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Genetics

माउस भ्रूण में मुताबिक़ पुनर्संयोजन की घटनाओं की पहचान स्टेम दक्षिणी सोख्ता और पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया का उपयोग कोशिकाओं

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58467
Automatic Translation
*1,2, *1, *3, 1, 1, 1, 4, 5, 3, 1
1Lab of Animal Models and Functional Genomics (LAMFG), The Key Laboratory of Animal Vaccine & Protein Engineering, College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University (HUNAU), 2Department of Pathology, Georgetown University Medical School, 3College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University (HUNAU), 4Lab of Molecular Cardiology (LMC), National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH), 5Transgenic Core, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH)
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम मुताबिक़ पुनर्संयोजन की घटनाओं कि माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं दक्षिणी सोख्ता और/या पीसीआर का उपयोग में हुई की पहचान करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि की पीढ़ी के द्वारा उदाहरण है मांसपेशी मायोसिन द्वितीय आनुवंशिक प्रतिस्थापन माउस मॉडल का उपयोग कर पारंपरिक भ्रूण स्टेम सेल आधारित मुताबिक़ पुनर्संयोजन-मध्यस्थता लक्ष्यीकरण प्रौद्योगिकी.

Abstract

बंद लक्ष्य प्रभाव के मुद्दों के सापेक्ष और जीनोम संपादन के लिए डिजाइनर nucleases के आवेदन में एक लंबे डीएनए टुकड़ा डालने की कठिनाई, भ्रूण स्टेम (ES) सेल आधारित जीन लक्ष्यीकरण प्रौद्योगिकी इन कमियों नहीं है और व्यापक रूप से है एक न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन करने के लिए बड़े विलोपन/सम्मिलन से लेकर पशु/माउस जीनोम को संशोधित करने के लिए प्रयुक्त । विशेष रूप से, अपेक्षाकृत कुछ मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) वांछित ES क्लोन प्राप्त करने के लिए आवश्यक घटनाओं की पहचान एक महत्वपूर्ण कदम है, जो सटीक और विश्वसनीय तरीके की मांग है । दक्षिणी सोख्ता और/या पारंपरिक पीसीआर अक्सर इस प्रयोजन के लिए उपयोग किया जाता है । यहाँ, हम उन दो विधियों का उपयोग कर की विस्तृत कार्यविधियों का वर्णन करने के लिए जो में माउस ES कक्षों में हुई HR ईवेंट्स की पहचान करने के लिए अंतर्जात Myh9 जीन बाधित और cDNAs एन्कोडिंग अन्य मायोसिन भारी श्रृंखला iis (NMHC iis) द्वारा प्रतिस्थापित किया जा करने के लिए अभिप्रेत है । दक्षिणी सोख्ता की पूरी प्रक्रिया वेक्टर (ओं) को लक्षित करने के निर्माण, electroporation, दवा चयन शामिल हैं, ES कोशिकाओं के विस्तार और भंडारण/क्लोन, तैयारी, पाचन, और जीनोमिक डीएनए के सोख्ता (gDNA), संकरण और जांच की धुलाई (ओं), और एक्स-रे फिल्मों पर autoradiography के एक अंतिम कदम । पीसीआर सीधे तैयार और पतला gDNA के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है । आदर्श परिणाम प्राप्त करने के लिए, जांच और प्रतिबंध एंजाइम (आरई) दक्षिणी सोख्ता के लिए साइटों को काटने और पीसीआर के लिए प्राइमरों सावधानी से योजना बनाई जानी चाहिए । हालांकि दक्षिणी सोख्ता के निष्पादन में समय लेने वाली और श्रम गहन और पीसीआर परिणाम झूठी सकारात्मक है, दक्षिणी सोख्ता द्वारा सही पहचान और पीसीआर द्वारा तेजी से जांच की अनुमति एकमात्र या संयुक्त इन तरीकों का आवेदन वर्णित इस पत्र में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और ES कोशिकाओं और आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं के पादी की पहचान में सबसे प्रयोगशालाओं द्वारा सलाह ली ।

Introduction

murine ES कोशिकाओं में मानव संसाधन के द्वारा जीन लक्ष्यीकरण की तकनीक विशिष्ट आनुवंशिक उत्परिवर्तनों1,2के सेलुलर परिणाम विदारक के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है । इस प्रौद्योगिकी के महत्व और महत्व को फिजियोलॉजी या चिकित्सा3,4में २००७ नोबेल पुरस्कार द्वारा अपनी मांयता में परिलक्षित होते हैं; इस बीच, यह जीन5इंजीनियरिंग के आधुनिक युग के आगमन का प्रतिनिधित्व करता है । मानव संसाधन लक्ष्यीकरण के माध्यम से जीन वस्तुतः किसी भी परिवर्तन के लिए माउस ES कोशिकाओं6,7के जीनोम में बड़े गुणसूत्र पुनर्व्यवस्थाओं से लेकर बदलाव इंजीनियर का उपयोग किया जा सकता है । यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि, तथाकथित जीनोम संपादन उपकरण के उद्भव से पहले, एक जीन नॉकआउट माउस की पीढ़ी को ES कोशिकाओं8,9,10में जीन लक्ष्यीकरण प्रौद्योगिकी के आवेदन की आवश्यकता है । पिछले दो दशकों के दौरान, अधिक से अधिक ५,००० जीन लक्षित चूहों मानव रोगों मॉडलिंग या अध्ययन जीन कार्यों के लिए इस दृष्टिकोण से11का उत्पादन किया गया । एक जीनोम चौड़ा नॉकआउट प्रयास जीन लक्ष्यीकरण के लिए स्थापित किया गया है वैक्टर, लक्षित ES सेल क्लोन, और वैज्ञानिक समुदाय के लिए जीना चूहों2,12,13,14 , 15. निस्संदेह, ES सेल आधारित मानव संसाधन मध्यस्थता जीन लक्ष्यीकरण प्रौद्योगिकी बहुत शारीरिक या रोग संदर्भ में खेला जीन के कार्यों की हमारी समझ को उंनत किया है ।

क्योंकि मानव संसाधन स्तनधारी कोशिकाओं में एक अपेक्षाकृत निराला घटना है16,17, महत्वपूर्ण और अगले कदम murine ES कोशिकाओं में जीन लक्ष्यीकरण के बाद से परिणामस्वरूप उत्परिवर्तनों के साथ कुछ क्लोन की पहचान के लिए कई ES कालोनियों का विश्लेषण है लक्ष्यीकरण वेक्टर18के साथ मानव संसाधन । एचआर की घटनाओं की पहचान के लिए सोने के तरीकों में दक्षिणी सोख्ता और पीसीआर19,20शामिल हैं । दृष्टिकोण के लाभ में शामिल है कि दक्षिणी सोख्ता सही ढंग से लक्षित ES क्लोन की पहचान कर सकते है और शोधकर्ताओं जीन की संरचना का विश्लेषण करने के लिए लक्षित घटना, निर्माण की एक प्रतिलिपि प्रविष्टि के एक सत्यापन के रूप में, जबकि एक पीसीआर आधारित रणनीति HR घटनाओं21,22के लिए और अधिक तेजी से स्क्रीनिंग परमिट । हालांकि इन तरीकों में कमियां हैं, जैसे कि वे समय लेने वाली हैं और झूठी सकारात्मक हो सकता है, उनमें से संयोजन का उपयोग व्यापक रूप से स्वीकार कर लिया है और मानव संसाधन की घटनाओं की पहचान करने में सबसे प्रयोगशालाओं द्वारा लागू किया गया, आनुवंशिक रूप से संशोधित पैदा करने के लिए जानवरों.

तीन isoforms की मांसपेशी मायोसिन द्वितीय (एनएम द्वितीय) स्तनधारियों में, प्रत्येक दो समान NMHC आईआईएस जो तीन अलग जीन (नाम Myh9, Myh10, और Myh14) और प्रकाश श्रृंखला के दो जोड़े द्वारा इनकोडिंग रहे है से मिलकर, एनएम द्वितीय के रूप में जाना जाता है-ए, द्वितीय बी, और द्वितीय-सी23। पिछले अध्ययनों से संकेत दिया है कि कम से एनएम द्वितीय के isoforms-A और ii-B माउस विकास के लिए आवश्यक हैं क्योंकि इन isoforms परिणामों में vivo पृथक में भ्रूण की मृत्युदर 24,25,26. इस समस्या को दरकिनार और एनएम द्वितीय के isoform-विशिष्ट कार्यों में उपंयास अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए-एक और द्वितीय माउस विकास के बाद के चरणों में बी, एक आनुवंशिक प्रतिस्थापन ES सेल आधारित मानव संसाधन मध्यस्थता जीन लक्ष्यीकरण तकनीक का उपयोग कर रणनीति को अपनाया गया था माउस मॉडल की एक श्रृंखला उत्पंन27। वांछित ES क्लोन की पहचान के दौरान, दोनों दक्षिणी सोख्ता और पीसीआर तरीकों का उपयोग किया गया है, और इन के लिए कुशल और विश्वसनीय साबित27,28।

यह कागज दक्षिणी सोख्ता और पीसीआर का विस्तृत विवरण प्रदान करना चाहता है, जिसमें वेक्टर लक्ष्यीकरण के डिजाइन, जांच (एस), और प्राइमर, और प्रयोगों के निष्पादन के साथ-साथ एचआर इवेंट की पहचान करके परिणाम उदाहरण का विश्लेषण शामिल है । आनुवंशिक प्रतिस्थापन एनएम द्वितीय माउस मॉडल और प्रतिनिधि डेटा बनाने के लिए ES कोशिकाओं में घटना । यहाँ प्रस्तुत इन दोनों पद्धतियों के प्रोटोकॉलों को अनुवांशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं या पशुओं के पादी की पहचान के लिए भी अपनाया जा सकता है.

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Protocol

1. लक्ष्यीकरण के डिजाइन का निर्माण (एस), दक्षिणी दाग के लिए जांच, और पीसीआर के लिए प्राइमर

  1. पहले कोडिंग एक्सॉन (एक्सॉन 2) का चयन करें Myh9 जीन के आवेदन में व्यवधान या प्रविष्टि के लिए नॉकआउट/नॉकआउट में बताया ।
  2. 5 केबी ऊपर और 5 केबी बहाव डीएनए genome.ucsc.edu वेबसाइट से Myh9 एक्सॉन 2 आसपास के दृश्यों को पुनः प्राप्त ।
  3. विश्लेषण के प्रतिबंध पाचन पैटर्न एंजाइमों (REs) के साथ 1 – 2 में कटौती के साथ pDRAW सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उपयुक्त पुनः निर्धारित करने के लिए (s) के लिए जीनोमिक डीएनए को पचाने के लिए दक्षिणी सोख्ता.
    नोट: डॅा मैं इस आवश्यकता को पूरा करता है और इस प्रयोजन के लिए चुना गया है ।
  4. Myh9 एक्सॉन 2 के बाईं समरूपता बांह (LHA) के रूप में एक 4 kb टुकड़ा तत्काल ऊपर का चयन करें और सही समरूपता बांह (RHA) के रूप में १.७ kb अंश तत्काल बहाव अनुक्रम; एक 1 kb टुकड़ा 5 का चयन करें LHA के ऊपर के रूप में वाम जांच (एल. पी.) दक्षिणी सोख्ता के लिए और एक १.२ kb टुकड़ा 3 ' RHA के बहाव के रूप में सही जांच (आरपी), उपरोक्त विश्लेषण पर आधारित है ।
  5. पीसीआर द्वारा उन चार डीएनए अंशों को बढ़ाना के लिए आगे और रिवर्स प्राइमरों को डिजाइन करने के लिए एक primer3 प्रोग्राम का प्रयोग करें । डिजाइन एक चयन मार्कर neomyocin प्रतिरोध जीन (P1) और रिवर्स प्राइमर बस RHA (P2) के बाहर स्थित के 3 ' टर्मिनल के पास आगे प्राइमर रहते के साथ प्राइमरों की एक जोड़ी ।
    नोट: यह प्राइमरी जोड़ी पीसीआर29द्वारा लक्षित ES क्लोनों की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  6. खोजें एक 129Sv बीएसी क्लोन कवर माउस Myh9 जीन लोकस bacpac.chori.org वेबसाइट पर जाकर (नोट: isogenic डीएनए पसंद है) । एक किट का उपयोग कर बीएसी डीएनए अलग डीएनए के बड़े टुकड़ों को शुद्ध निर्माता द्वारा दिए गए निर्देशों का पालन करने के लिए उपयुक्त है ।
    नोट: शुद्ध बीएसी डीएनए पीसीआर प्रवर्धन के लिए टेंपलेट के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।
  7. इस जानकारी को सारांशित करने के लिए लक्ष्यीकरण का निर्माण, जांच, और प्राइमरों का एक योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण बनाएं ।

2. लक्ष्यीकरण के निर्माण (ओं) और दक्षिणी ब्लाट के लिए जांच, और पीसीआर के लिए प्राइमर की तैयारी

  1. आदेश पीसीआर प्राइमरों ऊपर वर्णित है और उंहें 20 µ मीटर की एकाग्रता में भंग ।
  2. समरूपता हथियार और जांच एक प्रतिक्रिया समाधान में पीसीआर द्वारा 1 µ एल फॉरवर्ड और 1 µ एल रिवर्स प्राइमरों, बीएसी डीएनए के 1 µ एल (५० एनजी) टेंपलेट के रूप में, µ के लिए बफर के 5 Pfu एल और डीएनए µ के रूप में Pfu अल्ट्रा के 1 पोलीमरेज़ l को बढ़ाना , और एच2ओ अप करने के लिए ५० µ l निम्न शर्तों के तहत एक पीसीआर मशीन में पीसीआर प्रदर्शन: ९५ ° c 3 मिनट के लिए; ९५ ° c 30 s के लिए; ६० ° c 30 s के लिए; ७२ ° c और 1 kb/ 30 चक्र; अंत में, 10 मिनट के लिए ७२ ° c ।
  3. एक पीसीआर क्लीनअप किट का उपयोग कर पीसीआर उत्पाद शुद्ध निर्माता द्वारा प्रदान की प्रोटोकॉल के अनुसार और elute डीएनए टुकड़े के साथ ४० µ एल के एच2ओ । एक प्रतिक्रिया समाधान में डिजाइन किए गए res के साथ शुद्ध पीसीआर उत्पादों को पचाने में res के लिए 10x बफर के 5 µ एल युक्त , २.५ µ l के RE1 और २.५ µ l के RE2, और eluted डीएनए, 2 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक 1% डीएनए जेल अलग लक्ष्य डीएनए बैंड के लिए चलाने के लिए, उत्पाद करने के लिए यूवी प्रकाश के तहत लक्ष्य डीएनए युक्त जेल, एक डीएनए जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर जेल से लक्ष्य डीएनए टुकड़े शुद्ध अनुसार निर्माता द्वारा प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के लिए, और elute डीएनए टुकड़े के साथ ४० µ एल के एच2ओ ।
  4. क्लोन समरूपता हथियार और प्रतिस्थापन अभिव्यक्ति कैसेट (ओं) में mpNTKV-LoxP वेक्टर परिवर्धित और शुद्ध RHA, LHA के आदेश के अनुसार, और प्रतिस्थापन अभिव्यक्ति कैसेट (ओं) अंय वैक्टर से जारी अंतिम लक्ष्यीकरण प्राप्त करने के लिए निर्माण (ओं) । क्लोन डीएनए अंशों के प्रवर्धित और शुद्ध जांच टी में आसान सदिश ।
  5. 27,28अनुक्रमण द्वारा सभी क्लोन डीएनए टुकड़े के न्यूक्लियोटाइड दृश्यों की पुष्टि करें ।

3. लक्ष्यीकरण के निर्माण की तैयारी (ओं), es कोशिकाओं के Electroporation, और es क्लोन के प्रवर्धन

  1. प्रत्येक लक्ष्यीकरण तैयार निर्माता द्वारा प्रदान की प्रोटोकॉल के अनुसार एक प्लाज्मिड maxiprep किट का उपयोग कर निर्माण । Linearize के साथ एक ४०० µ l रिएक्शन में नहीं मैं के साथ पचा द्वारा प्रत्येक निर्माण प्लाज्मिड ४० के लिए 10x बफर के एल मैं नहीं, 10 µ के एल नहीं मैं, डीएनए के १०० µ जी, और एच2ओ अप करने के लिए ४०० µ एल, ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात.
  2. रेखीय लक्ष्यीकरण निर्माण (ओं) को शुद्ध करना.
    1. Phenol की एक बराबर मात्रा के साथ पचा प्रतिक्रिया समाधान 1x निकालें: क्लोरोफॉर्म: Isoamyl शराब (25:24:1) और 10 मिनट के लिए २,००० x g के एक बल पर केंद्रापसारक ।
    2. एक नया १.५-एमएल ट्यूब करने के लिए supernatant स्थानांतरण, 2.5 x इथेनॉल और 0.1 x 3m सोडियम एसीटेट (पीएच ५.२) (मात्रा अनुपात) का उपयोग कर डीएनए तेज, और 10 मिनट के लिए २,००० x g के एक बल पर केंद्रापसारक ।
    3. supernatant निकालें, ७५% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ डीएनए गोली 1x धो, और 5 मिनट के लिए २,००० x g के एक बल पर केंद्रापसारक ।
    4. निकालें supernatant और एयर 5 मिनट के लिए डीएनए गोली सूखी ।
    5. बाँझ Tris में रैखिक डीएनए गोली भंग-EDTA (ते) बफर 1 µ जी/µ एल के एक अंतिम एकाग्रता में
  3. प्रत्येक रैखिक लक्ष्यीकरण के ५० µ जी मिश्रण ०.५ x 107 ES कोशिकाओं के साथ निर्माण । ३२० V और २५० µF. थाली पर electroporation प्रदर्शन नव प्रतिरोधी MEF भक्षण के साथ बर्तन पर electroporated ES कोशिकाओं ।
  4. 24 ज के बाद, ४०० µ g/mL G418 और २०० µ m ganciclovir के साथ ES सेल मीडियम पर स्विच करें और संस्कृति को 4 – 5 दिनों के लिए दैनिक माध्यम परिवर्तन के साथ जारी रखें । ४८-अच्छी तरह से प्लेटों में दवा प्रतिरोधी ES क्लोन उठाओ ।
    नोट: आम तौर पर, ४ ४८-अच्छी तरह से प्लेटों का निर्माण प्रति इस्तेमाल कर रहे हैं ।
  5. डुप्लिकेट ४८-अच्छी तरह से प्लेटें ।
    नोट: प्लेटों का एक सेट cryopreserved है, और अन्य सेट जीनोमिक डीएनए तैयारी के लिए प्रयोग किया जाता है ।

4. जीनोमिक DNAs और प्रतिबंध एंजाइम (ओं) के साथ पाचन की तैयारी

  1. छोटे संशोधनों के साथ एक वाणिज्यिक किट (जीनोमिक डीएनए शोधन किट) का उपयोग कर ES कोशिकाओं से gDNAs तैयार करें ।
    1. ईएस सेल कल्चर से मीडिया को निकालें और नाभिक lysis सॉल्यूशन के ५०० µ l को जोड़ें, जिनमें RNaseA, सीधे कुओं को लाइसे करने के लिए कोशिकाएं शामिल हैं.
      नोट: सेल lysate-८० ° c या तुरंत इलाज पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    2. प्लास्टिक ऊपर और नीचे कई बार कोशिकाओं को पूरी तरह लाइसे और उंहें एक साफ करने के लिए स्थानांतरण १.५-एमएल ट्यूब ।
    3. १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए प्रोटीन वर्षा के समाधान की मात्रा का एक तिहाई जोड़ें, भंवर 20 एस के लिए जोरदार, ठंडा 5 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने, और फिर, 5 मिनट के लिए २,००० x g के एक बल पर केंद्रापसारक । supernatant एक और साफ करने के लिए स्थानांतरण १.५ एमएल ट्यूब कॉनटै isopropanol की एक बराबर मात्रा निंग; धीरे हल मिश्रण । (ध्यान दें कि सफेद धागे की तरह किस्में इस पल में देखा जा सकता है.) 1 मिनट के लिए २,००० x g के बल पर केंद्रापसारक; उसके बाद, supernatant को छोड़ें ।
    4. कमरे के तापमान पर ७०% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ gDNA गोली धो, 1 मिनट के लिए २,००० x g के बल पर, महाप्राण supernatant ध्यान से, और फिर हवा-3 मिनट के लिए gDNA गोली सूखी ।
    5. डीएनए निर्जलीकरण समाधान के १०० µ एल के साथ gDNAs भंग और, फिर, 1 घंटे के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर या 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में मशीन ।
    6. 2-8 डिग्री सेल्सियस पर gDNAs स्टोर ।
  2. के साथ gDNAs को पचा फिर से डिज़ाइन री डॅा. एक 30-µ l पाचन प्रतिक्रिया के लिए 3 µ एल मिश्रण द्वारा सेट करें 10x मैं, 3 µ l के लिए डॅा मैं, gDNAs के 10 µ g/नमूना, और एच2ओ अप करने के लिए 30 µ एल, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी रात भर.
  3. डीएनए जेल द्वारा पाचन की पूर्णता की जाँच करें, पचा प्रतिक्रिया के 5 µ एल का विश्लेषण, और फिर, बाद में कदम के लिए 10x डीएनए लोड बफर के 3 µ एल जोड़ें.

5. दक्षिणी सोख्ता और पीसीआर की हुई शिनाख्त

  1. दक्षिणी सोख्ता स्क्रीनिंग
    1. पच gDNAs को ट्रो करके अलग करें और एक झिल्ली में ट्रांसफर करें ।
      1. एक 1% agarose ट्रो जेल ethidium ब्रोमाइड (EB) के साथ तैयार है, कदम ४.३ और एक 1 केबी सीढ़ी से नमूने लोड, और एक कम वोल्टेज के साथ जेल चलाने (30-40 वी) रातोंरात ।
      2. बाहर जेल ले लो और ट्रो के बाद एक डीएनए जेल-इमेजिंग प्रणाली के साथ एक तस्वीर ले लो । जांच करें कि पचा और अलग gDNAs एक धब्बा की तरह छवि प्रदर्शित करते हैं ।
      3. एक ट्रे में ०.२ एन एचसीएल समाधान के साथ जेल सोख और इसे धीरे से शेक कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ।
      4. डीएनए denaturing समाधान के लिए जेल स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए धीरे से हिला ।
      5. डीएनए में जेल स्विच-समाधान बेअसर और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए धीरे से हिला ।
        नोट: जेल इस कदम के बाद टूटना करने के लिए प्रवण है, तो यह ध्यान से नियंत्रित किया जाना चाहिए.
      6. DNAs को जेल से झिल्ली में स्थानांतरित करने के लिए तेजी से नीचे स्थानांतरण प्रणाली का उपयोग करें । निर्माता द्वारा दिए गए निर्देशों के अनुसार TurboBlotter और सोख्ता स्टैक को इकट्ठा करें ।
        नोट: 10x या 20x खारा-सोडियम साइट्रेट (एसएससी) समाधान एक स्थानांतरण बफर के रूप में प्रयोग किया जाता है । सामांय में, स्थानांतरण के 3 ज जेल से झिल्ली के लिए gDNAs के ९५% हस्तांतरण करने के लिए पर्याप्त है; हालांकि, स्थानांतरण का एक लंबा समय अहानिकर है ।
      7. बाहर झिल्ली ले लो और 1 मिनट के लिए 2x एसएससी के साथ धो, ऊतकों के साथ तरल को अवशोषित, और फिर पार-एक यूवी crosslinker का उपयोग कर झिल्ली के साथ डीएनए लिंक ।
        नोट: झिल्ली एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    2. रेडियोधर्मिता के साथ डीएनए जांच लेबल ।
      1. निर्माता द्वारा प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार एक miniprep किट का उपयोग करते हुए जांच plasmids को शुद्ध करें ।
      2. प्लाज्मिड वेक्टर से जांच के डीएनए के टुकड़े जारी EcoR मैं एक प्रतिक्रिया समाधान में पाचन EcoR के लिए बफर के 5 µ एल सहित मैं, 2 µ के एल के EcoR i एंजाइम, 20 µ जी के प्लाज्मिड डीएनए, और एच2ओ अप करने के लिए ५० µ l , के लिए 2 ज.
      3. वेक्टर से जांच डीएनए टुकड़े को अलग करने के लिए एक 1% डीएनए जेल भागो और निर्माता द्वारा प्रदान की प्रोटोकॉल के अनुसार एक डीएनए जेल निष्कर्षण किट के साथ जांच के डीएनए टुकड़े शुद्ध ।
      4. डीएनए समाधान के 1 µ एल का उपयोग करना, 260/280 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर एक spectrophotometer के साथ जांच डीएनए टुकड़े की डीएनए एकाग्रता को मापने ।
      5. तैयार ४०-जांच DNAs के एनजी एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में ४५ µ एल ते बफर के साथ, 3 मिनट के लिए फोड़ा, संक्षेप में स्पिन, और फिर, 2 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब (ओं) जगह है ।
      6. गर्मी-विकृत जांच DNAs से युक्त ट्यूब को जोड़ने के लिए तैयार डीएनए-लेबलिंग मोती (-dCTP) जाओ, मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे प्लास्टिक, [α३२P] dCTP के 5 µ l जोड़ें, और फिर, 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
      7. निर्माता द्वारा दिए गए निर्देशों के अनुसार जी-५० microcolumns का उपयोग करके लेबल की जांच को शुद्ध करें और फिर, एक जुटाना काउंटर द्वारा रेडियोधर्मिता को मापने (वैकल्पिक).
    3. संकरण के साथ झिल्ली (ओं) को चिह्नित करना ।
      1. झिल्ली Prehybridize ।
        1. 30 मिनट के लिए ४२ ° c पर संकरण समाधान गरम । एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में उबले हुए सामन शुक्राणु डीएनए के २०० µ जी के साथ गरम संकरण समाधान के 20 मिलीलीटर मिश्रण ।
        2. संकरण ट्यूब में झिल्ली प्लेस । संकरण ट्यूब के लिए मिश्रित prehybridization समाधान जोड़ें । यह संकरण ओवन में प्लेस (सेट रोलिंग और ४२ डिग्री सेल्सियस पर तापमान) और prehybridization 30 मिनट के लिए आगे बढ़ना ।
      2. संकरण जांच (ओं) के साथ झिल्ली ।
        1. संकरण ट्यूब बाहर ले जाओ और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में prehybridization समाधान डालना; विकृत जांच जोड़ें (3 मिनट के लिए १०० डिग्री सेल्सियस पर गरम) इस ट्यूब के लिए कदम 5.1.2.7 से और धीरे मिश्रण ।
          नोट: किसी भी उत्प्रेरण बुलबुले कम.
        2. संकरण ट्यूब के लिए मिश्रित समाधान वापस और ४२ डिग्री सेल्सियस पर रात भर संकरण प्रदर्शन करते हैं ।
    4. झिल्ली (ओं) को धोने के लिए संकरित जांच को दूर ।
      1. 1x एसएससी + ०.१% एसडीएस के साथ एक ट्रे में झिल्ली (ओं) प्लेस और 55 पर धीरे शेक-60 ° c 10 मिनट के लिए ।
      2. झिल्ली (ओं) को 0.5 x SSC + ०.१% एसडीएस के साथ एक ट्रे में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए 55-60 ° c पर धीरे से हिलाएं ।
      3. एक पोर्टेबल Geiger काउंटर का उपयोग करके यह तय करने के लिए झिल्ली (ओं) पर रेडियोधर्मिता की जाँच करें कि क्या एक तीसरी धुलाई की आवश्यकता है.
    5. एक्स-रे फिल्मों के लिए झिल्ली पर रेडियोधर्मिता का पर्दाफाश.
      1. धुल झिल्ली (ओं) से तरल निकालें ।
      2. झिल्ली (ओं) को प्लास्टिक की चादर से लपेटना और उसे एक्सपोजर कैसेट में ठीक/
      3. एक अंधेरे कमरे में एक्स-रे फिल्म के दो चादरें को झिल्ली बेनकाब ।
      4. पर एक्सपोजर कैसेट प्लेस-८० ° c रातोंरात या अब ।
    6. परिणामों की कल्पना करने के लिए फिल्मों का विकास करना । मूल्यांकन करें कि क्या एक इसी ES क्लोन लक्षित या नहीं संयोजन के साथ वांछित एक है, डीएनए जांच द्वारा पता चलता है के आकार के अनुसार ।
    7. Rehybridize एक और जांच से अलग करने के बाद एक ही झिल्ली का इस्तेमाल किया जांच निंनलिखित प्रक्रिया के अनुसार: इस्तेमाल किया झिल्ली बाहर ले लो, स्वच्छ एच2ओ के साथ यह 1x धो, और फिर, यह पट्टी समाधान में मशीन (५५% formamide, 2% SSPE, 1% एसडीएस, एच 2 O) 1-2 एच के लिए कोमल झटकों के साथ ६५ डिग्री सेल्सियस पर ।
  2. पीसीआर ने की शिनाख्त
    1. एक ५०-µ एल प्रतिक्रिया समाधान में वांछित ES क्लोनों की पीसीआर पहचान प्रदर्शन 5 µ 10x पीसीआर बफर के एल सहित, 2 µ l की ५० एमएम MgSO4, 1 µ l की 10 एमएम dNTP, 1 µ l की 20 µ मी फॉरवर्ड प्राइमरी, 1 µ l की 20 µ मी रिवर्स प्राइमरी , उच्च निष्ठा प्लैटिनम Taq के 1 µ l, gDNAs (~ १०० एनजी), और एच2ओ अप करने के लिए ५० µ एल
    2. निंनलिखित पीसीआर प्रतिक्रिया की स्थिति का प्रयोग करें: 94 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकार 3 मिनट के लिए, विकार के 30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस से अधिक 30 s, एनीलिंग के लिए 60 ° c पर 30 s और १३२ s के लिए 68 ° c पर एक विस्तार, और 68 ° c के एक अंतिम चरण के लिए 10 मिनट.
    3. १.०% agarose में ट्रो द्वारा पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण ।
    4. टी आसान वेक्टर और अनुक्रम में उनके अपेक्षित आकार के साथ पीसीआर अंशों क्लोन लक्ष्य वेक्टर के एक आंशिक अनुक्रम की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए ।

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Representative Results

इस पत्र में, दक्षिणी सोख्ता और पीसीआर का एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो कि एनएम द्वितीय आनुवंशिक प्रतिस्थापन माउस मॉडल की पीढ़ी के लिए माउस es कोशिकाओं में हुई hr घटनाओं की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है, ES कोशिकाओं का उपयोग कर मानव संसाधन मध्यस्थता लक्ष्यीकरण तकनीक आधारित. हालांकि दक्षिणी सोख्ता और पीसीआर, साथ ही पारंपरिक जीन लक्ष्यीकरण प्रौद्योगिकी, व्यापक रूप से कई दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है, उनमें से सफल आवेदन को ध्यान से नियोजित करने की जरूरत है । इन पहलुओं पर विचार किया जा करने के लिए आवश्यक हैं: लंबी और छोटी बाहों की लंबाई, पदों और जांच की लंबाई, जीनोमिक DNAs काटने के लिए उपयुक्त REs, और पीसीआर के लिए प्राइमरों, के रूप में 1 चित्रामें संक्षेप है, जो के लिए उपयोगी है बाद में विश्लेषण । दक्षिणी सोख्ता के एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में, तैयार और पचा जीनोमिक DNAs जांच द्वारा पता लगाने के लिए डीएनए जेल पर अलग किया जा करने के लिए आवश्यक हैं । क्योंकि जीनोमिक DNAs अलग लंबाई के साथ टुकड़े का एक बहुत में काट रहे हैं, वे डीएनए जेल पर एक धब्बा की तरह स्थिति प्रदर्शित, जीनोमिक DNAs के एक पूर्ण पाचन का सुझाव, के रूप में चित्रा 2में संकेत दिया । दक्षिणी सोख्ता के अंतिम चरण के रूप में, एक रेडियोधर्मिता का संकेत-एक लक्ष्य डीएनए टुकड़ा के साथ जांच hybridizing लेबल फिल्म है, जो es क्लोन में मानव संसाधन की घटनाओं की घटना को प्रतिबिंबित पर दिखाया जाता है, जिससे यह दर्शाता है कि एक es क्लोन एक वांछित है । इस अध्ययन में डिजाइन के अनुसार, रूपांतरित एलील के साथ ES क्लोनों दो अलग आकार बैंड है, जबकि जंगली प्रकार ES क्लोन केवल एक बैंड है, वांछित ES क्लोन सुझाव heterozygous (चित्रा 3) हैं । प्रक्रिया और दक्षिणी सोख्ता के परिणामों के सापेक्ष, पीसीआर के संचालन और परिणाम सरल और प्रत्यक्ष कर रहे हैं । पीसीआर रिएक्शन के बाद ही पीसीआर प्रॉडक्ट्स का डीएनए जेल पर विश्लेषण किया जा सकता है । यदि पीसीआर बैंड विशिष्ट है और अनुक्रमणित पीसीआर उत्पादों के एक आंशिक अनुक्रम की उपस्थिति की पुष्टि करता है, जैसे कि एक नव प्रतिरोध जीन के रूप में, साथ ही जीनोमिक क्षेत्रों है कि बस समरूपता बांह के बाहर हैं, मानव संसाधन घटनाओं की घटना हो सकती है अपेक्षित और सत्यापित (चित्रा 4).

Figure 1
चित्रा 1 : लक्ष्यीकरण निर्माण । यह एक योजनाबद्ध कई लक्ष्यीकरण के निर्माण की पीढ़ी का प्रदर्शन है । वन्या-प्रकार (WT) Myh9 जीन एलील, जीन लक्ष्यीकरण वेक्टर, प्रतिस्थापन exogenous अभिव्यक्ति कैसेट (ओं), और परिणामी एलील (ओं), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जांच के रूप में (एल. पी., आरपी) दक्षिणी दाग और पीसीआर के लिए प्राइमर (P1, P2), और दिखाए जाते है पहले वर्णित 27. एक्सॉन 2 पर एक तीर शोधों की दीक्षा स्थल को इंगित करता है । मानव संसाधन की सफल घटना के बाद, प्रतिस्थापन अभिव्यक्ति कैसेट और निओमायसिन प्रतिरोध जीन (नवआर) की शुरुआत ATG codon के बस 5 ' डाला जाता है । इसलिए, अंतर्जात Myh9 एलील बाधित है और में खटखटाया-जीन (ओं) है/उत्परिवर्ती कोशिकाओं और चूहों में व्यक्त कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : पच जीनोमिक DNAs के साथ डॅा I. ES क्लोन से जीनोमिक DNAs के निर्माण के साथ लक्षित NMHC द्वितीय जगह द्वितीय-बी के साथ एक के साथ पचा रहे है डॅा मैं और, तो, ट्रो द्वारा एक agarose जेल पर अलग । एक धब्बा-जैसे पचता gDNA मनाया जाता है । C1-C8 व्यक्तिगत ES क्लोन दर्शाते हैं । gDNA का एक पूरा पाचन एक अलग लंबाई के साथ डीएनए टुकड़े का एक बहुत पैदा करता है, जिससे एक धब्बा छवि की तरह प्रदर्शित । यह परिणाम तैयार gDNAs की अच्छी गुणवत्ता और पाचन की पूर्णता को भी दर्शाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : दक्षिणी सोख्ता के प्रतिनिधि परिणाम । इन पैनलों ES क्लोन से जीनोमिक DNAs के एक दक्षिणी सोख्ता स्क्रीनिंग दिखाने के NMHC द्वितीय की जगह के निर्माण के साथ लक्षित-एक द्वितीय अटल बिहारी के साथ, वाम और सही जांच का उपयोग कर । जब WT ९.७ kb बैंड से पता चलता है बाईं जांच या सही जांच उपयोग किया जाता है, जब रूपांतरित एलील एक १२.१ kb या 6 kb बैंड से पता चलता है । एम: मार्कर; PC1-PC5: सकारात्मक क्लोन; नेकां: नकारात्मक क्लोन । दक्षिणी सोख्ता बैंड के आकार भी संकेत कर रहे हैं । दक्षिणी सोख्ता की सभी प्रक्रियाओं को कड़ाई से बाहर किया जाता है और जांच की विशिष्टता काफी अच्छी है; कोई न कोई विशिष्ट बैंड अपेक्षित बैंड के लिए अपेक्षा की जानी चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : पीसीआर के प्रतिनिधि परिणाम । यह पैनल NMHC द्वितीय की जगह के निर्माण के साथ लक्षित ES क्लोन से जीनोमिक DNAs की पीसीआर पहचान दिखाता है-ए के साथ द्वितीय-बीए प्राइमर जोड़ी P1 + P2 का उपयोग कर । रूपांतरित एलील एक २.१ केबी बैंड पैदावार, जबकि WT एलील कोई बैंड पैदावार । एम: मार्कर; PC1-PC3: सकारात्मक क्लोन; नेकां: नकारात्मक क्लोन । पीसीआर बैंड का साइज भी दर्शाया गया है । के बाद से प्राइमरों केवल रूपांतरित एलील का पता लगाने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, एक एकल और उंमीद बैंड की उपस्थिति प्राइमरों की विशिष्टता और तैयार gDNAs के उच्च गुणवत्ता को दर्शाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

वर्तमान में, जीनोम संपादन के लिए डिजाइनर nucleases अभी भी ES सेल की जगह नहीं कर सकते है आधारित जीन-लक्ष्यीकरण के अपने मुद्दों के कारण प्रौद्योगिकी बंद लक्ष्य प्रभाव है, और एक लंबे डीएनए टुकड़ा30,31डालने में कठिनाई । माउस ES कोशिकाओं में हुई HR घटनाओं की पहचान करने के लिए सुनहरा तरीकों के रूप में, इस रिपोर्ट के क्षेत्र के लिए दक्षिणी सोख्ता और पीसीआर का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है । हम निर्माण की एक श्रृंखला के साथ लक्षित माउस ES कोशिकाओं से व्यक्तिगत क्लोन का विश्लेषण करके इन तरीकों की विश्वसनीयता की पुष्टि की । वांछित ES इन विधियों द्वारा की पहचान क्लोन सफलतापूर्वक संगत माउस मॉडल उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था27।

हालांकि लक्षित ES क्लोनों की स्क्रीनिंग के लिए अंय तकनीकों19,३२, दक्षिणी सोख्ता और पीसीआर की विधियों का वर्णन किया गया है पूरी तरह से उन की स्थापना के बाद३२की जगह नहीं किया जा सकता है, क्योंकि इन प्रारंभिक तकनीक एक अब लागू इतिहास है और व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते है और वैज्ञानिक समाज द्वारा की पुष्टि की, सबसे जैविक प्रयोगशालाओं द्वारा प्रदर्शन किया, और अंय प्रौद्योगिकियों के मूल हैं । महत्वपूर्ण बात यह है कि एचआर की घटनाओं की पहचान में दक्षिणी सोख्ता और पीसीआर का अच्छा प्रदर्शन पिछले काम29में अच्छी तरह से उदाहरण है । दक्षिणी सोख्ता से परिणाम कई अनूठी विशेषताओं से संकेत मिलता है: बेतरतीब ढंग से ES क्लोनों में, उनमें से ९०% से अधिक वांछित हैं, कोई विशिष्ट बैंड का पता लगाया है, और मानव संसाधन तरजीही Myh9 जीन के एक एलील पर हुई । इस बीच, पीसीआर से डेटा अनुक्रमण के साथ, की पुष्टि करें कि मानव संसाधन घटनाओं की घटना साइट विशेष है और अच्छी तरह से दक्षिणी सोख्ता से उन लोगों के साथ मैच ।

हमारे अभ्यास के अनुसार, कई कारकों पर विचार किया जाना चाहिए जब दक्षिणी सोख्ता और पीसीआर ES कोशिकाओं में मानव संसाधन की घटनाओं की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है, जिससे अच्छे और अपेक्षित परिणाम प्राप्त करने । पहले एक समरूपता बाहों की लंबाई है; सामांय में, समरूपता हाथ लंबाई बढ़ाने से एचआर३३की क्षमता में वृद्धि होगी । हालांकि, यह हमेशा मामला नहीं है । एक तरफ, अब हथियार हेरफेर की कठिनाई में वृद्धि; दूसरी ओर, समरूपता बाहों की लंबाई (बाएं हाथ के लिए 4 kb और दाईं भुजा के लिए १.७ kb) यहाँ रिपोर्ट की गई उच्चतम मानव संसाधन आवृत्ति अब तक इसी तरह के प्रयोगों के बीच में हुई. इसके अतिरिक्त, समरूपता हथियारों की एक उचित लंबाई पीसीआर द्वारा पहचान की सुविधा । दूसरा समरूपता हथियार और दक्षिणी सोख्ता जांच३४की तैयारी के लिए isogenic डीएनए का उपयोग है । इस जीन के क्षेत्र युक्त एक बीएसी क्लोन आदेश द्वारा संतुष्ट किया जा सकता है-ब्याज या लक्षित किया जा करने के लिए इरादा कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए का उपयोग करके. तीसरे जीनोमिक DNAs को पचाने के लिए उपयुक्त REs का चयन होता है. सामांय में, एक पुनः या दो REs कि जंगली-प्रकार या उत्परिवर्ती एलील केवल एक या दो बार के आसपास लक्ष्यीकरण क्षेत्र में कटौती का संयोजन पसंद कर रहे हैं; इसके अलावा, परिणामी बड़ा डीएनए टुकड़ा 15 kb से अधिक नहीं होना चाहिए और अलग डीएनए टुकड़े के बीच आकार अंतर 2 kb से अधिक है । इन आवश्यकताओं जुदाई और दक्षिणी सोख्ता द्वारा अपेक्षित बैंड की पहचान की सुविधा कर सकते हैं । चौथा है जांच की लंबाई और जीनोम में अन्य दृश्यों के साथ कम ही समानता । सामान्यत: जांचों की लंबाई 500 – 1000 बीपी होती है । जीनोम में अन्य दृश्यों के साथ समानता NCBI विस्फोट कार्यक्रम के साथ विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अलावा, एक सॉफ्टवेयर दक्षिणी सोख्ता के लिए जांच डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल किया३५बताया गया है । पांचवें पहलू पर विचार किया जा करने के लिए पारंपरिक तरीकों का उपयोग करने के लिए एक बढ़ाने उपज के लिए जीनोमिक डीएनए तैयार है । जीनोमिक एक ४८-अच्छी तरह से थाली की एक धाराप्रवाह अच्छी तरह से तैयार DNAs दक्षिणी सोख्ता विश्लेषण के कम से कम दो दौर के लिए आम तौर पर पर्याप्त हैं । पीसीआर के लिए प्राइमरों डिजाइनिंग के रूप में, सबसे अच्छी रणनीति के लिए लक्ष्यीकरण शस्त्र के बाहर एक प्राइमर के साथ संयोजन के रूप में चयन मार्कर पर मौजूद एक किताब का उपयोग करने के लिए है । इसके अतिरिक्त, पीसीआर उत्पादों sequencing HR घटनाओं20,३६साबित करने के लिए महत्वपूर्ण है । विशेष रूप से, पीसीआर आधारित स्क्रीनिंग पूरी तरह से दक्षिणी सोख्ता के माध्यम से प्राप्त जानकारी की जगह नहीं है, जबकि यह प्रभावी ढंग से क्लोन की संख्या को कम कर सकते है मूल्यांकन किया जा सकता है ।

निष्कर्ष में, दक्षिणी सोख्ता और पीसीआर अच्छी तरह से जांच es क्लोन के लिए तरीकों को मानव संसाधन मध्यस्थता जीन की पहचान करने के लिए प्रदर्शन कर रहे है es कोशिकाओं में घटनाओं को लक्षित । हालांकि विस्तृत प्रोटोकॉल यहां वर्णित मुख्य रूप से वांछित एनएम द्वितीय आनुवंशिक प्रतिस्थापन ES क्लोन की स्क्रीनिंग पर ध्यान केंद्रित, यह genotyping चूहों कि बाद में सकारात्मक ES क्लोनों का उपयोग कर उत्पंन कर रहे है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह आसानी से अंय सेल प्रकार, जैसे आईपीएस कोशिकाओं या दैहिक कोशिकाओं में मानव संसाधन घटनाओं की पहचान के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (पलाश सं. ३१५७१४३२) के जनरल प्रोग्राम, चीन के मानव प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रांट नो 2015JC3097), और रिसर्च फाउंडेशन ऑफ एजुकेशन ब्यूरो के हुनान से समर्थन मिला । प्रांत, चीन (ग्रांट नो. 15K054).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BAC CLONE BACPAC Resources Center (BPRC) bMQ-330E21
QIAGEN Large-Construct Kit QIAGEN 12462
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27104
QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit QIAGEN 12963
PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase Agilent 600382
T-easy vector Promega A1360
Nuclei Lysis Solution Promega A7941
Protein Precipitation Solution Promega A7951
DNA Denaturing Solution VWR 351-013-131
DNA Neutralizing Solution VWR 351-014-131
Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) VWR 27-9240-01
UltraPure SSC, 20x Thermo Fisher 15557036
UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Fisher 15593031
G418 Thermo Fisher 10131035
Salmon Sperm DNA Solution Thermo Fisher 15632011
Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity Thermo Fisher 11304029
Not I Thermo Scientific ER0592
Dra I Thermo Scientific ER0221
EcoR I Thermo Scientific ER0271
Ganciclovir Sigma G2536
Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits Fisher Scientific 09-301-188
[α32P]dCTP PerkinElmer NEG013H100UC
ProbeQuan G-50 Micro Columns GE Healthcare 28-9034-08
Hybrisol I Hybridization Solution Millipore S4040
Kodak X-Ray Film Z&Z Medical 844 5702

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References

  1. Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
  2. Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
  3. Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
  4. Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
  5. Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
  6. Van, dW. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
  7. Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
  8. Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
  9. Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
  10. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
  11. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
  12. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
  13. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
  14. Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
  15. Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
  16. Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
  17. Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
  18. Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
  19. Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
  20. Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
  21. Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
  22. Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
  23. Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
  24. Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
  25. Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
  26. Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
  27. Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
  28. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
  29. Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
  30. Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
  31. Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
  32. Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
  33. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
  34. Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
  35. Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
  36. Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).

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