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JoVE Journal Genetics
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Genetics

利用南方印迹和聚合酶链反应鉴定小鼠胚胎干细胞的同源重组事件

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58467
Automatic Translation
*1,2, *1, *3, 1, 1, 1, 4, 5, 3, 1
1Lab of Animal Models and Functional Genomics (LAMFG), The Key Laboratory of Animal Vaccine & Protein Engineering, College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University (HUNAU), 2Department of Pathology, Georgetown University Medical School, 3College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University (HUNAU), 4Lab of Molecular Cardiology (LMC), National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH), 5Transgenic Core, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH)
* These authors contributed equally

Summary

在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以确定同源重组事件发生在小鼠胚胎干细胞使用南方印迹和/或 pcr。利用传统的胚胎干细胞同源重组介导靶向技术生成的非肌肉肌球蛋白 ii 基因替代小鼠模型就是例证。

Abstract

相对于非目标效应和在基因组编辑的设计师核酸酶应用中插入长 dna 片段的困难问题, 胚胎茎 (es) 细胞靶向技术并没有这些缺点, 而且广泛存在用于修改动物老鼠基因组, 从大的缺失插入到单核苷酸取代。值得注意的是, 确定获得所需的 es 克隆所需的同源重组 (hr) 事件相对较少, 是一个关键步骤, 需要准确和可靠的方法。南方印迹和/或常规 pcr 经常用于这一目的。在这里, 我们描述了使用这两种方法来识别发生在小鼠 es 细胞中的 hr 事件的详细过程, 在这些事件中, 内源性 myosin 基因的目的是被编码其他非肌肉肌球蛋白重链 i (nmhc iis) 的 cDNAs 所破坏和取代。南方印迹的整个过程包括靶向载体的构建、电穿孔、药物选择、es 细胞/克隆体的扩张和储存、基因组 dna (gdna) 的制备、消化和印迹、杂交和探头的清洗, 以及 x 射线胶片上自动成像的最后一步。pcr 可直接与制备的和稀释的 gdna 一起进行。为了获得理想的结果, 应仔细规划用于南方印迹的探针和限制性酶 (re) 切割位点和 pcr 引物。虽然执行南方印迹是耗时和劳动密集型的, pcr 结果有假阳性, 但南方印迹的正确识别和 pcr 的快速筛选允许这些方法的唯一或组合应用所描述的本文在 es 细胞和转基因动物基因型的鉴定中得到了大多数实验室的广泛应用和参考。

Introduction

hr 在小鼠 es 细胞中的基因靶向技术为剖析特定基因突变 1,2的细胞后果提供了有力的工具。2007年诺贝尔生理学或医学奖 3、4 对这一技术的重要性和意义反映在它的认可上;同时, 它也代表了现代基因工程时代的到来.通过 hr 进行基因靶向的基因可以用来设计小鼠 es 细胞 6,7基因组中几乎任何改变, 从点突变到大染色体重排。众所周知, 在所谓的基因组编辑工具出现之前, 基因敲除小鼠的产生需要在 es细胞8、9、10中应用基因靶向技术。在过去20年中, 这种方法产生了 5, 000多头基因靶向小鼠, 用于人类疾病建模或研究基因功能 11。建立了全基因组淘汰赛的工作, 将基因靶向载体、针对 es 细胞克隆和活鼠分配给科学界2、12、13、14,15. 毫无疑问, 基于 es 细胞的 hrc 介导的基因靶向技术极大地促进了我们对在生理或病理背景下发挥的基因功能的了解。

由于 hr 在哺乳动物细胞16,17中是一个相对较少的事件, 重要的和下一步的基因靶向在小鼠 es 细胞是分析许多 es 菌落, 以确定几个克隆与突变产生的hr 与目标向量 18。识别人力资源事件的黄金方法包括南方印迹和 pcr19,20。这些方法的优点包括南方印迹可以正确识别有针对性的 es 克隆, 并允许研究人员分析基因目标事件的结构, 例如验证构造的单个副本插入, 而基于 pcr 的战略允许更迅速地筛选21世纪、22日的人力资源活动。尽管这些方法有缺点, 例如它们很耗时, 可能存在误报, 但它们的组合用法在识别 hr 事件 (特别是 es 细胞) 以生成转基因产品时被广泛接受和应用动物。

哺乳动物中的非肌肉肌球蛋白 ii (nm ii) 有三种异型, 每种都由两个相同的 nmhc i i 由三个不同的基因 (名为 myosin、myosin 和 myosin) 和两对光链编码, 称为 nm-ii-a、ii-b 和 ii-c23。先前的研究表明, 至少 nm ii-a 和 ii-b 的异形对小鼠的发育至关重要, 因为这些同态的体内消融会导致胚胎性 24,25, 26。为了规避这一问题, 并在小鼠发育的后期阶段对 nm ii-a 和 ii-b 的特定于于等结构的功能有新的见解, 采用了基于 es 细胞的 hr 介导基因靶向技术的基因替代策略。生成一系列鼠标模型27。在确定所需 es 克隆体的过程中, 采用了南方印迹和 pcr 方法, 证明了这些方法的有效性和可靠性。

本文旨在提供南方印迹和 pcr 的详细描述, 包括靶向载体、探针和引物的设计, 实验的执行, 以及通过识别 hr 事件对结果进行分析。发生在 es 细胞中, 用于创建基因替代 nm ii 小鼠模型和代表性数据。这里介绍的这两种方法的方案也可以用来识别转基因细胞或动物的基因型。

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Protocol

1. pcr 的目标结构、南球探针和引物的设计

  1. 选择 myh9 基因的第一个编码外显子 (exon 2), 用于在此处报告的敲击/敲入应用中中断或插入。
  2. 从genome.ucsc.edu网站上检索 myh9 外显子2周围的5-kb 上游和5-kb 下游 dna 序列。
  3. 分析在这个10-kb 区域减少1-2 的酶 (res) 的限制性消化模式, 使用 pdraw 软件来确定合适的 re (s) 来消化用于南方印迹的基因组 dna。
    注: dra i 满足此要求, 并为此目的而选择。
  4. 选择 myh9 外显子2上游的 4 kb 片段作为左同源臂 (lha), 选择 1.7 kb 片段作为右同源臂 (rha);根据上述分析, 选择 lha 上游的 1 kb 片段 5 ' 作为南方印迹的左探针 (lp), 选择 rha 下游的 1.2 kb 片段 3 ' 作为右探针 (rp)。
  5. 使用引物3程序设计正向和反向引物, 通过 pcr 扩增这四个 dna 片段。设计一对具有正向引物的引物位于选择标记新肌素耐药基因 (p1) 的 3 ' 末端附近, 而反向引物位于 rha (p2) 之外。
    注: 此引物对将用于通过 pcr29 识别目标es 克隆。
  6. 通过访问bacpac.chori.org网站 (注: 异基因 dna 是首选), 找到覆盖老鼠 myh9 基因位点的 129sv bac 克隆。按照制造商提供的说明, 使用适用于纯化大片段 dna 的试剂盒来分离 bac dna。
    注: 纯化的 bac dna 将用作 pcr 扩增的模板。
  7. 绘制目标构造、探针和引物的示意图表示形式, 以总结此信息。

2. 南方布洛靶向构造和探针的生成及 pcr 引物的制备

  1. 对上述 pcr 引物进行排序, 并将其溶解为20μm 的浓度。
  2. 通过 pcr 在反应溶液中扩增同源臂和探针, 包括1μl 正向和1μl 反向引物、1μl bac dna (50 ng) 作为模板、5μl 的 pfu 缓冲液和1μl 的 pfu 超聚合酶, 以及h2o至 50μl. 在 pcr 机器中进行 pcr, 条件如下: 95°c 3分钟;95°c 30秒;60°c 30秒;72°c 和 1 kb/min;30个周期;最后, 72°c 10分钟。
  3. 根据制造商提供的协议, 使用 pcr 清理试剂盒纯化 pcr 产品, 并将 dna 片段与40μl 的h2o. 消化纯化的 pcr 产品和预先设计的 res 在含有5μl 的10倍酸酸缓冲液中, re1 的2.5μl 和 re2 的 2.5μl, 以及在37°c 下的洗脱 dna, 在2小时内. 在37°c 下运行1% 的 dna 凝胶分离目标 dna 带, 在紫外光下切除含有目标 dna 的凝胶, 使用 dna 凝胶提取试剂盒从凝胶中纯化目标 dna 片段到制造商提供的协议, 并将 dna 片段与40μl 的 h2o.
  4. 根据从其他载体释放的放大纯化 rha、lha 和替换表达盒的顺序, 将同源臂和替换表达盒克隆到 mpNTKV-LoxP 载体中, 以获得最终目标构造。克隆 dna 片段的扩增和纯化探针到 t 容易载体。
  5. 通过测序27, 28 确认所有克隆 dna 片段的核苷酸序列。

3. 靶向结构的制备、es 细胞的电穿孔和 es 克隆的放大

  1. 根据制造商提供的协议, 使用质粒马克里备套件准备每个目标结构。线性化每个结构质粒通过消化它不是 i 在400μl 反应包括40μl 的10倍缓冲液不是 i, 10μl 的不是 i, 100μg 的 dna, 和h2o高达 400μl, 在37°c 一夜。
  2. 纯化线性化的目标构造。
    1. 以相同体积的苯酚提取消化的反应溶液 1x: 氯仿: 异戊醇 (25:24/1) 和离心机, 其力为 2, 000 x 克, 10分钟。
    2. 将上清液转移到新的 1.5 ml 管中, 使用2.5倍乙醇和 0.1x 3m 醋酸钠 (ph 5.2) (体积比) 沉淀 dna, 并以 2, 000 x 克的力离心10分钟。
    3. 取出上清液, 用75% 乙醇的1毫升清洗 dna 颗粒 1x, 以 2, 000 x 克的力离心5分钟。
    4. 取出上清液, 风干 dna 颗粒5分钟。
    5. 在最终浓度为1μμμl 的情况下, 将线性化的 dna 颗粒溶解在无菌 Tris-EDTA (te) 缓冲液中。
  3. 将每个线性化靶向结构与 0.5 x10 7 es 细胞混合50μg。在 320 v 和 250μf. 下电穿孔的 es 细胞在具有抗新抗 mef 给料的盘子上进行电穿孔。
  4. 24小时后, 切换到具有 400μgml g418 和200μm 甘昔洛韦的 es 细胞培养基, 并在每日培养基变化的情况下继续培养4-5天。把耐药的 es 克隆体捡起来, 进入48孔的盘子里。
    注: 通常情况下, 每个结构使用四个48孔板。
  5. 复制48孔板。
    注: 一套板被冷冻保存, 另一套用于基因组 dna 制备。

4. 基因组 dna 的制备和限制性酶的消化

  1. 使用商业试剂盒 (基因组 dna 纯化试剂盒) 从 es 细胞中制备 gDNAs, 只需稍作修改。
    1. 从 es 细胞培养中去除培养基, 并将500μl 的核子裂解溶液 (包括 rnasea) 直接添加到井中, 使细胞裂解。
      注: 细胞裂解液可以储存在-80°c 或立即治疗。
    2. 向上和向下向上和向下多次, 以完全裂解细胞, 并将它们转移到一个干净的 1.5 ml 管。
    3. 将蛋白质沉淀液体积的三分之一添加到 1.5 ml 管中, 大力涡流 20个月, 将样品冷却 5分钟, 然后, 以 2, 000 x g的力离心 5分钟, 将上清液转移到另一个干净的 1.5 ml 管冷凝水上异丙醇的相同体积;轻轻混合溶液。(请注意, 此时可以看到白色线状链。以 2, 000 x克的力离心 1分钟;然后, 丢弃上清液。
    4. 在室温下用1% 乙醇清洗 gdna 颗粒, 以 2, 000 x克的力离心剂 1分钟, 仔细吸吸上清液, 然后将 gdna 颗粒风干3分钟。
    5. 用100μl 的 dna 补液溶解 gDNAs, 然后在65°c 孵育1小时或4°c 孵育1小时或4°c 孵育。
    6. 将 gDNAs 存放在2–8°c。
  2. 用预先设计的 re dra i. 对 gDNAs 进行消化, 通过将液滴的 3μl 10 x 缓冲液、3微米的 dra i、10μg 的 gdnassn 样品和高达30μl 的 h2 o 样品混合在一起, 并在37°c 下隔夜孵育, 建立30μl 消化反应。
  3. 通过 dna 凝胶检查消化的完整性, 分析消化反应的 5μl, 然后在随后的步骤中加入3μl 的 10x dna 加载缓冲液。

5. 南方印迹和 pcr 鉴定

  1. 南方印迹筛查
    1. 通过电泳分离被消化的 gDNAs 并转移到膜上。
      1. 用溴化乙酯 (eb) 制备1% 琼脂糖电泳凝胶, 加载步骤4.3 和1kb 阶梯中的样品, 并在夜间以低电压 (30–40 v) 运行凝胶。
      2. 电泳后, 拿出凝胶, 用 dna 凝胶成像系统拍照。检查已消化和分离的 gDNAs 是否显示类似涂抹的图像。
      3. 用 0.2 n hcl 溶液将凝胶浸泡在托盘中, 在室温下轻轻摇匀20分钟。
      4. 将凝胶转移到 dna 变性溶液中, 在室温下轻轻摇20分钟。
      5. 将凝胶转换为 dna 中和溶液, 并在室温下轻轻摇晃20分钟。
        注: 在此步骤后, 凝胶容易断裂, 因此必须小心处理。
      6. 使用快速向下传输系统将 dna 从凝胶转移到膜上。根据制造商提供的说明组装涡轮吹塑机和吸墨堆。
        注: 10倍或20x 柠檬酸钠 (ssc) 溶液用作转移缓冲液。一般情况下, 3 小时的转移足以将95% 的 gDNAs 从凝胶转移到膜上;然而, 更长的转移时间是无害的。
      7. 取出膜, 用 2x ssc 清洗 1分钟, 用组织吸收液体, 然后使用 uv 交联剂将 dna 与膜交叉连接。
        注: 膜可在4°c 下保存一周。
    2. 用放射性标记 dna 探针。
      1. 根据制造商提供的协议, 使用微型制备试剂盒纯化探针质粒。
      2. 通过 ecor i 消化从质粒载体中释放探针的 dna 片段, 该反应溶液包括5微米的 ecor i 缓冲液、2微米的 ecor i 酶、20μg 的质粒 dna 和高达50μl 的 h2o, 2小时。
      3. 运行1% 的 dna 凝胶, 用于从载体中分离探针 dna 片段, 并根据制造商提供的协议, 使用 dna 凝胶提取试剂盒纯化探针的 dna 片段。
      4. 使用1μl 的 dna 溶液, 用分光光度计测量波长为 26/280 nm 的探针 dna 片段的 dna 浓度。
      5. 在含有 45μl te 缓冲液的 1.5 ml 管中制备 40 ng 探针 dna, 煮沸 3分钟, 短暂旋转, 然后将管放在冰上2分钟。
      6. 将热变性探针 dna 添加到含有现成的 dna 标记珠子 (-dctp) 的管中, 上下旋转混合, 加入 5μl [α32p] dctp, 然后在37°c 孵育15分钟。
      7. 根据制造商提供的说明, 使用 g-50 微柱对标记的探头进行纯化, 然后通过闪烁计数器测量放射性 (可选)。
    3. 用标记的探针杂交膜。
      1. 预杂交膜。
        1. 在42°c 的情况下, 将杂交溶液在42°c 前混合 30分钟, 将预热杂交溶液的20毫升与200微克的煮三文鱼精子 dna 混合在一个50毫升的试管中。
        2. 将膜放入杂交管中。在杂交管中加入混合后高压化溶液。将其放入杂交烤箱 (设置轧制和温度在 42°c), 并让预压进行30分钟。
      2. 用标记的探针将膜杂交。
        1. 取出杂交管, 将反义溶液倒入50毫升管;从台阶 5.1.2.7, 将变性探针 (在100°c 加热 3分钟) 加入本管, 轻轻搅拌。
          注: 减少任何诱导气泡。
        2. 将混合溶液返回到杂交管, 并在42°c 下进行一夜杂交。
    4. 清洗膜以去除非杂交探针。
      1. 将膜放入 1x ssc + 0.1% sds 的托盘中, 在55–60°c 下轻轻摇晃10分钟。
      2. 将膜转移到具有 0.5 ssc + 0.1% sds 的托盘上, 在55–60°c 下轻轻摇晃10分钟。
      3. 使用便携式盖革计数器检查膜上的放射性, 以确定是否需要第三次清洗。
    5. 将膜上的放射性暴露在 x 射线胶片上。
      1. 从洗涤膜上取下液体。
      2. 用塑料包装包裹膜, 并将其固定在曝光盒中。
      3. 在黑暗的房间里将膜暴露在两片 x 光片上。
      4. 将曝光盒放在-80°c 或更长时间。
    6. 开发电影, 以可视化的结果。根据探针检测到的 dna 波段大小, 评估相应的 es 克隆是否为有针对性的重组所需的克隆。
    7. 按照以下步骤, 在剥离使用过的探针后, 用另一个探头将同一膜再杂交: 取出用旧的膜,用干净的 h2o 清洗 1x, 然后在条带化溶液中孵育 (55% 甲酰胺、2% sspe、1% sds, h2o) 在65°c 下, 轻轻晃动1–2小时。
  2. pcr 识别
    1. 在50μl 反应溶液中对所需的 es 克隆进行 pcr 识别, 包括5μl 的 10x pcr缓冲液、2μl 的 50 mmmmgso 4、1μl 的 10 mm dntp、10μm 正向底漆的1μl、20μm 反向底漆的1μl, 1μl 的高保真铂 taq, gDNAs (~ 100 纳克), 和h2o高达50μl。
    2. 使用以下 pcr 反应条件: 94°C 的初始变性 3分钟, 94°C 30个变性周期为 30秒, 60°C 退火 30秒, 68°C 为132秒的延长, 最后一步为10分钟的68°C。
    3. 用电泳技术分析1.0% 琼脂糖中的 pcr 产物。
    4. 将 pcr 片段及其预期大小克隆到 t-易值载体和序列中, 以确认目标载体的部分序列的存在。

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Representative Results

本文介绍了一种详细的南方印迹和 pcr 协议, 该协议利用基于 es 细胞的 hr 介导靶向技术, 用于识别小鼠 es 细胞中发生的 hr 事件, 用于生成 nm ii 基因替代小鼠模型。尽管南方印迹和 pcr 以及传统的基因靶向技术已经广泛使用了几十年, 但它们的成功应用需要仔细规划。至少需要考虑这些方面: 长臂和短臂的长度、探针的位置和长度、切割基因组 dna 的合适 res 以及 pcr 的引物, 如图 1所示, 这对后续分析。作为南方印迹的一个重要步骤, 制备和消化的基因组 dna 需要在 dna 凝胶上分离, 以便探针检测。由于基因组 dna 被切割成许多长度不同的片段, 因此它们在 dna 凝胶上显示出类似涂片的状态, 这表明基因组 dna 完全消化, 如图 2所示。作为南方印迹的最后一步, 在影片中显示了放射性标记的探针与目标 dna 片段杂交的信号, 这反映了 es 克隆中人力资源事件的发生, 从而表明 es 克隆是否为所需的。根据本研究的预先设计, 具有突变等位基因的 es 克隆有两个不同大小的带, 而野生类型 es 克隆只有一个带, 这表明所需的 es 克隆是杂合体 (图 3)。相对于南方印迹的手术和结果, pcr 的操作和结果是简单和直接的。在 pcr 反应后, 可以在 dna 凝胶上对 pcr 产物进行分析。如果 pcr 带是特异性的, 克隆 pcr 产品的测序证实存在部分目标载体序列, 如新抗性基因, 以及同源臂之外的基因组区域, 则可能会发生 hr 事件。(图 4)。

Figure 1
图 1: 定位构造.这是一个示意图, 演示了多个目标构造的生成。前面显示和描述了野生类型 (wt) myh9 基因等位基因、基因靶向载体、替换外源表达盒、由此产生的突变等位基因以及用于南叶和引物的探针 (lp, rp) (p1, p2)。27. 外显子2上的箭头表示平移起始站点。在 hr 成功出现后, 仅插入 5 ' 的启动 atg 密码子的替换表达盒和新霉素耐药基因 (neor)。因此, 内源性 myh9 等位基因被破坏, 敲入基因在突变细胞和小鼠中表达。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 消化的基因组 dna 与 dra i.以用 ii-b 取代 nmhc ii-a 的结构为目标的 es 克隆的基因组 dna 被用 dra i 消化, 然后通过电泳在琼脂糖凝胶上分离。观察到类似涂片的消化 gdna。c1-c8 描绘了单个 es 克隆。gdna 的完全消化会产生大量长度不同的 dna 片段, 从而显示出类似涂片的图像。这一结果也反映了制备的 gDNAs 的良好质量和消化的完整性。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 南方印迹的代表性结果.这些面板显示了一个南方印迹筛选的基因组 dna 从 es 克隆的目标, 结构取代 nmhc ii-a 与 ii-ab, 使用左和右探头。当使用左探针或右探针时, 突变的等位基因分别显示 12.1 kb 或 6 kb 波段, 而 wt 显示 9.7 kb 波段。m: 标记;pc1-pc5: 正克隆;nc: 负克隆。还指出了南方印迹带的大小。所有南方印迹的程序都是严格执行的, 探针的特异性足够好;不应该有预期的特定波段。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: pcr 的代表性结果.该面板展示了基于使用引物对 p1 + p2 将 nmhc-ii-a 替换为 ii-ba 的结构所针对的 es 克隆基因组 dna 的 pcr 识别。突变的等位基因产生 2.1 kb 的波段, 而 wt 等位基因产生没有带。m: 标记;pc1-pc3: 正克隆;nc: 负克隆。还指出了 pcr 带的大小。由于引物的设计只检测突变的等位基因, 因此单个预期带的出现反映了引物的特殊性和制备的 gDNAs 的高质量。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

目前, 用于基因组编辑的设计核酸酶由于其目标外效应和插入 dna 片段30、31的困难问题, 仍不能取代基于 es 细胞的基因靶向技术。作为识别发生在小鼠 es 细胞中的 hr 事件的黄金方法, 本报告为该领域提供了一个详细的南方印迹和 pcr 协议。我们通过分析一系列构造所针对的鼠标 es 细胞中的单个克隆来验证这些方法的可靠性。这些方法确定的所需 es 克隆已成功地用于生成相应的鼠标模型27。

虽然已经描述了其他技术, 筛选目标 es 克隆人 19,32, 南方印迹和 pcr 的方法不能完全取代那些建立在此后的 32, 因为这些初步技术具有较长的应用历史, 被科学社会广泛接受和确认, 由大多数生物实验室进行, 是其他技术的起源。重要的是, 南方印迹和 pcr 在识别人力资源事件方面的良好表现在以往的工作29中得到了很好的体现。南方印迹的结果表明了几个独特的特征: 在随机筛选的 es 克隆中, 90% 以上是理想的克隆体, 没有检测到非特异性带, 而 hr 优先发生在 myh9 基因的一个等位基因上。同时, pcr 的数据, 加上测序, 证实了人力资源事件的发生是针对具体地点的, 与南方印迹事件的发生很好地匹配。

根据我们的实践, 当使用南方印迹和 pcr 来识别 es 细胞中的 hr 事件时, 应该考虑几个因素, 从而获得良好的和预期的结果。第一个是同源武器的长度;一般情况下, 增加同源臂长度将提高 hr33的效率。然而, 情况并非总是如此。一方面, 更长的武器增加了操纵的难度;另一方面, 这里报告的同源臂 (左臂为 4kb, 右臂为 1.7 kb) 的长度导致了到目前为止在类似实验中获得的最高 hr 频率。此外, 合理长度的同源臂有助于通过 pcr 进行识别。二是利用同源 dna 制备同源性武器和南方印迹探针 34.这可以通过订购包含兴趣区域的 bac 克隆或使用打算被锁定的细胞的基因组 dna 来满足这一点。第三是选择合适的稀土元素来消化基因组 dna。一般情况下, 一个 re 或两个 re 的组合, 切割野生类型或突变等位基因只有一次或两次周围的目标区域是首选;此外, 所产生的较大的 dna 片段不应超过 15 kb, 不同 dna 片段之间的大小差异超过 2 kb。这些要求可以促进通过南方印迹来分离和识别预期波段。第四是探针的长度和与基因组中其他序列的最小相似性。通常情况下, 探头的长度为 500–1000 bp。ncbi blast 程序可以分析与基因组中其他序列的相似性。此外, 还介绍了一个用于设计南方印迹探头的软件.第五个要考虑的因素是使用常规方法制备基因组 dna 以提高产量。从48孔板的汇井中制备的基因组 dna 一般足以进行至少两轮南方印迹分析。至于 pcr 引物的设计, 最好的策略是在选择标记上使用一个引物与靶向臂外的引物一起使用。此外, pcr 产品的测序对于证明人力资源事件20、36也很重要。值得注意的是, 基于 pcr 的筛查不能完全取代通过南方印迹获得的信息, 而它可以有效减少要评估的克隆数量。

总之, 南方印迹和 pcr 是筛选 es 克隆体以识别 es 细胞中 hr 介导的基因靶向事件的良好方法。虽然这里描述的详细协议主要集中在筛选所需的 nm ii 基因替代 es 克隆, 它可以用于基因分型小鼠随后产生的积极 es 克隆。它可以很容易地适应其他细胞类型的 hr 事件的识别, 如 ips 细胞或体细胞。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了国家自然科学基金总计划 (31571432)、中国省人类自然科学基金会 (赠款号 2015jc3097) 和湖南省教育局研究基金会的支持。中国省 (批准号: 15k054)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BAC CLONE BACPAC Resources Center (BPRC) bMQ-330E21
QIAGEN Large-Construct Kit QIAGEN 12462
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27104
QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit QIAGEN 12963
PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase Agilent 600382
T-easy vector Promega A1360
Nuclei Lysis Solution Promega A7941
Protein Precipitation Solution Promega A7951
DNA Denaturing Solution VWR 351-013-131
DNA Neutralizing Solution VWR 351-014-131
Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) VWR 27-9240-01
UltraPure SSC, 20x Thermo Fisher 15557036
UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Fisher 15593031
G418 Thermo Fisher 10131035
Salmon Sperm DNA Solution Thermo Fisher 15632011
Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity Thermo Fisher 11304029
Not I Thermo Scientific ER0592
Dra I Thermo Scientific ER0221
EcoR I Thermo Scientific ER0271
Ganciclovir Sigma G2536
Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits Fisher Scientific 09-301-188
[α32P]dCTP PerkinElmer NEG013H100UC
ProbeQuan G-50 Micro Columns GE Healthcare 28-9034-08
Hybrisol I Hybridization Solution Millipore S4040
Kodak X-Ray Film Z&Z Medical 844 5702

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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遗传学 第141期 同源重组 基因靶向 南方印迹 pcr 小鼠 胚胎干细胞 探针 基因替代 敲除/敲入 myh9 基因 基因组 dna
利用南方印迹和聚合酶链反应鉴定小鼠胚胎干细胞的同源重组事件
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