Summary
מאמר זה מספק שיטה ריאלי ויעיל עבור בניית מרובה שכבות תאי גזע סדינים עם מאפיינים חיוביים תאי גזע.
Abstract
טיפול בתאי גזע מראה מבטיח עתיד רגנרציה פצוע איברים ורקמות, הטכניקה גיליון תא פותחה כדי לשפר את השמירה תא נמוך ההישרדות המסכן בתוך אזור היעד. עם זאת, במהלך תהליך הבניה במבחנה , פתרון עבור שמירה על תאי גזע אתריים והגדלת הסכום תא בתוך הגיליון התא הוא צורך דחוף. . הנה, פרוטוקול זה מציג שיטה לבניית גיליון תא מרובה שכבות עם תאי גזע חיובית אתריים ו operability אופטימלית. קרום הלב חזירי decellularized (DPP) מוכן על ידי phospholipase שיטה decellularization2 (PLA2) כמו לגרדום גיליון תא, ואני עכברוש מח העצם בתאי גזע mesenchymal (BMSCs) הם מבודדים מורחבת של התאים הזריעה. מבנה גיליון זמני התא מרובה שכבות נבנה באמצעות RAD16-אני הידרוג פפטיד. לבסוף הגליון התא הוא תרבותי עם מערכת דינאמית זלוף לייצב את מבנה תלת-ממדי (3D), הגיליון תא יכול להיות מושגת בעקבות יישום התרבות 48 שעות במבחנה. פרוטוקול זה מספק שיטה ריאלי ויעיל עבור בניית גיליון מרובה שכבות תאי גזע, הגיליון תא ניתן לפתח כמוצר טיפול בתאי גזע חיובית בעתיד.
Introduction
טיפול בתאי גזע דווחה טיפול יעיל למחלות רבות; עם זאת, תא נמוך שימור של הישרדות המסכן בתוך אזור היעד נותרו בעיות קריטיות בעקבות הזרקת תאי גזע מסורתי. כדי לפתור בעיה זו, מדענים הנדסת רקמות פיתח את הטכניקה גיליון התא. גיליון תא monolayered עם מטריצה חוץ-תאית תקין הוכן קודם כל על-ידי שימוש של תרבות צלחת של טמפרטורה-תגובה1ודיווח על מחקרי מעקב על שיפורים משמעותיים של שימור תאי גזע של הישרדות בתוך infarcted אזור2,3. בין השיטות, בניית הגיליון תא מרובה שכבות דווחה אסטרטגיית יעיל לשיפור הישרדות תא ו-3,4האפקט הטיפולי גיליון התא. מאז, מדענים עבדו על פיתוח שיטות הבניה גיליון תא שונים על מנת להגביר את כמות התאים, תאי גזע, והמאפיין מכני הסדינים התא. עד כה, סוגים מסוימים של תא גליון נבנה ולמד בטיפול של אוטם שריר הלב5, סחוס פציעה6, ו7פצע בעור.
Bioactivity של תאי גזע לפני השתלת הראה השפעה המתעוררים על התחדשות רקמות פצוע, תאים שונים גיליון בניית אסטרטגיות יש השפעות שונות על תאי גזע. מצד אחד, confluent תא גליונות כללה רק בתאי גזע בצפיפות גבוהה, יכול לרכוש מטריצה חוץ-תאית טבעית על ידי תא monolayered הערמה גליונות8 או באמצעות טכניקות הנדסת רקמות מגנטי9. מצד שני, פיתחו פיגומים שונים כדי לספק חוזק מכני נאותה ותמיכה תא הצמיחה10,11,12, אשר אפשרה תא גזע נמוך זריעה צפיפות כדי להבטיח את התזונה לספק. עם זאת, למרות הגישות הללו אספקת תזונה יעילה נמוכה בתוך מבנה גליון תא מרובה שכבות עדיין דאגה עיקרית במהלך הבנייה במבחנה . לכן, מערכת בניית גיליון תא ריאלי ויעיל דרוש בדחיפות.
פרוטוקול זה מתאר את השלבים כדי להכין גיליון התא של תאי גזע (MSC) multilayeredmesenchymal. במערכת זו בנייה ', גיליון התא חוזק מכני מסופק על ידי DPP. על סמך זה לגרדום, מבנה תלת-ממדי התא יכול להיות במהירות נבנה עם RAD16-אני הידרוג פפטיד, ומערכת דינמי זלוף משמש תרבות הגיליון תא מרובה שכבות, על מנת לייצב את מבנה גליון התא תלת-ממד, לספק תזונה מספקת ספק עבור התאים. באמצעות מערכת זו, גיליון BMSC מרובה שכבות הוכן בהצלחה, הציג השפעה טיפולית אופטימלית על מודל אוטם שריר הלב13חולדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל תאי גזע והתהליכים ניסויים בבעלי חיים היו שנערכו על פי הנחיות האתית של המדריך הארצי על הטיפול ועל שימוש של חיות מעבדה, אושרה על ידי אכפת לי חיה אוניברסיטת ג'ינאן שימוש הוועדה (גואנגג'ואו, סין).
1. הכנת לגרדום DPP עם Decellularization2 ה-PLA השיטה14
הערה: ראה איור 1A סכימטי של שיטת ה-PLA decellularization2 .
- הכן 100 מ של פתרון2 U/mL PLA 200. להוסיף 0.5 g של נתרן deoxycholate, 2 מ של ה-PLA2 מ ל 198 של בופר קרבונט. פתרון זה אמור לשמש בתוך 24 שעות מגמר הערבול.
- להשיג את קרום הלב חזירי טריים (FPP) מבית המטבחיים, חזור למעבדה בתוך 1 h.
הערה: FPP לאחסנו ב 4 ° C במהלך התחבורה הציבורית. צעדים 1.2-1.10 וצריך להתנהל ברעידות רציפה באמבט מים שבשליטת התרמוסטט. - ביסודיות תשטוף FPP עם 200 מ של פוספט בופר (PBS) המכיל 1% פניצילין-סטרפטומיצין בתוך 500 mL-10 ° Cfor 10 דקות חזור על שלב זה, 2 x.
- לפצל את FPP שתי שכבות ולהסיר את רקמת שומן עם מלקחיים ומספריים.
הערה: לשמור FPP רטוב על-ידי הוספת 50 מ של PBS כל 20 דקות במהלך הסרת רקמת שומן. - לעצב את FPP 10 10x ס מ2 חלקים עם מספריים. לשטוף את FPP עם 200 מ ל בופר קרבונט (CBS) המכיל 1% פניצילין-סטרפטומיצין בתוך 500 מ"ל ב 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות חזור על שלב זה, 2 x.
- להעביר את FPP מים טהורים ומשרים אותו ב 10 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות.
- להשרות את הדגימות2 10 10x ס מ 50 מ של CBS המכיל 200 PLA U/mL2 ו- 0.5% (w/v) נתרן deoxycholate פתרון ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות.
- לשטוף הדגימות עם הלמ ס המכיל 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות חזור על שלב 2 x.
- לטבול כל מדגם 50 מ של CBS המכיל 200 PLA U/mL2 ו- 0.5% (w/v) נתרן deoxycholate פתרון ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
- לשטוף הדגימות עם CBS המכיל 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב 10 ° C עבור 2 ח' חזור על צעד זה עבור 10 x לפחות. למקם את הדוגמאות על לוחות שטוחים, לייבש אותם על משקל קבוע בתנור טמפרטורה קבועה-55 מעלות צלזיוס.
הערה: המדגם צריך להיות יבש לחלוטין. שוקל המדגם DPP כל 10 דקות, ולחזור על זה 3 x או עד המשקל כבר לא משנה. - הצורה כל מדגם DPP לתוך עיגול בקוטר 10.5 מ מ עם trephine. חבילת כל DPP בשקית אטומה סטרילי.
- לחטא את הדגימות DPP על ידי הקרנה גמא (25 kGy). מאוחסנות הדגימות DPP-4 ° C לפני השימוש.
הערה: כל הדגימות ניתן לאחסן עד שישה חודשים ב 4 º C.
2. ההכנות לתא גליון בנייה
- אוטוקלב מכשירים וכל הרקמות מרכיבים המוביל ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, כולל צינורות צנטריפוגלי 1.5 mL, מלקחיים, מצוי מלקחיים, מספריים, שחור בסיסים (רקמות הספק רכיב), טבעות מתח לבן (רקמות הספק רכיב).
- להכין 20 מיליליטר מחיידקים 10% סוכרוז הפתרון. משקל 2 גר' סוכרוז, לפזר את סוכרוז ב 18 מיליליטר מים הנדסה גנטית. אוטוקלב הפתרון 10% סוכרוז ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או מסנן הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
- אוטוקלב התקני מערכת זלוף דינמי ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, כולל גז להחליף ציוד, בקבוק זכוכית 500 מ"ל, מיכל תרבות זלוף, צינורות חיבור.
- להכין כלי נגינה בלוק רקמות רכיבי הספק. הכניסו בסיס החלק השחור של המוביל רקמות לצלחת תרבות.
- להרים לפיגום DPP יבשים ולשים אותו במרכז הבסיס שחור. לשים טבעת מתח לבן על הגרדום DPP ולתקן אותה במנשא רקמות.
הערה: ודא לגרדום לגמרי קבוע במנשא רקמות, ויש אין פער בין הבסיס שחור והטבעת מתח לבן. אם לא, להפריד המוביל רקמות ותקן לגרדום שוב. - להוסיף 100 µL של תרבות בינוני על הגרדום DPP על התייבשות.
הערה: אם לגרדום לא תתוקן היטב במנשא רקמות, המדיום תרבות יסתננו המנה תרבות. - מכניסים לגרדום חממה 37 ° C ולאפשר משרים למשך 15 דקות.
3. הכנה של התאים לתא גליון בנייה
הערה: פרוטוקול זה היא תרבית תאים באמצעות צלחת 100 מ מ. ראה איור 1B סכימטי של הקמת מבנה התא מרובה שכבות.
- לבודד BMSCs13.
הערה: שיטה זו מיועדת עבור בניית גיליון תא MSC מרובה שכבות. עכברוש BMSCs נמצאים בשימוש בפרוטוקול זה. BMSCs מבודדים בשיטת מח עצם כל חסיד, ויש BMSCs המורחב במבחנה כדי להשיג מספיק כמות תאים.- אוטוקלב הכלים ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, כולל מלקחיים מלקחיים במיתולגיות, מספריים. להכין 2 מ"ל הזרקת מזרק ואת BMSC תרבות בינוני (של Dulbecco שונה של הנשר בינוני [DMEM], סרום שור עוברית 10%, 1% גלוטמין ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין).
- המתת חסד העכברושים ספראג-Dawley (SD) זכר בן שלוש בשבוע על ידי חוליית הצוואר פריקה. משרים את החיה ב- 100 מ של תמיסת כוהל 75% בתוך 5 דקות.
- להוציא את החיה הספל ומקם אותו נוטה על שולחן הניתוח. תחתכי את העור בחלק האחורי של החיה עם מלקחיים ומספריים. לבודד את רקמות העור והשריר כדי לחשוף את עצמות הירך הירך.
- לבודד את עצמות הירך הירך ושם אותו בתוך 30 מ של PBS בשפופרת צנטרפוגה 50 מ. מניחים שתי עצמות הירך הירך לתוך שפופרת אחת. מערבולת הצינור צנטריפוגה כדי לשטוף ביסודיות את הרקמה. חזור על שלב זה, 2 x.
- חותכים בשני קצוות עצמות הירך עם מספריים ולחשוף את חלל מח.
- האחות 2 מ של BMSC תרבות בינוני עם מזרק הזרקת. את המחט לתוך חלל מח, לשטוף את מח העצם תרבות בינונית. לרוקן את כל עצמות הירך הירך שני לתוך צלחת אחת של תרבות 100 מ מ.
- עבור כל מנה תרבות 100 מ מ, להוסיף 2 מ של תרבות בינוני בצלחת תרבות. מכניסים את הצלחת תרבות 37 ° C חממה ותרבות סטטי 72 h.
- להוציא את המאכל תרבות של החממה. החלף את תגובת שיקוע 6 מ של טרי בינוני תרבות.
- שימו לב BMSCs הראשי תחת מיקרוסקופ. בעקבות זאת, המעבר BMSCs d כל 5-7.
- קח את התאים מתוך החממה. לבחון את התאים במיקרוסקופ, לבחור תאים מתאים לבנייה גיליון תא. כאשר BMSCs מגיעים למפגש 80% - 90%, ניתן לבחור את התאים של התאים הזריעה.
- הסר את המדיום תרבות של המנה תרבות. לשטוף בעדינות את התאים עם 2 מ של PBS חמים. הסר PBS כל המנה התרבות ולעשות נשאר בטוח לא נוזלי. להוסיף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין (או פתרון אחר dissociating) למנה, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
- להפסיק את האפקט טריפסין על-ידי הוספת 2 מ"ל של המדיום תרבות, ולשטוף בעדינות את התאים מתוך קערה. העברת התליה תא לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 mL החדש. Centrifugate התאים ב x 225 גרם במשך 5 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע. Resuspend התאים עם 3 מ"ל של 10% (w/v) סוכרוז פתרון.
הערה: 10% (w/v) סוכרוז הפתרון משמש כדי לשטוף את התאים על מנת לקבל תערובת אחידה תא-הידרוג בשלבים הבאים. - האחות µL 10 של התליה תא, לספור את התא עם hemocytometer. לחשב את אמצעי האחסון הדרושים עבור השלב הבא. עבור גיליון תא אחד, שלושה מיליון BMSCs משמשים.
- תמצית שלושה מיליון תאים, להעביר אותם לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 mL החדש. Centrifuge התאים ב x 225 גרם במשך 5 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע. Resuspend התאים עם 1 מ"ל של 10% (w/v) סוכרוז פתרון. העברת התליה תא לתוך שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL.
הערה: באמצעות צינור צנטריפוגלי 1.5 mL הוא מועיל עבור הכנת התערובת הידרוג-התא. - Centrifuge התאים ב x 260גרם במשך 5 דק לחלוטין להסיר את תגובת שיקוע ולקבל את המשקע התא.
4. הכנת את BMSCs, את RAD16-אני תערובת הידרוג פפטיד
הערה: ראה איור 1B סכימטי של הקמת מבנה התא מרובה שכבות.
- הוסף 20 µL של 10% (w/v) סוכרוז פתרון הצינור צנטריפוגלי 1.5 mL. בעדינות resuspend את BMSCs, לקבל השעיה אחיד.
הערה: אפשרות לייצר בועות במהלך resuspension. - הוסף 20 µL של RAD16-אני פפטיד הידרוג בחלק העליון של ההשעיה. מערבבים בעדינות את RAD16-אני ההשעיה פפטיד ותא עם קצה פיפטה. כאשר התא השעיה של הידרוג מעורבבים יחד, בעדינות pipette התערובת מספר פעמים.
- להוציא לגרדום DPP מנושאת המטוסים רקמות, בעדינות תשאף המדיום תרבות עם טיפ פיפטה.
הערה: ודא שלגרדום DPP הוא מלא ולמיומנות לפני הוספת את התערובת הידרוג-התא. - וארוקן את התערובת ולהוסיף באופן שווה אותו לגרדום DPP.
הערה: הנפח הכולל של התערובת יהיה על 40-50 µL. מומלץ להוסיף את µL תערובת 10 בכל פעם מן המרכז אל מחוץ לגרדום. - להוסיף 1 מ"ל של תרבות בינוני לתחתית המוביל רקמות. הכניסו את הגיליון תא החממה 37 º C למשך 5 דקות.
- להוציא את הגיליון תא מן החממה. בעדינות מוסיפים 4 מ של תרבות בינוני המנה תרבות, לטבול את הגיליון התא. הכניסו את הגיליון תא החממה 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים של תרבות סטטי.
5. תרבות במבחנה של גיליון תא מרובה שכבות תלת-ממד באמצעות מערכת תרבות דינמית
הערה: ראה 1C איור סכימטי של מערכת דינמית תלת-ממד.
- הכן מערכת דינאמית זלוף, כולל משאבה סחרור ציוד חילופי גז, בקבוק זכוכית 500 מ"ל, מיכל תרבות זלוף, צינורות חיבור. להרכיב מערכת דינאמית זלוף כמוצג באיור2.
- להוסיף 200 מ של תרבות בינוני הבקבוק זכוכית סטריליים. הכנס את הגיליון תא התא של המכולה תרבות.
הערה: שימו לב לכיוון פני השטח העליון של הגיליון התא. - להוסיף 3 מ"ל של תרבות בינוני בגורם המכיל של רקמות, לסגור את המיכל. להכניס את מערכת דינאמית זלוף החממה ולהתחיל את המשאבה. להגדיר קצב הזרימה של משאבת סחרור 8 מ ל לדקה תרבות הגיליון תא במערכת זלוף דינמי במשך 48 שעות.
6. הוצאת הגיליון תא MSC מרובה שכבות
- אוטוקלב ה כלים ורכיבי רקמה המוביל ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, לרבות צינורות צנטריפוגלי 1.5 mL, מלקחיים מלקחיים במיתולגיות.
- משוך החוצה את צינור קלט מהבקבוק זכוכית כדי לעצור את האספקה של תרבות בינוני לגורם.
הערה: לעצור את משאבת סחרור כאשר המיכל תרבות ריק. - להוציא את הגיליון תא מהגורם תרבות ולשים אותו לצלחת תרבות.
- להשתמש מלקחיים אחד כדי לשתק המוביל רקמות להשתמש מלקחיים במיתולגיות עוד להפריד את הטבעת מתח לבן הבסיס שחור. בסופו של דבר, להשיג את הגיליון תא BMSCs מרובה שכבות.
- לשימור קצר, ניתן להעביר כל גיליון תא לרכבת התחתית צנטריפוגלי 1.5 mL עם המלקחיים. לגרדום DPP צריכה להיות מחוברת אל הקיר הפנימי של הצינור צנטריפוגלי, ולהפיץ הגיליון תא צריך לצאת כמה שיותר בצינור צנטריפוגה.
- בעדינות מוסיפים 1 מ"ל של תרבות בינוני בצינור צנטריפוגלי לטבול את הגיליון התא. לסגור את הפקק של הצינור צנטריפוגלי ולאחסן את הגיליון תא ב 4 º C.
הערה: הגיליון התא צריך להיות מושתלים או לנתח בהקדם האפשרי. מומלץ להשתמש הגיליון תא תוך 4 שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התרשים של הבנייה גיליון מרובה שכבות תאי גזע מוצג באיור1. הכנת לגרדום גיליון התא על ידי שיטת ה-PLA decellularization2 הוא הצעד הראשון. מבנה זמני תא 3D בהתבסס על הגרדום, נבנית על ידי ערבוב תאי גזע עם הידרוג פפטיד RAD16-1. על מנת לקבל גיליון תא מרובה שכבות עם תאי גזע חיובית אתריים, חוזק מכני אופטימלית, הגיליון התא הוא תרבותי במערכת זלוף דינמי. תחת אספקת תזונה דינמי, תאי גזע מותר להתרבות ולהקים תא קשרים בתוך הגיליון תא מרובה שכבות, ניתן להשיג את המוצר הסופי תא מרובה שכבות יציב גיליון לאחר בגודל 24 ~-ל 72-שעה הטיפוח.
במקרה זה, לגרדום גיליון תא DPP מוכן בשיטת ה-PLA2 decellularization. המראה של DPP יבשים הוא שטוח, חלקה, שקוף למחצה (איור 3 א). בשל האפקט lyse הספציפי של ה-PLA2, התאים הטרוגנית ניתן לחלוטין להסיר ואילו ultrastructure של הקולגן הטבעי בתוך לגרדום DPP שהשתמרה היטב (איור 3B), והוא זה חשוב לשמירה חוזק מכני, התאימות של לגרדום. בנוסף, ניתן לשנות פיגומים כמו מערכת שחרור פקטורי גדילה בקרת לתמוך תאי גזע ולשפר את ויוו התחדשות13.
כאשר תאי גזע מגיעים למפגש ~ 80% - 90%, התאים מבודדים מתוך תרבות קערה ושטף עם 10% סוכרוז הפתרון. לאחר צנטריפוגה, התאים מעורבבים עם RAD16-אני פפטיד הידרוג שיתווספו לגרדום DPP rehydrated. מבנה מרובה שכבות זמני נוצר בעקבות תרבות סטטי שעתיים. בסופו של דבר, המוצר גיליון BMSC מרובה שכבות (איור 4) נרכש בעקבות תרבות של 48 שעות במערכת זלוף דינמי. עם התמיכה של לגרדום DPP, הגיליון תא ניתן לטפל בקלות עם מלקחיים, זה ניתן באופן זמני לשמר תרבות בינוני בצינור 1.5 mL-4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפני הבדיקה או השתלת (איור 4). כמו immunofluorescence צביעת מראה תוצאה, BMSCs הם מאוד חיובית עבור הסמנים תאי גזע CD90 ו- CD29. לאחר בניית גיליון תא, BMSCs בתוך תא מרובה שכבות גיליון הצג רמות גבוהות של CD29 ו- CD90 (איור 5).
איור 1 : תרשים הזרימה של בניית הגיליון מרובה שכבות תאי גזע. (א) באמצעות השיטה2 decellularized PLA, התאים הטרוגנית בתוך FPP נהרסים אמנם מטריצות חוץ-תאית הטבעי שהשתמרו ב לגרדום DPP. (B) מבוסס על הגרדום DPP, מבנה התא מרובה שכבות זמני הוא נבנה על ידי ערבוב תאי גזע והרכבה עצמית הידרוג פפטיד. (ג) לעקוב, הגיליון התא הוא תרבותי בתוך מערכת דינאמית תלת-ממד, תאי גזע צפויים להתרבות ולהקים תא אנשי קשר תחת אספקת תזונה דינמי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : המוביל רקמות ומערכת דינמי זלוף. מנשא רקמות (A) זה לוח הצגות 13 מ מ הקוטר. (B) לוח זה מראה את מכלול של מערכת דינמית זלוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : המראה ואת ultrastructure של DPP. (א) לוח זה מראה את המראה של פיגומים DPP 10.5 מ מ קוטר. (B) לוח זה מציג תמונת הנציגה של תוצאת לגרדום DPP לסרוק בעזרת מיקרוסקופ אלקטרון (SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : המראה של גליון BMSC מרובה שכבות. (א) לוח זה מראה המראה של BMSC מרובה שכבות גיליון בתוך המנשא רקמות. (B) הגיליון BMSC מרובה שכבות שלמות נערכות על ידי מלקחיים. (C - D) הגיליון מרובה שכבות תאים יכולים להישמר באופן זמני בצינור 1.5 mL לפני השימוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : Immunofluorescence מכתים את התוצאות של ביטוי סמנים BMSC. (א) לוח זה מראה immunofluorescence מכתים את התוצאות של BMSCs לפני תא גליון בנייה. (B) לוח זה מראה immunofluorescence מכתים תוצאות של המקטע גיליון BMSC מרובה שכבות. CD90 (ירוק), CD29 (אדום) חיובי היו לידי ביטוי את BMSCs ואת הסדין התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול הנוכחי מדווח שיטה יעילה עבור בניית גיליון MSC מרובה שכבות. גיליון זה תא תערוכות אופטימלית חוזק מכני, צפיפות זריעה תא גבוה ו אתריים חיובית לתאי גזע. כדוגמא BMSCs, מבנה תלת-ממדי התא במהירות נבנה עם RAD16-אני הידרוג פפטיד. לאחר להיות תרבותי במערכת דינמית זלוף, הגיליון BMSC מרובה שכבות בהצלחה מתקבל ולתחזק BMSCs ביטוי גבוה של תאי גזע סמנים.
בניית מבנה התא מרובה שכבות זמני היא השלב הקריטי של הפרוטוקול. RAD16-I הוא פפטיד הידרוג מסחרי וזה מורכב 1% חומצת אמינו ל- 99% מים. מספר מחקרים דיווחו כי הידרוג פפטיד זה יכול לחקות את הסביבה הטבעית ECM ייטיב עם תאי גזע התפשטות והישרדות15,16,17. בפרוטוקול הנוכחי, השעיה MSC שלושה מיליון (ב 20 µL של 10% סוכרוז פתרון) היה מעורב עם 20 µL של RAD16-אני הידרוג פפטיד. יחס נפח של התליה תא, את הידרוג פפטיד היה 1:1. הידרוג פפטיד זה רגיש לערך pH הסביבה, ויוצרים מולקולות פפטיד באופן אוטומטי לרשת 3D בעת שינוי ערך ה-pH של חומצה נייטרלי. מכיוון השטח התא מכיל חלקיקים טעונים, התערובת תא שינה מן הנוזל הידרוג תוך זמן קצר, שבו יש השפעות אפילו ערבוב של התאים. תא-הידרוג חיובית צריך להיות תערובת אפילו של התליה תא, את הידרוג פפטיד ומאפשר את התערובת תא שיתווספו באופן שווה על גבי לגרדום. החוקרים ניתן למטב את התנאי תערובת על ידי שינוי המספר הסלולרי הזריעה, סוכרוז פתרון, ונפח האחסון הידרוג פפטיד לפי הצורך הממשי שלהם. כדאי שתרשום את זה שטיפת התאים עם 10% סוכרוז הפתרון ואת אחיד ערבוב את תערובת תא-הידרוג הם הצעדים הקריטיים של הפרוטוקול תערובת לא אחידה עלול לגרום מבנה לא יציב מרובה שכבות זמניים ואובדן של התא הגדול שלך.
לאחר הוספת את התערובת תא-הידרוג על לגרדום DPP, חוזק מכני רב, מבנה גליון מרובה שכבות התא הוא חלש מאחר שהרשת הידרוג פפטיד אינה חזקה מספיק כדי לשמור על מבנה התא מרובה שכבות לטווח ארוך, תא ECM הפרשות וחיבורים נחוצים כדי לשפר את היציבות של הגיליון התא. יתר על כן, חדירה דינמי של המדיום תרבות יכול להקל על תאי גזע להתרבות ולהקים תא קשרים בתוך מבנה התא מרובה שכבות, בעוד אטומטי תזונה מספיקים לגרום אפופטוזיס תא ולהפחית את הצפיפות תא התא גיליון13. לכן, מערכת דינאמית זלוף חשוב לייצב את מבנה גליון התא מרובה שכבות. בנוסף, קצב הזרימה המתאימה של המדיום תרבות צריך להיות מותאם על פי סוג תא גזע מסוים תא זריעה צפיפות. בנוסף, הקשר מכני חלש בין לגרדום DPP מבנה התא מרובה שכבות נשאר המגבלה של שיטת בנייה הנוכחי, מה שעשוי לגרום החלוקה של התא מרובה שכבות השכבות, לגרדום. לכן, נוסף ללימודים נדרשים כדי לשפר את כימי מכניים של לגרדום הידרוג 3D ו לגרדום DPP.
עד כה, מדענים הנדסת רקמות מתמקדים בהקמת תזונה יעילה אספקת מערכות במבחנה, כגון coculturing אנדותל תאים18 ושימוש לגרדום נקבובי19. עם זאת, החדירות תזונה בתוך מבנה תלת-ממד היא נמוכה במערכת התרבות המסורתית סטטי תלת-ממד, הכדאיות תאי גזע יושפעו באופן משמעותי. במקרה זה, באמצעות מערכת זלוף דינמי יכול לספק מספיק אספקת תזונה כדי לשמור על יכולת הקיום של תאי גזע. גיליון BMSC מרובה שכבות באמצעות פרוטוקול זה, שיפור את תפקוד הלב ואת אנגיוגנזה אוטם שריר הלב מודל של עכברוש13. בניית מוצר גיליון תאי גזע עם עומס גבוה תא, מאפיין תאי גזע חיובית היא משמעותית על התחדשות רקמות. בשיטה זו יעיל שלא נבנה, סוגים שונים של תאי גזע מרובה שכבות גיליונות יכול להיבנות על ידי שינוי את סוגי תאי גזע הזריעה, כגון גיליון אפיתל תאי גזע, תאי גזע עצביים גיליון או תאי הלב גיליון. נוסף סיורום וחלופות בגיליון מרובה שכבות תאי גזע צפויים להרחיב את היישומים של התחדשות רקמות נוספות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (גרנט מספר 31771064); מדע, טכנולוגיה תכנון הפרוייקט של בפרובינצית גואנג-דונג (גרנט מספרים 2013B010404030, 2014A010105029 ו- 2016A020214012); מדע, טכנולוגיה תכנון הפרוייקט של גואנגזו (גרנט מספר 201607010063); חדשנות לתואר ראשון ואת תוכנית האימונים יזמות (גרנט מספר 201610559028); הקרן הלאומית למדע עבור סין של מדענים צעירים (להעניק מספר 31800819).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phospholipase A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Phosphate buffer | Gibco BRL | 89033 | |
| Penicillin streptomycin / amphotericin | Gibco BRL | 15640055 | |
| Buffer bicarbonate | Sigma-Aldrich | C3041 | |
| Table concentrator | Changzhou Aohua Instrument Co. | KT20183 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
| South American fetal bovine serum | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
| L-Glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| Biosafety cabinet | Esco,Singapore | AC2-2S1 | |
| Constant temperature incubator | Esco,Singapore | CLS-170B-8 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| EP tube | Axygen | 31617934 | |
| Centrifugal machine | TOMOS | 1-16R | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
| Pura Matrix | BD | 354250 | |
| Dynamic perfusion culture system | Minucells and Minutissue | D-93077 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IPC N8 | |
| Pump tubing | Ismatec | Nr.1306 | |
| MINUSHEET 1300 | Regensburg | tissue carrier components | |
| MINUSHEET | Regensburg | dynamic perfusion system | |
| MINUSHEET 0006 | Regensburg | gas exchange equipment | |
| MINUSHEET 0002 | Regensburg | 500 mL glass bottle | |
| MINUSHEET 1301 | perfusion culture container |
References
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).
- Narita, T., et al. The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects. International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).
- Narita, T., et al. The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure. Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).
- Matsuo, T., et al. Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction. Circulation. 128 (22), (2013).
- Alshammary, S., et al. Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction. Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).
- Chen, G. P., et al. The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).
- Cerqueira, M. T., et al. Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).
- Ishii, M., et al. Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).
- Godier-Furnemont, A. F., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Liu, Y., et al. Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction. American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).
- Arana, M., et al. Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction. Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).
- Wang, Y., et al. Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system. Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).
- Wu, Z., et al. The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold. Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).
- Degano, I. R., et al. The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation. Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).
- Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials. Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).
- Cui, X. J., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).
- Jun, I., et al. Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).
- Chen, C. H., et al. Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair. Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).
