Summary
توفر هذه المقالة طريقة فعالة ومجدية لبناء أوراق الخلايا الجذعية متعددة الطبقات مع خاصية الخلايا الجذعية مواتية.
Abstract
العلاج بالخلايا الجذعية يظهر مبشرة بالخير مستقبلا في تجديد الجهاز المصاب والأنسجة، وقد وضعت الخلية ورقة تقنية لتحسين استبقاء خلية منخفضة وبقاء الفقراء داخل المنطقة الهدف. ومع ذلك، أثناء عملية البناء في المختبر ، إيجاد حل للحفاظ على الخلايا الجذعية بيواكتيفيتي وزيادة حجم الخلية داخل الخلية الورقة حاجة ملحة. هنا، يقدم هذا البروتوكول طريقة لبناء ورقة خلية متعددة الطبقات مع بيواكتيفيتي الخلايا الجذعية مواتية وقابلية التشغيل الأمثل. تامور الخنزيري ديسيلولاريزيد (الحزب الديمقراطي التقدمي) أعدها phospholipase طريقة ديسيلولاريزيشن2 (جيش التحرير الشعبي الصيني2) سقالة خلية ورقة، وهي معزولة الفئران نخاع العظام الخلايا الجذعية الوسيطة (بمسكس) وتوسيع كخلايا المصنف. يتكون هيكل ورقة مؤقتة الخلية متعدد الطبقات باستخدام RAD16--أنا هيدروجيل الببتيد. وأخيراً، هو مثقف الورقة خلية مع نظام التروية دينامية لتحقيق الاستقرار في هيكل ثلاثي الأبعاد (3D)، والورقة الخلية يمكن الحصول عليها بعد ثقافة 48 ساعة في المختبر. هذا البروتوكول يوفر طريقة فعالة ومجدية لبناء ورقة خلايا الجذعية المتعددة الطبقات، والورقة خلية يمكن تطويرها كمنتج علاج بخلايا الجذعية مواتية في المستقبل.
Introduction
وقد تم الإبلاغ عن العلاج بالخلايا الجذعية كعلاج فعال للعديد من الأمراض؛ ومع ذلك، استبقاء خلية منخفضة وبقاء الفقراء داخل المنطقة الهدف تظل القضايا الحرجة بعد حقن الخلايا الجذعية التقليدية. لحل هذه المشكلة، وضع علماء هندسة الأنسجة خلية ورقة تقنية. أعدت ورقة خلية مونولاييريد مع المصفوفة خارج الخلية سليمة أولاً باستخدام طبق ثقافة الاستجابة لدرجة الحرارة1، وأفادت به دراسات المتابعة تحسينات هامة للاحتفاظ بالخلايا الجذعية، والبقاء على قيد الحياة داخل إينفاركتيد المجال2،3. من بين الأساليب، سجلت بناء الورقة خلية متعددة الطبقات كاستراتيجية فعالة لتحسين بقاء الخلية والخلية ورقة التأثير العلاجي3،4. ومنذ ذلك الحين، عملت العلماء على تطوير أساليب التشييد ورقة خلية مختلفة بغية زيادة حجم الخلية وخاصية الخلايا الجذعية، والخاصية الميكانيكية صحائف الخلية. وحتى الآن، تم تشييد أنواع معينة من خلية ورقة ودرس في علاج احتشاء عضلة القلب5، إصابة الغضروف6، والجلد الجرح7.
بيواكتيفيتي الخلايا الجذعية قبل الزرع وأظهرت تأثير ناشئة على تجديد الأنسجة المتضررة، واستراتيجيات بناء الورقة خلية مختلفة لها تأثيرات مختلفة على الخلايا الجذعية. من ناحية، أوراق خلية المتلاقية فقط يتألف من خلايا جذعية عالية الكثافة، ومصفوفات خارج الخلية الطبيعية يمكن الحصول عليها ب أوراق خلية مونولاييريد التراص8 أو بواسطة استخدام تقنيات هندسة الأنسجة المغناطيسية9. من ناحية أخرى، طور الباحثون السقالات مختلفة توفير قوة ميكانيكية كافية ودعم الخلية النمو10،11،12، مما يسمح لخلايا الجذعية منخفضة البذر الكثافة لضمان التغذية الإمداد. على الرغم من هذه النهج، إمدادات التغذية كفاءة منخفضة داخل هيكل الخلية متعدد الطبقات ورقة زال شاغلا رئيسيا خلال عملية التشييد في المختبر . ولذلك، مطلوب على وجه السرعة نظام بناء ورقة خلية فعالة ومجدية.
ويصف هذا البروتوكول خطوات لإعداد ورقة خلية من خلايا الجذعية (MSC) مولتيلاييريدميسينكهيمال. في هذا النظام من البناء، خلية ورقة قوة ميكانيكية يتم توفيرها من قبل النيابة العامة. وبناء على هذه السقالة، هيكل الخلية 3D يمكن بسرعة بناؤها مع RAD16--أنا هيدروجيل الببتيد، ونظام التروية حيوي يستخدم للثقافة الورقة خلية متعددة الطبقات، بغية تحقيق الاستقرار في هيكل الخلية 3D ورقة وتوفير التغذية الكافية إمدادات للخلايا. باستخدام هذا النظام، تم بنجاح إعداد ورقة بمسك متعدد الطبقات وأظهرت تأثير علاجية مثلى على نموذج احتشاء عضلة القلب الفئران13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الخلايا الجذعية وإجراءات التجربة الحيوانية كانت تجري وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية "الدليل الوطني" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ووافقت عليها لجنة الاستخدام (قوانغتشو، الصين) وجامعة جينان العناية بالحيوان.
1-إعداد السقالة النيابة العامة مع ديسيلولاريزيشن2 جيش التحرير الشعبي الصيني الأسلوب14
ملاحظة: انظر الشكل 1A لتخطيطي للأسلوب ديسيلولاريزيشن2 جيش التحرير الشعبي الصيني.
- تحضير 100 مل من جيش التحرير الشعبي الصيني يو/مليلتر 2002 الحل. إضافة 0.5 غ من ديوكسيتشولاتي الصوديوم و 2 مل من جيش التحرير الشعبي الصيني2 مل 198 من كربونات المخزن المؤقت الحل. يجب استخدام هذا الحل خلال 24 ساعة بعد التحضير لها.
- الحصول على تامور النقانق الطازجة (FPP) من المسلخ والعودة إلى المختبر ضمن ح 1.
ملاحظة: يجب تخزين عبوات كاملة في 4 درجات مئوية أثناء النقل. ينبغي أن تنفذ الخطوات 1.2-1.10 بالهز المستمر في حمام مائي تسيطر على الحرارة. - أغسل جيدا عبوات كاملة مع 200 مل من الفوسفات المخزن المؤقت الحل (PBS) التي تحتوي على 1% البنسلين-ستربتوميسين في كوب 500 مل في 10 ° كفور 10 دقيقة كرر هذه الخطوة 2 x.
- انقسام في عبوات كاملة إلى طبقتين وإزالة الأنسجة الدهنية مع ملقط ومقص.
ملاحظة: الاحتفاظ FPP الرطب بإضافة 50 مل من برنامج تلفزيوني كل 20 دقيقة أثناء إزالة الأنسجة الدهنية. - الشكل في عبوات كاملة إلى 10 × 10 سم2 قطعة بالمقص. أغسل FPP مع 200 مل من كربونات المخزن المؤقت الحل (CBS) التي تحتوي على 1% البنسلين-ستربتوميسين في كوب 500 مل في 10 درجة مئوية للحد الأدنى 10 كرر هذه الخطوة 2 x.
- نقل في عبوات كاملة للمياه النقية ونقع عليه في 10 درجة مئوية ح 12.
- نقع العينات2 10 × 10 سم في 50 مل من شبكة سي بي إس التي تحتوي على 2002 من جيش التحرير الشعبي الصيني يو/مليلتر والحل ديوكسيتشولاتي الصوديوم 0.5% (w/v) عند 37 درجة مئوية ح 6.
- تغسل العينات مع شبكة سي بي إس التي تحتوي على 1% البنسلين-ستربتوميسين في 10 درجة مئوية للحد الأدنى 10 تكرار هذه الخطوة 2 x.
- نقع كل عينة في 50 مل من شبكة سي بي إس التي تحتوي على 2002 من جيش التحرير الشعبي الصيني يو/مليلتر والحل ديوكسيتشولاتي الصوديوم 0.5% (w/v) عند 37 درجة مئوية ح 2.
- تغسل العينات مع شبكة سي بي إس التي تحتوي على 1% البنسلين-ستربتوميسين في 10 درجة مئوية ل 2 حاء كرر هذه الخطوة من أجل 10 x على الأقل. وضع العينات على لوحات مسطحة وتجفيفها بوزن ثابت في فرن درجة حرارة ثابتة عند 55 درجة مئوية.
ملاحظة: العينة يحتاج إلى أن يجف تماما. وزن العينة الحزب الديمقراطي التقدمي كل 10 دقيقة، وكرر أن 3 x، أو حتى الوزن لن يتغير. - شكل كل عينة الحزب الديمقراطي التقدمي في دائرة قطرها 10.5 ملم مع تريفيني. حزمة كل الحزب الديمقراطي التقدمي في حقيبة مختومة عقيمة.
- تعقيم العينات الحزب الديمقراطي التقدمي تشعيع جاما (كان 25). تخزين العينات النيابة العامة عند 4 درجة مئوية قبل الاستخدام.
ملاحظة: يمكن تخزين جميع العينات لمدة تصل إلى ستة أشهر في 4 درجات مئوية.
2-الأعمال التحضيرية للخلية ورقة البناء
- اﻷوتوكﻻف جميع الصكوك ومكونات النسيج الناقل في 121 درجة مئوية لاسنان و 30 دقيقة، بما في ذلك 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي، الملقط، الملقط، مقص، الأسود القواعد (النسيج الناقل مكون)، وحلقات التوتر الأبيض (النسيج الناقل مكون).
- إعداد 20 مل محلول السكروز 10% خالية من جرثومة. الوزن 2 ز السكروز وحل السكروز في 18 مل من الماء عالي النقاوة. اﻷوتوكﻻف محلول السكروز 10% في 121 درجة مئوية 30 دقيقة أو التصفية الحل مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
- اﻷوتوكﻻف أجهزة النظام نضح دينامية في 121 درجة مئوية مدة 30 دقيقة، بما في ذلك غاز تبادل المعدات وزجاجة زجاج 500 مل ووعاء ثقافة نضح وأنابيب الضام.
- إعداد الصكوك يعقم والأنسجة المكونات الناقل. وضع الجزء الأساسي الأسود الناقل الأنسجة في صحن ثقافة.
- التقاط سقالة التقدمي مجففة ووضعها في مركز قاعدة سوداء. وضع خاتم توتر بيضاء على سقالة النيابة العامة وإصلاحها في الناقل الأنسجة.
ملاحظة: تأكد من السقالة ثابت تماما في النسيج الناقل ولا توجد فجوة بين قاعدة الأسود والطوق الأبيض التوتر. إذا لم يكن كذلك، فصل الناقل الأنسجة وإصلاح السقالة مرة أخرى. - إضافة 100 ميليلتر من مستنبت على سقالة الحزب الديمقراطي التقدمي الإماهة.
ملاحظة: إذا لم يتم إصلاح السقالة جيدا في الناقل الأنسجة، سوف التسلل المتوسطة الثقافة الطبق الثقافة. - وضع السقالة في حاضنة 37 درجة مئوية، والسماح ينقع لمدة 15 دقيقة.
3-إعداد الخلايا لخلية ورقة البناء
ملاحظة: هذا البروتوكول خلية ثقافة استخدام طبق 100 مم. راجع 1B الشكل تخطيطي لتشييد هيكل الخلية متعدد الطبقات.
- عزل بمسكس13.
ملاحظة: يهدف هذا الأسلوب لإنشاء ورقة خلية ماجستير متعدد الطبقات. بمسكس الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول. بمسكس معزولة باستخدام الأسلوب ملتصقة نخاع العظام كلها، وبمسكس الموسعة في المختبر للحصول على ما يكفي المبلغ خلية.- اﻷوتوكﻻف الصكوك في 121 درجة مئوية و 30 دقيقة، بما في ذلك ملقط, ملقط مسنن، ومقص. إعداد 2 مل حقن حقنه والمتوسطة الثقافة بمسك (دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة [دميم] 10% مصل بقرى الجنين، الجلوتامين 1% والبنسلين-ستربتوميسين 1%).
- Euthanize عمرها ثلاث الأسبوع ذكور الفئران سبراغ داولي (SD) بخلع فقرة سرطان عنق الرحم. ينقع الحيوان في 100 مل من 75 ٪ الكحول الحل في كوب لمدة 5 دقائق.
- إخراج الحيوان الكأس ووضعه عرضه على طاولة العمليات. جداً الجلد على الجزء الخلفي الحيوان مع مقص وملقط. عزل أنسجة العضلات والجلد لفضح قصبة الفخذ.
- عزل قصبة الفخذ ووضعها في 30 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب الطرد مركزي 50 مل. ضع اثنين الفخذ قصبة في أنبوب واحد. دوامة أنبوب الطرد المركزي لغسل الأنسجة جيدا. كرر هذه الخطوة 2 x.
- قص طرفي قصبة مع المقص وفضح تجويف نخاع.
- نضح 2 مل من بمسك الثقافة المتوسطة مع حقنه حقن. إدخال الإبرة في تجويف نخاع وطرد نخاع العظام مع الثقافة المتوسطة. طرد كل قصبة الفخذ اثنين في صحن الثقافة 100 مليمتر واحد.
- لكل طبق الثقافة 100 مم، إضافة 2 مل من الثقافة المتوسطة في الطبق الثقافة. وضع الطبق الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية وثقافة ثابتة ح 72.
- أخرج الطبق الثقافة من الحاضنة. يستعاض عن المادة طافية مع 6 مل من جديد الثقافة المتوسطة.
- مراقبة بمسكس الأولية تحت مجهر. وفي أعقاب ذلك، المرور بمسكس د كل 5-7.
- تأخذ الخلايا خارج الحاضنة. مراقبة الخلايا تحت مجهر، واختر خلايا مناسبة لخلية ورقة البناء. عندما تصل بمسكس إلى التقاء 80% إلى 90%، ويمكن اختيار الخلايا كخلايا المصنف.
- إزالة المتوسطة الثقافة من طبق الثقافة. تغسل بلطف الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني الحارة. إزالة برنامج تلفزيوني جميع من طبق الثقافة ويظل بالتأكيد لا السائل. إضافة 2 مل التربسين 0.25% (أو آخر حل ديسوسياتينج) إلى الطبق واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- إيقاف التأثير التربسين عن طريق إضافة 2 مل متوسط الثقافة، وتغسل بلطف الخلايا من الطبق. نقل تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي 15 مل جديدة. سينتريفوجاتي الخلايا في 225 x ز لمدة 5 دقائق.
- إزالة المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا مع 3 مل محلول السكروز 10% (w/v).
ملاحظة: يتم استخدام محلول السكروز 10% (w/v) لغسل الخلايا من أجل الحصول على خليط المائية خلية موحدة في الخطوات التالية. - نضح 10 ميليلتر من تعليق خلية وحساب عدد الخلايا مع هيموسيتوميتير. حساب حجم اللازمة للخطوة التالية. وتستخدم لكشف خلية واحدة، بمسكس 3 مليون.
- استخراج خلايا 3 مليون وتحويلها إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل جديدة. الطرد المركزي الخلايا في 225 x ز لمدة 5 دقائق.
- إزالة المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا مع 1 مل محلول السكروز 10% (w/v). نقل تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل.
ملاحظة: استخدام أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل مفيدة لإعداد الخليط خلية-المائية. - الطرد المركزي الخلايا في 260 xز 5 دقيقة تماما إزالة المادة طافية والحصول على الرواسب الخلية.
4-إعداد في بمسكس وفي RAD16--أنا خليط Hydrogel الببتيد
ملاحظة: انظر الشكل 1B لتخطيطي لتشييد هيكل الخلية متعدد الطبقات.
- إضافة 20 ميليلتر من محلول السكروز 10% (w/v) إلى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي. بلطف ريسوسبيند بمسكس والحصول على تعليق موحدة.
ملاحظة: لا تولد أي فقاعات أثناء استثارة. - إضافة 20 ميليلتر من RAD16--أنا هيدروجيل الببتيد في الجزء العلوي من التعليق. يحرك برفق في RAD16--أنا تعليق الببتيد وخلية بطرف ماصة. عندما تختلط معا في تعليق خلية والمائية، بلطف "الماصة؛" الخليط بضع مرات.
- إخراج سقالة النيابة العامة من الناقل الأنسجة ولطف نضح المتوسطة الثقافة مع تلميح ماصة.
ملاحظة: تأكد من السقالة التقدمي هو امهاء تماما قبل إضافة الخليط خلية-المائية. - نضح الخليط وإضافته بالتساوي على سقالة النيابة العامة.
ملاحظة: يكون الحجم الكلي للمخلوط عن 40-50 ميليلتر. ينصح بإضافة ميليلتر المخلوط 10 في وقت واحد من المركز إلى خارج السقالة. - أضف 1 مل من الثقافة المتوسطة إلى الجزء السفلي من الناقل الأنسجة. وضع الورقة الخلية الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إخراج الورقة خلية من الحاضنة. بلطف بإضافة 4 مل من الثقافة المتوسطة في الطبق الثقافة وتزج في خلية ورقة. وضع الورقة الخلية الحاضنة 37 درجة مئوية ح 2 ثقافة ثابتة.
5-الثقافة في المختبر لورقة خلية متعددة الطبقات ثلاثية الأبعاد باستخدام نظام ثقافة ديناميكية
ملاحظة: انظر الشكل 1 لتخطيطي منظومة دينامية 3D.
- تحضير النظام نضح الحيوية، بما في ذلك مضخة تمعجية وغاز تبادل المعدات وزجاجة زجاج 500 مل، حاوية ثقافة نضح وأنابيب الضام. تجميع نظام التروية ديناميكية كما هو مبين في الشكل 2.
- إضافة 200 مل من الثقافة المتوسطة إلى زجاجة معقمة. أدخل الورقة خلية في قاعة الثقافة الحاوية.
ملاحظة: الاهتمام باتجاه السطح العلوي للورقة الخلية. - أضف 3 مل من الثقافة المتوسطة في حاوية الأنسجة وإغلاق الحاوية. وضع نظام التروية دينامية في الحاضنة وبدء تشغيل المضخة. تعيين معدل تدفق مضخة تمعجية الساعة 8 مل/دقيقة ثقافة الورقة الخلية في نظام التروية دينامية ح 48.
6-الحصول على الورقة خلية MSC متعدد الطبقات
- اﻷوتوكﻻف بالصكوك والنسيج الناقل المكونات في 121 درجة مئوية مدة 30 دقيقة، بما في ذلك أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل والملقط وملقط مسنن.
- سحب مجرى هواء الإدخال من زجاجة لوقف الإمداد بالثقافة المتوسطة إلى الحاوية.
ملاحظة: إيقاف مضخة تمعجية عندما الحاوية الثقافة فارغة. - إخراج الورقة خلية من الحاوية الثقافة ووضعها في صحن ثقافة.
- استخدام الملقط واحدة لشل الناقل الأنسجة واستخدم ملقط مسنن آخر لفصل حلقة التوتر بيضاء من قاعدة سوداء. وأخيراً، الحصول على الورقة خلية بمسكس متعدد الطبقات.
- للحفاظ على القصير، يمكن نقلها إلى أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل كل ورقة الخلية مع الملقط. يجب إلحاق سقالة الحزب الديمقراطي التقدمي بالجدار الداخلي لأنبوب الطرد المركزي، ويجب أن ينتشر خلية ورقة الخروج بقدر الإمكان في أنبوب الطرد المركزي.
- بلطف إضافة 1 مل من الثقافة المتوسطة في أنبوب الطرد المركزي أن تزج في خلية ورقة. أغلق غطاء أنبوب الطرد المركزي وتخزين الورقة الخلية عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: ينبغي زرعها الورقة خلية أو تحليلها في أقرب وقت ممكن. من المستحسن استخدام ورقة خلية ضمن ح 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد في الشكل 1التخطيطي التشييد ورقة الخلايا الجذعية متعددة الطبقات. إعداد السقالة ورقة الخلية بواسطة الأسلوب ديسيلولاريزيشن2 جيش التحرير الشعبي الصيني هو الخطوة الأولى. بناء على السقالة، شيد هيكل خلية 3D مؤقتة بخلط الخلايا الجذعية مع hydrogel الببتيد RAD16-1. من أجل الحصول على ورقة خلية متعددة الطبقات مع بيواكتيفيتي الخلايا الجذعية مواتية والقوة الميكانيكية الأمثل، هو مثقف الورقة الخلية في نظام التروية دينامية. تحت إمدادات التغذية الحيوية، مسموح بالخلايا الجذعية تتكاثر وإقامة اتصالات خلية ضمن ورقة خلية متعددة الطبقات، ويمكن الحصول على المنتج النهائي خلية متعددة الطبقات مستقرة الورقة بعد ~ 24--72--زراعة ساعة.
في هذه الحالة، سقالة خلية ورقة مستعدة مدير النيابة العامة بجيش التحرير الشعبي الصيني2 ديسيلولاريزيشن الأسلوب. مظهر المجففة الحزب الديمقراطي التقدمي شقة وسلس، وشبه شفاف (الشكل 3A). نظراً لتأثير معين من جيش التحرير الشعبي الصيني2، الخلايا غير متجانسة يمكن تماما إزالة بينما أولتراستروكتوري الكولاجين الطبيعية داخل الحزب الديمقراطي التقدمي سقالة يتم الحفاظ عليها جيدا (الشكل 3B)، وهذا أمر مهم للحفاظ على القوة الميكانيكية وتوافق مع الحياة من السقالة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل السقالات كنظام الإفراج عن عنصر تحكم عامل النمو لدعم نمو الخلايا الجذعية وتحسين في فيفو التجديد13.
عندما تصل الخلايا الجذعية إلى التقاء ~ 80% إلى 90%، الخلايا معزولة من طبق الثقافة وغسلها بمحلول سكروز 10%. بعد الطرد المركزي، تختلط الخلايا RAD16--أنا هيدروجيل الببتيد وإضافتها إلى سقالة النيابة العامة ريهيدراتيد. يتكون هيكل متعدد الطبقات مؤقت عقب ثقافة ثابتة ساعتين. وأخيراً، يكتسب المنتج ورقة بمسك متعدد الطبقات (الشكل 4) بعد ثقافة 48 ساعة في نظام التروية دينامية. بدعم السقالة الحزب الديمقراطي التقدمي، الورقة خلية يمكن معالجته بسهولة مع الملقط، وأنه يمكن مؤقتاً الحفاظ على ثقافة المتوسط في أنبوب 1.5 مل عند 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات قبل الفحص أو زرع (الشكل 4). الفلورة تلطيخ يظهر النتيجة، بمسكس إيجابية للغاية للخلايا الجذعية علامات CD90 و CD29. بعد بناء خلية ورقة، بمسكس داخل ورقة خلية متعددة الطبقات تظهر مستويات عالية من CD29 و CD90 (الشكل 5).
الشكل 1 : مخطط بناء الورقة الخلايا الجذعية متعددة الطبقات- (أ) باستخدام الأسلوب2 ديسيلولاريزيد جيش التحرير الشعبي الصيني، يتم تدمير الخلايا غير متجانسة داخل عبوات كاملة حين مصفوفات خارج الخلية الطبيعية يتم الحفاظ عليها جيدا في سقالة النيابة العامة. (ب) استناداً إلى سقالة الحزب الديمقراطي التقدمي، هيكل الخلية متعدد الطبقات المؤقتة هي التي شيدت بخلط الخلايا الجذعية وتجميع ذاتي هيدروجيل الببتيد. (ج) متابعة، هو مثقف الورقة الخلية في نظام ديناميكي ثلاثي الأبعاد، ومن المتوقع أن الخلايا الجذعية تتكاثر وإقامة اتصالات الخلية تحت الإمداد بالتغذية الحيوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الناقل الأنسجة ونظام التروية الديناميكية. (أ) هذا الفريق يظهر 13 ملم-القطر النسيج الناقل. (ب) هذا الفريق يظهر الجمعية نظام التروية الديناميكية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : المظهر وأولتراستروكتوري من الحزب الديمقراطي التقدمي. (أ) هذا الفريق يظهر مظهر السقالات مم 10.5 على النيابة العامة. (ب) هذا الفريق يظهر صورة تمثيلية لنتيجة المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) سقالة النيابة العامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : مظهر الورقة بمسك متعدد الطبقات- (أ) هذا الفريق يظهر مظهر بمسك الطبقات ورقة داخل الناقل الأنسجة. (ب) يعقد الورقة بمسك الطبقات سليمة بالملقط. (ج - د) يمكن الحفاظ على الورقة خلية متعددة الطبقات مؤقتاً في أنبوب 1.5 مل قبل الاستخدام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : الفلورة تلطيخ نتائج التعبير علامات بمسك- (أ) هذا الفريق يظهر الفلورة تلطيخ نتائج بمسكس قبل خلية ورقة البناء. (ب) هذا الفريق يظهر الفلورة تلطيخ النتائج قسم صحيفة بمسك متعدد الطبقات. وأعرب CD90 (أخضر) و CD29 (أحمر) إيجابيا في بمسكس وخلية ورقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول التقارير وسيلة فعالة لبناء ورقة MSC متعدد الطبقات. يسلك هذه الورقة الخلية أمثل القوة الميكانيكية وخلية عالية الكثافة بذر بيواكتيفيتي الخلايا الجذعية مواتية. استخدام بمسكس على سبيل مثال، يتم إنشاء هيكل الخلية 3D بسرعة مع RAD16--أنا هيدروجيل الببتيد. بعد يجري المستزرعة في النظام نضح دينامية، بنجاح الحصول على الورقة بمسك متعدد الطبقات وبمسكس الحفاظ على تعبير عالية من الخلايا الجذعية علامات.
تشييد هيكل الخلية متعدد الطبقات المؤقتة هو الخطوة الحاسمة للبروتوكول. RAD16-ببتيد المائية تجارية، وتتكون من الماء من الأحماض الأمينية و 99% 1%. وأفادت دراسات عدة أن هذا الببتيد المائية يمكن أن تحاكي البيئة الطبيعية إدارة المحتوى في المؤسسة، وهو مفيد للخلايا الجذعية الانتشار والبقاء على قيد الحياة15،،من1617. في هذا البروتوكول، تعليق ماجستير 3 مليون (في 20 ميليلتر من محلول السكروز 10%) كانت مختلطة مع 20 ميليلتر من RAD16--أنا هيدروجيل الببتيد. أن نسبة حجم تعليق خلية والمائية الببتيد هي 1:1. هذا الببتيد المائية حساس لقيمة pH البيئية، وسيشكل جزيئات الببتيد تلقائياً شبكة ثلاثية الأبعاد عند تغير قيمة pH من حمض إلى الحياد. أن سطح الخلية تحتوي على الجسيمات المشحونة، تغيرت الخليط خلية من سائل المائية في فترة زمنية قصيرة، التي لها تأثيرات خلط حتى من الخلايا. مواتية خلية-المائية ينبغي أن خليط حتى تعليق خلية والمائية الببتيد وتمكن الخليط الخلية المراد إضافتها بشكل متساو على السقالة. يمكن تحسين الباحثون حالة المخلوط بتغيير عدد الخلايا في المصنف، وحجم الحل السكروز، وحجم هيدروجيل الببتيد وفقا لاحتياجاتهم الفعلية. فمن الجدير بالاهتمام أن نلاحظ أن غسل الخلايا مع محلول السكروز 10% والاختلاط بالتساوي خليط الخلية-المائية هي الخطوات الحاسمة للبروتوكول، وأن خليط متفاوت يمكن أن يسبب خسارة كبيرة الخلية وبنية متعددة الطبقات مؤقتة غير مستقرة.
بعد إضافة الخليط خلية المائية على سقالة الحزب الديمقراطي التقدمي، القوة الميكانيكية لهيكل الخلية متعدد الطبقات ورقة ضعيف لأن الشبكة المائية الببتيد ليست قوية بما فيه الكفاية للحفاظ على هيكل الخلية متعدد الطبقات الطويلة الأجل، والخلية اتصالات وافرازات ECM ضرورية لتعزيز استقرار الورقة الخلية. وعلاوة على ذلك، يمكن تسهيل تسلل المتوسطة الثقافة ديناميكية الخلايا الجذعية تتكاثر وإقامة اتصالات الخلية داخل هيكل الخلية متعدد الطبقات، في حين سوف تسبب الخلية المبرمج على إمدادات غير كافية من تغذية وتقليل كثافة الخلية خلية ورقة13. ولذلك، المهم نظام التروية دينامية لتحقيق الاستقرار في هيكل الورقة خلية متعددة الطبقات. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تعديل معدل التدفق المناسب للمتوسط الثقافة وفقا لنوع معين من الخلايا الجذعية وخلية البذر الكثافة. أيضا، يظل الاتصال الميكانيكية ضعيفة بين سقالة الحزب الديمقراطي التقدمي، وهيكل الخلية متعدد الطبقات الحد أسلوب البناء الحالي، مما قد يتسبب في تقسيم طبقات الخلايا المتعددة الطبقات والسقالة. ولذلك، كذلك الدراسات مطلوبة لتعزيز توافق مع الحياة الميكانيكية سقالة 3D المائية والسقالة النيابة العامة.
وحتى الآن، تركز على إنشاء كفاءة التغذية توريد نظم في المختبر، مثل كوكولتورينج غشائي الخلايا18 واستخدام سقالة مسامية19علماء هندسة الأنسجة. ومع ذلك، نفاذية التغذية داخل هيكل ثلاثي الأبعاد منخفض في منظومة الثقافة التقليدية ثلاثية الأبعاد ثابتة، وصلاحية الخلايا الجذعية سوف تتأثر إلى حد كبير. وفي هذه الحالة، استخدام نظام التروية دينامية يمكن أن توفر إمدادات كافية من التغذية للحفاظ على سلامة الخلايا الجذعية. باستخدام هذا البروتوكول، ورقة بمسك الطبقات تحسن وظيفة القلب والأوعية في نموذج احتشاء عضلة القلب الفئران13. بناء منتج ورقة خلايا الجذعية مع تحميل خلية عالية وخصائص الخلايا الجذعية مواتية مهم لتجديد الأنسجة. باستخدام هذا الأسلوب كفاءة المركبة، يمكن تشييد أنواع مختلفة من ألواح الخلايا الجذعية متعدد الطبقات بتغيير أنواع الخلايا الجذعية المبذورة، مثل ورقة طلائي الخلايا الجذعية أو الخلايا الجذعية العصبية ورقة ورقة القلب من الخلايا الجذعية. من المتوقع مزيد من الاستكشافات وبدائل للورقة الخلايا الجذعية متعددة الطبقات توسيع نطاق التطبيقات لتجديد الأنسجة أكثر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان تدعمها "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية" (رقم المنحة 31771064)؛ العلوم والتكنولوجيا تخطيط المشروع من مقاطعة قوانغدونغ (منحة الأرقام 2013B010404030 و 2014A010105029 و 2016A020214012)؛ العلوم والتكنولوجيا تخطيط المشروع من قوانغتشو (رقم المنحة 201607010063)؛ والمرحلة الجامعية الابتكار وتنظيم برنامج تدريبي (رقم المنحة 201610559028)؛ المؤسسة الوطنية للعلوم "العلماء الشباب من الصين" (منح رقم 31800819).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phospholipase A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Phosphate buffer | Gibco BRL | 89033 | |
| Penicillin streptomycin / amphotericin | Gibco BRL | 15640055 | |
| Buffer bicarbonate | Sigma-Aldrich | C3041 | |
| Table concentrator | Changzhou Aohua Instrument Co. | KT20183 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
| South American fetal bovine serum | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
| L-Glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| Biosafety cabinet | Esco,Singapore | AC2-2S1 | |
| Constant temperature incubator | Esco,Singapore | CLS-170B-8 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| EP tube | Axygen | 31617934 | |
| Centrifugal machine | TOMOS | 1-16R | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
| Pura Matrix | BD | 354250 | |
| Dynamic perfusion culture system | Minucells and Minutissue | D-93077 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IPC N8 | |
| Pump tubing | Ismatec | Nr.1306 | |
| MINUSHEET 1300 | Regensburg | tissue carrier components | |
| MINUSHEET | Regensburg | dynamic perfusion system | |
| MINUSHEET 0006 | Regensburg | gas exchange equipment | |
| MINUSHEET 0002 | Regensburg | 500 mL glass bottle | |
| MINUSHEET 1301 | perfusion culture container |
References
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).
- Narita, T., et al. The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects. International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).
- Narita, T., et al. The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure. Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).
- Matsuo, T., et al. Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction. Circulation. 128 (22), (2013).
- Alshammary, S., et al. Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction. Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).
- Chen, G. P., et al. The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).
- Cerqueira, M. T., et al. Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).
- Ishii, M., et al. Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).
- Godier-Furnemont, A. F., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Liu, Y., et al. Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction. American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).
- Arana, M., et al. Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction. Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).
- Wang, Y., et al. Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system. Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).
- Wu, Z., et al. The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold. Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).
- Degano, I. R., et al. The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation. Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).
- Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials. Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).
- Cui, X. J., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).
- Jun, I., et al. Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).
- Chen, C. H., et al. Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair. Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).
