda gDNAs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För närvarande, ersätta designer nukleaser för editering fortfarande inte ES cellbaserade gen-inriktning teknik på grund av dess frågor av off-target effekter och svårigheter att sätta en lång DNA fragment30,31. Gyllene metoderna för att identifiera HR händelser som inträffat i mus ES-celler, ger denna rapport en detaljerad protokoll med södra blotting och PCR för fältet. Vi validerat tillförlitligheten i dessa metoder genom att analysera enskilda kloner från mus ES-celler inriktad med en rad konstruktioner. Önskad ES klonerna identifieras genom dessa metoder hade använts framgångsrikt att generera motsvarande mus modeller27.
Även om andra metoder för screening av riktade ES kloner har varit beskrivs19,32, metoder för södra blotting och PCR inte kan ersättas helt av etablerade de därefter32, eftersom dessa inledande tekniker har en längre tillämpad historia och är allmänt accepterade och bekräftas av det vetenskapliga samhället, utförs av de flesta biologiska laboratorier, och är ursprunget till andra tekniker. Ännu viktigare, exemplifieras väl bra prestanda för södra blotting och PCR i identifiering av HR händelser i tidigare arbete29. Resultaten från södra blotting tyder flera unika funktioner: bland de slumpmässigt kontrollerade ES klonerna, över 90% av dem är du dessa, ingen ospecifik band upptäcks och HR inträffade företrädesvis på en allel av Myh9-genen. Samtidigt bekräftar uppgifterna från PCR, tillsammans med sekvensering, att HR inträffar är platsspecifika och stämmer väl med de från södra blotting.
Enligt vår praxis bör flera faktorer beaktas när södra blotting och PCR används för att identifiera HR händelser i ES-celler, därigenom få bra och förväntade resultat. Den första är längden på homologi armarna; i allmänhet kommer att ökar homologi armlängd öka effektiviteten i HR33. Detta är dock inte alltid fallet. Dels, öka längre armar svårigheten att manipulation; Däremot, resulterade längden på homologi armarna (4 kb i vänstra armen och 1.7 kb för höger arm) redovisas här i högsta HR frekvens erhålls hittills bland liknande experiment. Dessutom underlättar en rimlig längd på homologi vapen identifiering av PCR. Andra är utnyttjandet av syngena DNA för att förbereda homologi armar och södra blotting sonder34. Detta kan uppfyllas genom att beställa en BAC klon som innehåller regionen av den gen-of-intressen eller med genomiskt DNA från de celler som ska riktas. Tredje är valet av lämplig REs för att smälta genomisk DNAs. I allmänhet är en RE eller kombinationen av två REs som skär den vildtyp eller muterade allelen endast en eller två gånger runt regionen inriktning att föredra; Dessutom det resulterande större DNA-fragmentet bör inte överstiga 15 kb och storlek skillnaden mellan de olika DNA-fragmenten är över 2 kb. Dessa krav kan underlätta separation och identifiering av förväntade band genom södra blotting. Fjärde är längden av sonderna och minst likheten med andra sekvenser i genomet. Generellt är längden av sonderna 500 – 1000 bp. Likheten med andra sekvenser i genomet kan analyseras med NCBI BLAST program. Dessutom beskrivs en programvara som används till design sonderna för södra blotting har varit35. Den femte faktorn som bör beaktas är att använda konventionella metoder för att förbereda genomiskt DNA för en ökad avkastning. Genomisk DNAs beredd från en konfluenta väl 48-well platta är i allmänhet tillräckligt för minst två omgångar av södra blotting analyser. Att utforma primers för PCR, är den bästa strategin att använda en primer närvarande på urval markören tillsammans med en primer utanför inriktning armarna. Sekvensering av PCR-produkter är dessutom viktig för att bevisa HR händelser20,36. Särskilt, kan inte PCR-baserad screening helt ersätta den information som erhållits genom södra blotting, medan det kan effektivt minska antalet kloner som ska utvärderas.
Sammanfattningsvis, är södra blotting och PCR väl visat metoder för screening ES kloner för att identifiera HR-medierad gen-targeting händelser i ES-celler. Om den detaljerade protokoll som beskrivs här främst fokuserade på screening av önskad NM II genetisk utbyte ES kloner, kan det användas för genotypning möss som genereras därefter använder positiv ES klonerna. Det kan enkelt anpassas till identifiering av HR händelser i andra celltyper, såsom iPS-celler eller somatiska celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd från programmet allmänna National Natural Science Foundation Kina (bidrag nr 31571432), den mänskliga provinsiella naturvetenskap Foundation i Kina (Grant No. 2015JC3097) och den forskning stiftelsen av utbildning presidiet i Hunan Provinsen, Kina (Grant nr 15 K 054).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20x | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
References
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
- Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
- Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
- Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
- Van, dW. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
- Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
- Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
- Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
- Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
- Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
- Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
- Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
- Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
- Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
- Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
- Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
- Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
- Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
- Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
- Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
- Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
- Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
- Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
- Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
- Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).
