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Genetics

qKAT: Quantitative Flugbuchungssystem Typisierung von Killer-Zelle Immunoglobulin-Like-Rezeptor-Gene

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58646
Automatic Translation
1,2,3,4, 1, 1,5, 1,6, 1,7, 1
1Department of Pathology, University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences, University of Cambridge

Summary

Quantitative Killer Cell Immunoglobulin-Like-Rezeptor (KIR) halbautomatische Eingabe (qKAT) ist eine einfache, hohem Durchsatz und kostengünstige Methode zur Nummer Typ KIR -Gene für ihre Anwendung in Bevölkerung und Krankheit Assoziationsstudien zu kopieren.

Abstract

Killer Cell Immunoglobulin-Like-Rezeptoren (KIR) sind eine Reihe von hemmende und aktivierende immun Rezeptoren auf natürlichen Killer (NK) und T-Zellen, die durch eine polymorphe Cluster von Genen auf Chromosom 19 kodiert. Ihre besten charakterisierten Liganden sind die humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Moleküle, die in großen Histocompatibility complex (MHC) Locus auf Chromosom 6 kodiert sind. Es gibt deutliche Hinweise, dass sie eine bedeutende in der Immunität, Reproduktion und Transplantation Rolle, macht es wichtig, Techniken zu haben, die genau Genotyp kann ihnen. High-Sequenzhomologie, sowie Allele und Kopie Nummer Variation, erschweren jedoch es Design-Methoden, die präzise und effizient Genotyp alle KIR -Gene. Traditionelle Methoden sind in der Regel in die Auflösung der gewonnenen Daten, Durchsatz, Wirtschaftlichkeit und der Zeitaufwand für die Einrichtung und Betreuung der Versuche begrenzt. Wir beschreiben eine Methode namens quantitative KIR halbautomatische Eingabe (qKAT), das ist eine Hochdurchsatz-multiplex Real-Time Polymerase Kettenreaktion-Methode, die die gen Heftnummern für alle Gene in der KIR -Locus bestimmen kann. qKAT ist eine einfache Hochdurchsatz-Methode, die KIR Kopie Nummer Feindaten, bereitstellen kann, die weiter verwendet werden können, um die Variationen in der strukturell polymorphen Haplotypen abzuleiten, die sie umfassen. Diese Kopie Zahl und Haplotyp Daten können für Studien über groß angelegte Krankheit Verbände, Populationsgenetik sowie Untersuchungen zur Expression und funktionelle Wechselwirkungen zwischen KIR und HLAvorteilhaft.

Introduction

Bei Menschen, die killer Immunoglobulin-Like-Rezeptor(KIR) Locus auf dem langen Arm von Chromosom 19 innerhalb der Leukozyten Rezeptor-Komplex (LRC) zugeordnet ist. Dieser Locus ist etwa 150 kb in der Länge und umfasst 15 KIR Gene angeordnet Head-to-Tail. Die KIR -Loci, die derzeit bekannt sind sind KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, und zwei Pseudogene, KIR2DP1 und KIR3DP1. Die KIR -Gene kodieren für zweidimensionale (2D) und dreidimensionale (3D) Immunglobulin-ähnliche Domäne Rezeptoren mit kurzen (S; aktivieren) oder lang (L; hemmenden) zytoplasmatischen Endstücke, die durch natürliche Killerzellen (NK) und Teilmengen von T ausgedrückt werden Zellen. Copy Number Variation ausgestellt in der KIR -Locus-Formularen vielfältige Haplotypen mit variabler gen Inhalt1. Non-Allele homologe Rekombination (NAHR), erleichtert durch eine enge Head-to-Tail gen Anordnung und hohe Sequenzhomologie ist der Mechanismus vorgeschlagen, für die Variabilität der Haplotypic verantwortlich. Mehr als 100 verschiedenen Haplotypen wurden in Populationen weltweit1,2,3,4beschrieben. Diese Haplotypen konnte in zwei Hauptgruppen unterteilt werden: A und B Haplotypen. Die A-Haplotyp enthält 7 KIR -Gene: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1und KIR3DL2, die inhibitorische KIR -Gene und die aktivierende KIR sind gen KIR2DS4. Bis zu 70 % der Europäischen stammende Personen, die homozygot für KIR Haplotyp A ausschließlich tragen jedoch eine nicht-funktionale "Löschung" Form der KIR2DS45,6. Alle anderen KIR -gen-Kombinationen bilden Gruppe B Haplotypen, darunter mindestens eine der spezifischen KIR Gene KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, und KIR2DL5, und in der Regel zwei oder mehr aktivierenden KIR -Gene enthalten.

HLA Klasse I Moleküle wurden identifiziert als Liganden für bestimmte hemmende Rezeptoren (KIR2DL1 KIR2DL2, KIR2DL3und KIR3DL1), aktivierenden Rezeptoren (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, und KIR3DS1), und für KIR2DL4, das ist eine einzigartige KIR , die enthält eine lange zytoplasmatischen Schwänzen wie andere hemmenden KIR-Rezeptoren, sondern hat auch einen positiv geladenen Rest in der Nähe der extrazellulären Domäne ist eine gemeinsame Funktion von anderen aktivierenden KIR -Rezeptoren. Die Kombination von Varianten innerhalb der KIR-Gene und die HLA-Gene beeinflusst Rezeptor Liganden Interaktion dieser Formen möglicher NK Zelle Reaktionsfähigkeit auf der individuellen Ebene7,-8. Nachweis von genetischen Assoziationsstudien hat angedeutet, dass KIR in virale Resistenz (z. B.., humanen Immundefizienz-Virus [HIV]9 und Hepatitis C-Virus [HCV]10) eine Rolle spielt den Erfolg der Transplantation 11, das Risiko einer Schwangerschaft Störungen und Fortpflanzungserfolg12,13, der Schutz vor Rückfall nach allogenen hämatopoetischen Stammzellen Transplantation (HSCT)14,15, 16und das Risiko von Krebserkrankungen17.

Die Kombination von hohen Sequenzhomologie und Allele und Haplotypic Vielfalt präsentiert Herausforderungen in der Aufgabe genau Genotypisierung KIR -Gene. Konventionelle Methoden der KIR -Gene geben zählen Sequenz-spezifische Primer (SSP) Polymerase-Kettenreaktion (PCR)18,19,20, Sequenz-spezifische Oligonukleotid Sonden (SSOP) PCR21, und Matrix assisted Laser desorption Ionisation-Zeit des Fluges Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS)22. Die Nachteile dieser Techniken sind, dass sie nur teilweise Einblick in das Erbgut einer Person zwar auch mühsam zu führen. Vor kurzem wurde Next Generation Sequencing (NGS) angewandt, um die KIR -Locus speziell zu geben. Während diese Methode sehr mächtig ist, kann es teuer sein, und es ist zeitaufwendig, eingehende Analyse und Daten-Kontrollen durchzuführen.

qKAT ist eine Hochdurchsatz-quantitative PCR-Methode. Während herkömmliche Methoden mühsam und zeitaufwändig sind, diese Methode macht es möglich, fast 1.000 genomische DNA (gDNA) Proben in fünf Tagen ausgeführt und gibt die KIR -Genotyp sowie die Kopienzahl gen. qKAT besteht aus zehn Multiplex-Reaktionen, von die jede zwei KIR Loci richtet und ein Referenz-gen einer festen Kopie Zahl in das Genom (STAT6) verwendet für die relative Quantifizierung des Gens KIR kopieren Nummer23. Dieser Test wurde erfolgreich eingesetzt in Studien, bei denen große Population Panels und Krankheit Kohorten auf Infektionskrankheiten wie HCV, autoimmune Erkrankungen wie Typ-1-Diabetes und Schwangerschaft Störungen wie Präeklampsie, sowie eine genetische zugrunde liegenden Studien, die darauf abzielen, die NK Zelle Funktion1,4,24,25,26zu verstehen.

Protocol

1. Vorbereitung und Beschichtung aus DNA

  1. Die gDNA-Konzentration mit einem spektralfotometrische oder fluorometrisch Instrument genau zu quantifizieren.
  2. Verdünnen Sie DNA um 4 ng/µL auf einer 96-Well Deep-Well-Platte. Gehören Sie mindestens eine Kontrollprobe gDNA mit bekannten Ausfertigung eine eigene Nummer und einem nicht-Template-Kontrolle.
  3. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platten bei 450 X g für 2 min.
  4. Mit einem Instrument Handhabung von Flüssigkeiten jeder Probe in vervierfacht auf qPCR 384-Well-Platten zu verzichten, so dass jeder gut 10 ng DNA (2,5 µL/Well). Bereiten Sie mindestens zehn 384-Well-Platten, eine für jede qKAT Reaktion.
  5. Wenn gDNA von mehr als einer 96-Well-Platte verzichtet wird ist, führen Sie eine vollständige Volume-waschen mit 2 % Bleichmittel und Reinstwasser, reinigen Sie die Nadeln der Flüssigkeit Handlingsystem zwischen einzelnen 96-Well-Platte von gDNA Proben.
  6. Trocknen Sie die DNA durch Inkubation der 384-Well-Platten in einem sauberen Bereich bei Raumtemperatur für mindestens 24 Stunden.

2. Vorbereitung der Primer und Sonden

Hinweis: qKAT besteht aus zehn Multiplex-Reaktionen. Jede Reaktion umfasst drei Grundierung Paare und drei Fluoreszenz-markierten Sonden, die zwei KIR -Gene und eine Referenz-gen gezielt verstärken. Die Sonden, die in Jiang Et Al.27 veröffentlicht wurden wurden geändert, sodass die Oligonucleotides jetzt mit ATTO-Farbstoffen beschriftet werden, da sie verbesserten Photostabilität und langes Signal Lebenszeiten bieten. Pre-regelmÄÑig Grundierung Kombinationen sind im Handel erhältlich (siehe Tabelle der Materialien).

  1. Bereiten Sie Primer-Kombinationen für jede Reaktion gemäß den in Tabelle 1angegebenen Verdünnungen vor.
  2. Bereiten Sie die Sonde Kombinationen für jede Reaktion gemäß Tabelle 1. Jede einzelne Sonde vor der Herstellung der Verbindung zu testen.

3. Vorbereitung des Master-Mix

Hinweis Die unten genannten Mengen sind für die Durchführung einer qKAT Reaktion auf eine Reihe von 10 x 384-Well Platten.

  1. Sicherstellen Sie, dass die gDNA Proben auf 384-Well-Platten beschichtet vollständig trocken sind. Führen Sie alle Schritte auf dem Eis und halten Sie die Reagenzien von möglichst viel Lichteinfall, da die Fluoreszenz-markierten Sonden Foto und thermosensible sind bedeckt.
  2. Auftauen der qPCR Puffer, Primer und Sonde Aliquote bei 4 ° C.
  3. Bereiten Sie auf dem Eis einen master-Mix 10 x 384-Well Platten durch Zugabe von 18,86 mL Reinstwasser, 20 mL qPCR Puffer, 1.000 µL vorgefertigtes Grundierung Kombination und 180 µL vorgefertigtes Sonde Kombination (Tabelle 2).
  4. Verteilen der master-Mix gleichmäßig über eine 96-Deep-well-Platte mit einer Multi-Kanal-Pipette, 415 µL in jede Vertiefung pipettieren. Halten Sie diese Platte in eine Eisbox aus Licht abgedeckt.
  5. Mit einem flüssigen Umgang mit Instrument, 9,5 µL des master-Mix in jede Vertiefung von 384-Well-Platte mit getrockneten gDNA verzichten. Die Dichtplatte mit einer Folie und legen Sie es sofort bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Platten, um sicherzustellen, dass die Nadeln der Handlingsystem Flüssigkeit mit Wasser zwischen jedem Teller gewaschen werden.
  6. Zentrifugieren Sie 384-Well-Platten bei 450 X g für 3 min und inkubieren sie bei 4 ° C über Nacht oder zwischen 6-12 h die DNA Aufschwemmen und eventuelle Luftblasen zu zerstreuen.

4. qPCR Assay

  1. Zentrifugieren Sie nach der Übernachtung Inkubation bei 450 X g für 3 min, verbleibenden Luftblasen zu zerstreuen.
  2. Für Zwecke der Automatisierung, verbinden die qPCR-Maschine (z. B. LightCycler 480) zu einem Mikrotestplatte Handler (siehe Tabelle der Materialien). Programm der Mikrotestplatte Handler, der die Platten in der qPCR-Maschine von einem gekühlten Lagerung Dock zu setzen, der vor Licht geschützt ist.
    Hinweis Assays sollte, in der Theorie funktionieren, auf anderen qPCR-Maschinen mit passenden optischen Einstellungen.
  3. Verwenden Sie die folgenden Radsport Bedingungen: 95 ° C für 5 min gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s und 66 ° C für 50 s, mit Datenerfassung bei 66 ° C.
  4. Sobald das abgeschlossen ist, haben Sie die Roboter die Platte von der qPCR-Maschine zu sammeln und legen Sie es im Dock ablegen.

5. nach einem Testlauf Analyse

  1. Nach Verstärkung, berechnen die Quantifizierung Zyklus (Cq) Werte mit der zweiten Derivative maximale Methode oder die Anpassungspunkte Methode mit der Software der qPCR-Maschine (siehe Tabelle der Materialien), die folgenden Schritte aus.
  2. Öffnen Sie die qPCR-Software und in der Registerkarte " Navigator " öffnen Sie die gespeicherte Reaktion-Experiment-Datei für eine Platte.
  3. Wählen Sie für die Analyse mit der zweiten Derivative maximale Methode die Registerkarte "Analyse", und erstellen Sie eine neue Analyse mit Abs Quant/Second Derivat Max Methode.
    1. Wählen Sie im Fenster Create neue Analyse Berechnungsart: Abs Quant/Second Derivat Max Methode, Teilmenge: alle Proben, Programm: Verstärkung, Name: Rx-DFO (wobei x ist die Anzahl der Reaktion).
    2. Wählen Sie Filter Kamm und VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Dies sorgt dafür, dass die Daten für STAT6 ausgewählt ist.
    3. Wählen Sie Farbe Entschädigung für VIC/HEX/Yellow555(533-580). Klicken Sie auf berechnen. Wiederholen Sie dies für Fam (465-510) und Cy5/Cy5.5(618-660). Klicken Sie auf Datei speichern.
  4. Wählen Sie für die Analyse der Anpassungspunkte Methode Abs Quant/Fit Punkte in der Registerkarte "Analyse aus".
    1. Wählen Sie im Fenster Create neue Analyse Berechnungsart: Abs Quant/Anpassungspunkte Methode, Teilmenge: alle Proben, Programm: Verstärkung, Name: RxF-DFO (wobei x ist die Anzahl der Reaktion).
    2. Wählen Sie den richtigen Filter und Farbe Entschädigungen für STAT6 und jedes der KIR -Gene (Fam/Cy5). Legen Sie in der Registerkarte " Noiseband " Noise-Band, die Hintergrundgeräusche auszuschließen.
    3. Legen Sie in der Registerkarte Analyse die Anpassungspunkte 3 und wählen Sie Show Punkte passen. Klicken Sie auf berechnen. Klicken Sie auf Datei speichern.

6. Export der Ergebnisse

  1. In der qPCR-Software, öffnen Sie den Navigator tab. Wählen Sie Ergebnisse Batch Export.
  2. Öffnen Sie den Ordner, in dem die Experiment-Dateien werden gespeichert und übertragen Sie die Dateien in den rechten Bereich des Fensters. Klicken Sie auf weiter. Wählen Sie den Namen und den Speicherort der Exportdatei.
  3. Wählen Sie Analyse Abs Quant/Second Derivat Max Methode oder Abs Quant/Anpassungspunkte. Klicken Sie auf weiter. Überprüfen Sie, dass der Name der Datei, die Export-Ordner und die Berechnungsart korrekt sind und klicken Sie auf nächste um den Export zu starten.
  4. Warten Sie, bis der Export Status Okist. Der Bildschirm bewegt sich automatisch mit dem nächsten Schritt fort. Überprüfen Sie, ob alle ausgewählte Dateien erfolgreich exportiert wurden, dass die Anzahl der Dateien fehlgeschlagen = 0. Klicken Sie auf fertig.
  5. Verwenden Sie Skripte split_file.pl und roche2sds.pl, individuelle Reaktionen für jede Platte die exportierten Platten aufgeteilt.
    Hinweis die Skripte werden auf Anfrage/GitHub zur Verfügung gestellt.

7. Kopieren Sie Zahl Berechnungen

  1. Öffnen Sie die Kopie Nummer Auswerte-Software (z. B. CopyCaller). Wählen Sie Echtzeit-PCR-Ergebnisse-Datei importieren und laden Sie Textdateien, die von roche2sds.plerstellt.
  2. Wählen Sie analysieren und durchführen Sie die Analyse, indem entweder die Auswahl Kalibrator Probe mit bekannten Exemplarzahl oder am häufigsten Exemplarzahl. Siehe Tabelle 5 für die häufigsten Kopienzahl des KIR -Gene, die in der Regel in europäischen Ursprungs Populationen beobachtet.

8. Qualitätsprüfungen Daten-

  1. Verwenden Sie R-Skript KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R , Nummer Kopieren von Daten von den Platten in eine Tabellenkalkulation zu kombinieren.
    Hinweis die Skripte werden auf Anfrage/GitHub zur Verfügung gestellt.
  2. Überprüfen Sie die Rohdaten auf der Kopie Zahl Analysesoftware für Proben, die nicht zu den bekannten Gestänge Ungleichgewicht (LD) für KIR -Gene (Tabelle 6) entsprechen.

Representative Results

Zahlenanalyse Kopie kann durch den Export der Dateien in die Kopie Nummer Analyse-Software, bietet die vorhergesagten und geschätzte Kopienzahl, basierend auf der ΔΔCq-Methode durchgeführt werden.

Die Kopienzahl kann vorhergesagt werden, entweder basierend auf der bekannten Kopienzahl des Control DNA-Proben auf dem Teller oder durch Eingabe der häufigsten gen Kopienzahl (Tabelle 5). Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse einer Platte für eine Reaktion, die KIR2DL4 und KIR3DS1sowie das Referenz-gen richtet sich an STAT6. Die häufigste Kopienzahl für KIR2DL4, ein Rahmen-gen in der KIR -Locus, ist zwei Exemplare, während die häufigste Kopienzahl für KIR3DS1, eine aktivierende gen eine Kopie. Die Ergebnisse in der Abbildung zeigen die PCR-Amplifikation Grundstücke beobachtet auf der qPCR-Software und die Nummer Kopieren von Daten aus der qPCR-Daten generiert. Wie gezeigt, ist der Test zwischen 0, 1, 2, 3 und 4 KIR gen Heftnummern unterscheiden können. Die Kopie Nummer Analysesoftware ermöglicht auch eine Betrachtung der Verteilung der die Kopienzahl auf den Teller legen, als ein Kreisdiagramm oder ein Balkendiagramm. Die Wirksamkeit der Kopie Zahl Vorhersage ist geringer bei Proben mit einer höheren Anzahl der Kopie.

Die Qualität der Werkstoffe in den Reaktionen gDNA, Puffer, Primer und Sonden, kann die Genauigkeit der Ergebnisse beeinflussen. Discordance in den Ergebnissen ist jedoch am ehesten durch Variation der Konzentration von DNA über eine Platte verursacht werden. Die Reinheit des extrahierten gDNA, die gemessen werden kann, mit 260/280 und 260/230 Verhältnisse können sich auch auf die Qualität auswirken. Ein 260/280 Verhältnis von 1,8-2 und a 260/230 Verhältnis von 2-2.2 sind wünschenswert. Eine ungleichmäßige Palette von DNA-Konzentrationen über eine Platte können zu einer hohen Variabilität in der Schwelle-Zyklus (C-t) zwischen Proben und Discordance im Bereich der geschätzten Exemplarzahl führen. Die Ergebnisse in Abbildung 2 zeigen die Wirkung, die Diskrepanz zwischen den C-t -Werte über eine Platte auf die Genauigkeit bei der Vorhersage von die Kopienzahl haben kann. Die rote Linie zeigt den Bereich der die geschätzte Kopienzahl für eine Probe und idealerweise sollte so nah wie möglich an eine Ganzzahl wie möglich sein.

Die Kopie Nummer Daten, einmal analysiert, können als eine Tabellenkalkulationsdatei in einem 96-Well-Format exportiert werden. Wir haben eine R-Skript (erhältlich auf Anfrage) die Kopie Nummer Daten alle 10 Platten zu kombinieren, die als Set in einer Tabelle ausgeführt werden. Veröffentlichte Daten über KIRs aus meist europäischen Ursprungs Populationen ermöglicht die Vorhersage der LD-Regeln, die zwischen verschiedenen Genen in der KIR komplexe1vorhanden sind. Diese Vorhersagen werden verwendet, um nachgeschaltete Kontrollen auf die Kopie Nummer Ergebnisse (Tabelle 6). Proben, die nicht die vorhergesagte LD zwischen den Genen entsprechen, können ungewöhnliche Polymorphismus oder Haplotypic strukturellen Variationen enthalten. Ein Flussdiagramm, beschreibt das Protokoll ist in Abbildung 3dargestellt.

Eine Tool namens KIR Haplotyp Bezeichner (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) wurde entwickelt, um die Zurechnung von Haplotypen aus dem Datensatz zu ermöglichen. Die Zurechnung arbeitet auf der Grundlage einer Referenz Haplotypen in einem europäischen stammende Bevölkerung1beobachtet. Das Tool lässt sich jedoch auch für einen benutzerdefinierten Satz von Referenz-Haplotypen stattdessen verwendet werden. Drei separate Dateien werden erstellt. die erste Datei listet alle Haplotypen-Kombinationen für eine Probe, die zweite Datei enthält eine getrimmte Liste der Haplotypen-Kombinationen, die die höchsten kombinierten Frequenzen haben, und die dritte Datei listet die Proben, die Haplotypen zugeordnet werden können. Non-Zuordnung von Haplotypen könnte als Indikator für neuartige Haplotypen verwendet werden.

Figure 1
Abbildung 1: repräsentative Ergebnisse einer Platte für Reaktion Nr. 5. (A) diese Panel zeigt Verstärkung Grundstücke. (B) dieses Panel zeigt kopieren Anzahl Parzellen. (C) dieser Bereich zeigt die Kopie Nummer Verteilung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: repräsentative Ergebnisse einer Platte mit einer Variablen DNA-Konzentration für Reaktion Nr. 5. (A) diese Panel zeigt Verstärkung Grundstücke. (B) dieses Panel zeigt kopieren Anzahl Parzellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Flussdiagramm des Protokolls qKAT. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Assay Gene Forward Primer Konzentration (nM) Reverse Primer Konzentration (nM) Sonden Konzentration (nM)
Nr. 1 3DA1 A4F 250 A5R 250 P4a 150
2DL 2 2DL2F4 400 C3R2 600 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr. 2 2DS2 A4F 400 A6R 400 P4a 200
2DL 3 D1F 400 D1R 400 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr. 3 3DL 3 A8F 500 A8R 500 P4a 150
2DS4Del 2DS4Del 250 2DS4R2 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr. 4 3DL1e4 B1F 250 B1R 125 P4b 150
3DL1e9 D4F 250 D4R2 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr. 5 3DS1 B2F 250 B1R 250 P4b 150
2DL 4 C1F 200 C1R 200 P5b - 2DL 4 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr. 6 2DL 1 B3F 500 B3R 125 P4b 150
2DP1 D3F 250 D3R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr. 7 2DS1 B4F 500 B4R 250 P4b 150
2DL 5 D2F 500 D2R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr. 8 2DS3 B5F 250 B5R 250 P4b 150
3DL2e9 D4F 250 D5R 125 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr. 9 3DL2e4 A1F 200 A1R 200 P4a 150
2DS4FL 2DS4FL 250 2DS4R2 500 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr. 10 2DS5 B6F2 200 B6R3 200 P4b 150
2DS4 C5F 250 C5R 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150

Tabelle 1: Kombination und Konzentration von Primer und Sonden verwendet in jeder qKAT Reaktion 27 .

Reaktion Grundierung Aliquote (µL) Sonde Aliquote (µL)
R1 3DA1 A4F A5R 2DL2F4 C3R2 WASSER STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DL 2 100 100 160 240 200 80 80 60 60 60
R2 2DS2 A2F A6R D1F D1R WASSER STAT6F STAT6R P4A P9 PSTAT6
2DL 3 160 160 160 160 160 80 80 80 60 60
Hinweis: benötigen Sie 20 µL weniger Wasser in den MasterMix
R3 3DL 3 A8F A8FB A8R 2DS4DELF 2DS4R2 WASSER STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4DEL 100 100 200 100 100 200 80 80 60 60 60
R4 3DL1E4 B1F B1R D4F D4R2 WASSER STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL1E9 100 50 100 200 350 80 80 60 60 60
R5 3DS1 B2F B1R C1F C1R WASSER STAT6F STAT6R P4B P5B - 2L 4 PSTAT6
2DL 4 100 100 80 80 440 80 80 60 60 60
R6 2DL 1 B3F B3R D3F D3R WASSER STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DP1 200 50 100 200 250 80 80 60 60 60
R7 2DS1 B4F B4R D2F D2R WASSER STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DL 5 200 100 200 200 100 80 80 60 60 60
R8 2DS3 B5F B5R D4F D5R WASSER STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL2E9 100 100 100 50 450 80 80 60 60 60
R9 3DL2E4 A1F A1R 2DS4WTF 2DS4R2 WASSER STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4WT 80 80 100 200 340 80 80 60 60 60
R10 2DS5 B6F2 B6R3 C5F C5R WASSER STAT6F STAT6R P4B P5B PSTAT6
2DS4TOTAL 80 80 100 100 440 80 80 60 60 60

Tabelle 2: Volumen (µL) von 100 µM Primer/Sonden Stammlösungen, Primer und Sonden Kombination Aliquote.

Name Richtung 5´ Änderung 3´ Änderung Sequenz (5' →3') Länge TM GC % Exon Position
P4a Sinn FAM BHQ-1 TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA		 27 60 44,4 4 425-451
P4b Antisense FAM BHQ-1 AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T		 28 62 50 4 576-603
P5b Sinn ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG		 25 60 52 5 828-852
P5b - 2DL 4 Sinn ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG		 25 61 56 5 828-852
P9 Sinn ATTO647N BHQ-2 CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC		 24 60 62,5 9 1246-1269
PSTAT6 ATTO550 BHQ-2 CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT		 26 62 50

Tabelle 3: Liste der Sonden verwendet in qKAT 1, 27. fluoreszierende Farbstoffe am 5'-Ende der Oligo-Sonden P5b, P5b - 2 DL 4, P9 und PSTAT6 wurden geändert, um ATTO-Farbstoffen.

Gen Primer Richtung Sequenz (5´-3´) Länge TM GC % Exon Position Amplifikate (bp) Allele übersehen werden
3DL2e4 A1F vorwärts GCCCCTGCTGAA
ATCAGG		 18 52 61,1 4 399-416 179 3DL 2 * 008, * 021 * 027, * 038.
A1R Rückwärts CTGCAAGGACAG
GCATCAA		 19 53 52,6 559-577 3DL 2 * 048
3DA1 A4F vorwärts GTCCCCTGGTGA
AATCAGA		 19 49 52,6 4 398-416 112 nichts
A5R Rückwärts GTGAGGCGCAAA
GTGTCA		 18 52 55,6 492-509 nichts
2DS2 A2F vorwärts GTCGCCTGGTGA
AATCAGA		 19 49 52,6 4 398-416 111 nichts
A6R Rückwärts TGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT		 21 51 42,9 488-508 nichts
3DL 3 A8Fa vorwärts GTGAAATCGGGA
GAGACG		 18 50 55,6 4 406-423 139 nichts
A8Fb vorwärts GGTGAAATCAGG
AGAGACG		 19 50 52,6 405-423 3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
A8R Rückwärts AGTTGACCTGGG
AACCCG		 18 51 61,1 526-543 nichts
3DL1e4 B1F vorwärts CATCGGTCCCAT
GATGCT		 18 51 55,6 4 549-566 85 3DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
B1R Rückwärts GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		 20 52 55 614-633 3DL 1 * 00502
3DS1 B2F vorwärts CATCGGTTCCAT
GATGCG		 18 51 55,6 4 549-566 85 3DS1 * 047; 3 DL 1 * 054 abholen kann.
B1R Rückwärts GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		 20 52 55 614-633 nichts
2DL 1 B3F vorwärts TTCTCCATCAGT
CGCATGAC		 20 52 50 4 544-563 96 2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
B3R Rückwärts GTCACTGGGAGC
TGACAC		 18 50 61,1 622-639 2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1 B4F vorwärts TCTCCATCAGTC
GCATGAA		 19 51 47,4 4 545-563 96 2DS1 * 001
B4R Rückwärts GGTCACTGGGAG
CTGAC		 17 49 64,7 624-640 nichts
2DS3 B5F vorwärts CTCCATCGGTCG
CATGAG		 18 53 61,1 4 546-563 96 nichts
B5R Rückwärts GGGTCACTGGGA
GCTGAA		 18 51 61,1 624-641 nichts
2DS5 B6F2 vorwärts AGAGAGGGGACG
TTTAACC		 19 50 52,6 4 475-493 173 nichts
B6R3 Rückwärts TCCAGAGGGTCA
CTGGGC		 18 53 66,7 630-647 2DS5 * 003
2DL 4 C1F vorwärts GCAGTGCCCAGC
ATCAAT		 18 52 55,6 5 808-825 83 nichts
C1R Rückwärts CCGAAGCATCTG
TAGGTCT		 19 52 52,6 872-890 2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 2 2DL2F4 vorwärts GAGGTGGAGGCC
CATGAAT		 19 52 57,9 5 778-796 151 2DL 2 * 009; 782G geändert a.
C3R2 Rückwärts TCGAGTTTGACC
ACTCGTAT		 20 51 45 909-928 nichts
2DS4 C5F vorwärts TCCCTGCAGTGC
GCAGC		 17 57 70,6 5 803-819 120 nichts
C5R Rückwärts TTGACCACTCGT
AGGGAGC		 19 52 57,9 904-922 2DS4 * 013
2DS4Del 2DS4Del vorwärts CCTTGTCCTGCA
GCTCCAT		 19 54 57,9 5 750-768 203 nichts
2DS4R2 Rückwärts TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		 20 53 50 933-952 nichts
2DS4FL 2DS4FL vorwärts CCGGAGCTCCTA
TGACATG		 19 53 57,9 5 744-762 209 nichts
2DS4R2 Rückwärts TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		 20 53 50 933-952 nichts
2DL 3 D1F vorwärts AGACCCTCAGGA
GGTGA		 17 48 58,8 9 1180-1196 156 nichts
D1R Rückwärts CAGGAGACAACT
TTGGATCA		 20 50 45 1316-1335 2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 und 2DL 3 * 01802
2DL 5 D2F vorwärts CACTGCGTTTTC
ACACAGAC		 20 52 50 9 1214-1233 120 2DL5B * 011 und 2DL5B * 020
D2R Rückwärts GGCAGGAGACAA
TGATCTT		 19 49 47,4 1315-1333 nichts
2DP1 D3F vorwärts CCTCAGGAGGTG
ACATACGT		 20 53 55 9 1184-1203 121 nichts
D3R Rückwärts TTGGAAGTTCCG
TGTACACT		 20 50 45 1285-1304 nichts
3DL1e9 D4F vorwärts CACAGTTGGATC
ACTGCGT		 19 52 52,6 9 1203-1221 93 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
D4R2 Rückwärts CCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA		 23 53 43,5 1273-1295 3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9 D4F vorwärts CACAGTTGGATC
ACTGCGT		 19 52 52,6 9 1203-1221 156 nichts
D5R Rückwärts GACCTGACTGTG
GTGCTCG		 19 54 63,2 1340-1358 nichts
STAT6 STAT6F vorwärts CCAGATGCCTAC
CATGGTGC		 20 54 60 129
STAT6R Rückwärts CCATCTGCACAG
ACCACTCC		 20 54 60

Tabelle 4: Sequenzen der Primer verwendet in qKAT 1, 27.

KIR gen 3DL 3 2DS2 2DL 2 2DL 3 2DP1 2DL 1 3DA1 2DL 4 3DL 1
EX9		 3DL 1
EX9		 3DS1 2DL 5 2DS3 2DS5 2DS1 2DS4
gesamt		 2DS4
FL		 2DS4
DEL		 3DL 2
ex4		 3DL 2
EX9
Am häufigsten Kopienzahl 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2

Tabelle 5: Am häufigsten Exemplarzahl für KIR Gene, die häufig in europäischen stammende Proben beobachtet.

Gestänge Ungleichgewicht Regeln für qKAT basierend auf europäischen Bevölkerungen Kopie-Prüfung
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 und KIR3DL2 sind Rahmen Gene auf beide Haplotypen vorhanden. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 und KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 und KIR2DL2 sind mit einander in LD 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 und KIR2DL3 sind Allele des gleichen Gens 2 DL 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 und KIR2DL1 sind mit einander in LD 2DP1=2 DL 1
5 Exon 4 von KIR3DL1 und KIR3DL2 ist jeweils gleich Exon 9 KIR3DL1 und KIR3DL2 . 3DL1ex4=3DL1ex9 und 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 und KIR3DS1 sind Allele 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 und KIR2DS5 sind in LD mit KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 und KIR2DS1 sind in LD 3DS1=2DS1
9 Vorhandensein von KIR2DS1 und KIR2DS4Tuerprofil ist gegenseitig auf einen Haplotyp 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL und KIR2DS4del sind Varianten des KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tabelle 6: Verknüpfung Ungleichgewicht zwischen KIR Gene, die häufig in europäischen Ursprungs Populationen beobachtet können zur Kopie Zahlendaten überprüfen 1,27.

Discussion

Wir beschrieben eine neue halbautomatische Hochdurchsatz-Methode, genannt qKAT, das erleichtert die Kopie Nummer eingeben, KIR Gene. Die Methode ist eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden wie SSP-PCR, die niedrig-Durchsatz und können nur zeigen das Vorhandensein oder Fehlen dieser höchst polymorphen Gene.

Die Genauigkeit der erhaltenen Kopie Zahl Daten ist abhängig von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Qualität und Konzentration-Einheitlichkeit der gDNA Proben und die Qualität der Reagenzien. Die Qualität und Genauigkeit der gDNA Proben über einen Teller sind extrem wichtig, da Schwankungen in der Konzentration auf den Teller legen Fehler bei der Berechnung der Kopienzahl führen können. Da die Assays mit europäischen Ursprungs-Sample-Sets validiert wurden, benötigen Daten von Kohorten aus anderen Teilen der Welt eine gründlichere Prüfungen. Dies soll sicherstellen, dass Instanzen von Allel ausfallende oder nicht-spezifische Primer/Sonden Bindung nicht als Copy Number Variation fehlinterpretiert werden.

Während die Assays wurden entworfen und optimiert, um als Hochdurchsatz-laufen, können sie geändert werden, um weniger Beispiele auszuführen. Vertrauen-Metrik in der Kopie Zahl Analysesoftware ist betroffen, wenn weniger Proben analysieren, aber dies kann verbessert werden, wenn Kontrolle genomische DNA-Proben mit bekannten KIR gen Ausfertigung eine eigene Nummer auf dem Teller enthalten sind und zusätzliche Probe repliziert werden iinklusive.

Für Labors ohne Flüssigkeit/Platte-Handling-Roboter master-Mix mit Mehrkanal-Pipetten verzichtet werden kann und Platten können manuell in das qPCR-Gerät geladen werden.

Das Hauptziel hinter der Entwicklung des qKAT war eine einfache, hohem Durchsatz, hochauflösende und kostengünstige Methode, Genotyp KIRs für Krankheit Assoziationsstudien erstellen. Dies wurde erfolgreich, da qKAT beschäftigt war, bei der Untersuchung der Rolle von KIR in mehrere große Krankheit Assoziationsstudien, einschließlich einer Reihe von Infektionskrankheiten, Autoimmunerkrankungen und Schwangerschaft Störungen4, 24 , 25 , 26.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Das Projekt erhielt Fördermittel aus dem Medical Research Council (MRC), der European Research Council (ERC) Programms der Europäischen Union Horizont 2020 Forschung und Innovation (Grant Agreement Nr. 695551) und das National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedizinischen Forschungszentrum und NIH Forschung Blut- und Transplant Research Unit (NIHR BTRU) im Bereich der Organspende und Transplantation an der University of Cambridge und in Partnerschaft mit NHS Blood and Transplant (NHSBT). Die geäußerten Meinungen sind diejenigen der Autoren und nicht unbedingt der NHS, die NIHR, das Department of Health oder die NHSBT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Oligonucleotides Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit Bioline BIO-86020 −
MilliQ water − − −
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor Eppendorf(or equivalent) Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000
OR
QuBit Fluorometer Life Technologies Q33216
Matrix Hydra Thermo Scientific 109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well Roche 05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) Caliper Life Sciences 204135
Vortex mixer Biosan BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) Gilson(or equivalent) F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) Starlab (or equivalent) S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL STARLAB E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube STARLAB E1450-0200
96-well deep well plate Fisher Scientific 12194162
LC480 384 Multi-well plates Roche 04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil Roche 04729757001
Name Company Catalog Number Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

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Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di,… More

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).

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