Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

qKAT: kvantitative Semi-automated å skrive Killer-cellen immunglobulin-lignende reseptor gener

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58646
Automatic Translation
1,2,3,4, 1, 1,5, 1,6, 1,7, 1
1Department of Pathology, University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences, University of Cambridge

Summary

Kvantitativ killer celle immunglobulin-lignende reseptor (KIR) semi-automatisk skrive (qKAT) er en enkel, høy gjennomstrømming og kostnadseffektiv metode å kopiere nummer type KIR gener for programmet i befolkningen og sykdom association studier.

Abstract

Killer celle immunglobulin-like reseptorer (KIRs) er et sett med hemmende og aktivere immun reseptorer, naturlig killer (NK) og T-celler, kodet av en polymorfisk klynge av gener på kromosom 19. Deres best preget ligander er de menneskelige leukocytter antigen (HLA) molekylene som er kodet i store histocompatibility kompleks (MHC) locus på kromosom 6. Det er betydelige bevis for at de spiller en betydelig rolle i immunitet, reproduksjon og transplantasjon, slik at det er avgjørende å ha teknikker som kan nøyaktig genotype dem. Men gjør høy-sekvens homologi, så vel som allel og kopi nummer varianten, det vanskelig å design metoder som kan nøyaktig og effektivt genotype alle KIR gener. Tradisjonelle metoder er vanligvis begrenset i oppløsningen av data innhentet, gjennomstrømning, kostnadseffektivitet og tiden konfigurere og kjøre eksperimenter. Vi beskriver en metode som kalles kvantitative KIR halvautomatisk skriver (qKAT), som er en høy gjennomstrømming multiplex sanntid polymerase kjedereaksjon metode som kan avgjøre genet kopi tallene for alle gener i KIR locus. qKAT er en enkel metode for høy gjennomstrømming som kan gi høy oppløsning KIR kopi nummer data, som kan brukes til å overvåke variasjoner i de strukturelt polymorfe haplotypes som omfatter dem videre. Kopier nummer og haplotype dataene kan være gunstig for studier av storskala sykdom foreninger samt Populasjonsgenetikk og undersøkelser på uttrykk og funksjonell samhandling mellom KIR og HLA.

Introduction

Hos mennesker, killer immunglobulin-lignende reseptoren(KIR) locus er tilordnet på den lange arm av kromosom 19 i leukocytter receptor komplekse (LRC). Denne locus er rundt 150 kb i lengde og inneholder 15 KIR gener arrangert hodet til-hale. KIR loci som er kjente er KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, og to pseudogenes, KIR2DP1 og KIR3DP1. KIR genene kode for todimensjonale (2D) og tredimensjonale (3D) immunglobulin-lignende domene reseptorer med korte (S, aktivere) eller lange (L; hemmende) cytoplasmiske hale, som er uttrykt av naturlige killer (NK) celler og delsett av T celler. Kopier nummer variant utstilt i skjemaene KIR locus ulike haplotypes med variabel genet innhold1. Non-allel homologe rekombinasjon (NAHR), tilrettelagt av en nær hode til hale genet ordningen og høy-sekvens homologi, er mekanismen foreslått å være ansvarlig for haplotypic variasjon. Over 100 forskjellige haplotypes er rapportert i befolkninger over hele verden1,2,3,4. Alle disse haplotypes kan deles inn i to store grupper: A og B haplotypes. A-haplotype inneholder 7 KIR gener: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1og KIR3DL2, som er hemmende KIR gener og aktivere KIR gene KIR2DS4. Imidlertid opp til 70% av europeiske opprinnelse personer som er homozygous for KIR haplotype A utelukkende bære en ikke-fungerende "sletting av" form for KIR2DS45,6. Alle andre KIR genet kombinasjoner danne gruppe B haplotypes, inkludert minst én av bestemte KIR gener KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, og KIR2DL5, og som typisk omfatter to eller flere aktivering KIR gener.

HLA klasse I molekyler har blitt identifisert som ligander for visse hemmende reseptorer (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3og KIR3DL1), aktivere reseptorer (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, og KIR3DS1), og for KIR2DL4, som er en unik KIR som inneholder en lang cytoplasmiske hale som andre hemmende KIR-reseptorer, men har også et positivt ladet rester nær ekstracellulære domenet som er en vanlig funksjon av andre aktivering KIR -reseptorer. Kombinasjonen av varianter KIR gener og HLA gener påvirker reseptor ligand samhandling som figurer potensielle NK celle respons på enkelte nivå7,8. Bevis fra genetisk association studier har indikert at KIR spiller en rolle i viral motstand (f.eks., humant immunsviktvirus [HIV]9 og hepatitt C-viruset [HCV]10), suksess for transplantasjon 11, risikoen for graviditet lidelser og reproduktive suksess12,13, beskyttelse mot tilbakefall etter allogene blodkreft stilk cellen transplantasjon (HSCT)14,15, 16, og risikoen for kreft17.

Kombinasjonen av høy-sekvens homologi og allel og haplotypic mangfold presenterer utfordringer i oppgaven med nøyaktig genotyperingteknologi KIR gener. Konvensjonelle metoder å skrive KIR gener omfatte sekvens-spesifikke primer (SSP) polymerase kjedereaksjon (PCR)18,19,20, sekvens-spesifikke oligonucleotide sonde (SSOP) PCR21, og Matrix assistert laser desorption ionization-tid på fly massespektrometri (MALDI-TOF MS)22. Ulempene ved disse teknikkene er at de bare gir delvis innsikt genotype av en individuell mens være arbeidskrevende å utføre. Neste generasjons sekvensering (NGS) har nylig brukt til typen KIR locus spesielt. Denne metoden er svært kraftig, det kan være dyrt å kjøre, og det er tidkrevende å gjennomføre dyptgående analyse og data sjekker.

qKAT er en høy gjennomstrømming kvantitative PCR metode. Mens konvensjonelle metoder er arbeidskrevende og tidkrevende, denne metoden gjør det mulig å kjøre nesten 1000 genomisk DNA (gDNA) prøver i fem dager og gir KIR genotype, samt hvor genet kopi. qKAT består av ti multiplex reaksjoner, hvorav hver mål to KIR loci og referanse genet av en fast kopi i genomet (STAT6) brukes for den relative kvantifiseringen av KIR genet Kopier nummer23. Denne analysen har blitt brukt i studier med store befolkning paneler og sykdom kohorter på smittsomme sykdommer som hepatitt c, autoimmune tilstander som type 1 diabetes, og graviditet lidelser som preeclampsia, samt gi en genetisk underbygger studier rettet mot å forstå NK celle funksjon1,4,24,25,26.

Protocol

1. forberedelse og Plating av DNA

  1. Nøyaktig kvantifisere gDNA konsentrasjonen med en Spektrofotometri eller fluorometric instrument.
  2. Fortynne DNA til 4 ng/µL på en 96-brønns dyptgående brønn plate. Inneholde minst én kontroll gDNA prøven med noen kjente eksemplaret og en ikke-mal kontroll.
  3. Sentrifuge 96-brønns platene på 450 x g i 2 minutter.
  4. Bruke en flytende håndtering instrument, dispensere hvert utvalg i quadruplicate på 384-vel qPCR plater slik at hver brønn har 10 ng DNA (2,5 µL/vel). Forbered minst ti 384-vel plater, en for hver qKAT reaksjon.
  5. Hvis gDNA er utlevert fra flere 96-brønns plate, kan du utføre en hele volumet vask med 2% blekemiddel og ultrapure vann å feilfri nålene av væsken håndteringssystem mellom hver 96-brønns plate av gDNA prøver.
  6. Air-Dry DNA av rugende 384-og plater i et rent område ved romtemperatur for minst 24 timer.

2. forberedelse av primere og sonder

Merk: qKAT består av ti multiplex reaksjoner. Hver reaksjon inkluderer tre primer par og tre fluorescens-merket sonder som spesielt forsterke to KIR gener og en referanse genet. Sonder som ble publisert i Jiang et al.27 ble endret slik at oligonucleotides er nå merket med ATTO fargestoffer siden de tilbyr forbedret photostability og lang signal levetid. Pre-aliquoted primer er kommersielt tilgjengelig (se Tabell for materiale).

  1. Forberede primer kombinasjoner for hver reaksjon som fortynninger gitt i tabell 1.
  2. Forbered sonden kombinasjoner for hver reaksjon som tabell 1. Teste hver individuelle probe før kombinasjonen.

3. forberedelse av Master Mix

Merk Volumer som er nevnt nedenfor er til å utføre en qKAT reaksjonen på et sett med 10 x 384-og plater.

  1. Kontroller at gDNA prøvene belagt på 384-vel platene er helt tørt. Utføre alle skritt på is og holde reagensene dekket fra eksponering for lys som mulig siden fluorescens-merket sonder er foto - og thermo-sensitive.
  2. Tine qPCR buffer, primer og sonde dele på 4 ° C.
  3. På is, forberede en master blanding 10 x 384-vel plater ved å legge 18.86 mL ultrapure vann, 20 mL qPCR buffer, 1000 µL preprepared primer kombinasjon og 180 µL preprepared sonde kombinasjon (tabell 2).
  4. Distribuere master blandingen jevnt over en 96-dyp godt plate med en flerkanals pipette, pipettering 415 µL i hver brønn. Holde denne platen i en isen boksen dekket fra lys.
  5. Bruker en flytende håndtering instrument, dispensere 9,5 µL av master blandingen i hver brønn av 384-vel plate med tørket gDNA. Forsegle platen med en folie og plasser det straks på 4 ° C. Gjenta denne prosessen for de gjenværende platene sikrer at nålene av væsken håndteringssystem er vasket med vann mellom hver plate.
  6. Sentrifuge 384-vel platene på 450 x g for 3 min og ruge dem på 4 ° C over natten eller mellom 6-12 h resuspend DNA og spre eventuelle luftbobler.

4. qPCR analysen

  1. Etter den natten inkubering, sentrifuge 450 x g for 3 min å spre noen gjenværende luftbobler.
  2. I forbindelse med automatisering, kobler qPCR maskinen (f.eks LightCycler 480) til en microplate hånd (se Tabell for materiale). Program microplate behandleren å plassere plater i qPCR maskinen fra en avkjølt oppbevaring dokk som er beskyttet mot lyset.
    Merk i analyser skal, i teorien, fungere på andre qPCR maskiner med kompatibel optisk innstillinger.
  3. Bruk følgende sykling: 95 ° C i 5 min etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C for 15 s og 66 ° C for 50 s, datainnsamling på 66 ° C.
  4. Når kjøringen er fullført, har roboten samle plate fra qPCR maskinen og plasser den i Forkast dock.

5. etter Kjør analyse

  1. Etter forsterkning, beregne kvantifisering syklus (Cq) verdiene med den andre avledede maksimale metoden eller metoden passer poeng med programvare qPCR maskinen (se Tabell for materiale), følge trinnene nedenfor.
  2. Åpne programmet qPCR og åpne filen lagret reaksjon eksperiment for en plate i kategorien Navigator .
  3. For analyse ved hjelp av andre avledede maksimal metoden, Velg kategorien analyse, og Opprett en ny analyse bruker Abs Quant/Second derivat Max metoden.
    1. Velg analysetypen i vinduet Opprett ny analyse : Abs Quant/Second derivat Max metoden, delsett: alle prøver, program: forsterkning, navn: Rx-DFO (der x er nummeret på reaksjon).
    2. Velg Filter kam og velg VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Dette sikrer at data som samles inn for STAT6 er valgt.
    3. Velg farge kompensasjon for VIC/HEX/Yellow555(533-580). Klikk Beregn. Gjenta dette for Fam (465-510) og Cy5/Cy5.5(618-660). Klikk Lagre fil.
  4. For analyse med metoden passer poeng, Velg Abs Quant/passe poeng i kategorien analyser.
    1. Velg analysetypen i vinduet Opprett ny analyse : Abs Quant/passe poeng metoden, delsett: alle prøver, program: forsterkning, navn: RxF-DFO (der x er nummeret på reaksjon).
    2. Velg riktig filtre og farge kompensasjoner for STAT6 og hver av KIR genene (Fam/Cy5). I kategorien Noiseband angi støy bandet utelate bakgrunnsstøy.
    3. I kategorien analyse satt passer poeng til 3 og velger Vis passer poeng. Klikk Beregn. Klikk Lagre fil.

6. eksport av resultatene

  1. QPCR programvaren, åpne Navigator kategorien Velg Resultater kjørselen Eksporter.
  2. Åpne mappen der eksperiment filene lagres og overføre filer til den høyre delen av vinduet. Klikk neste. Velg navnet og plasseringen for eksportfilen.
  3. Velg analysetypen Abs Quant/Second derivat Max metode eller Abs Quant/passe poeng. Klikk neste. Kontroller at navnet på filen og Eksporter mappen analysetypen er riktige, og klikker neste for å starte eksportprosessen.
  4. Vent til Eksportere Status er Ok. Skjermen vil automatisk gå til neste trinn. Kontroller at alle merkede filer har eksportert slik at antall filer mislyktes = 0. Klikk gjort.
  5. Bruke skript split_file.pl og roche2sds.pl for å dele eksporterte platene i personlige reaksjoner for hver plate.
    Merk skriptene leveres på forespørsel/GitHub.

7. Kopier antall beregninger

  1. Åpne kopi nummer analyseprogramvare (f.eks CopyCaller). Velg Importer sanntid PCR filen og laste tekst fil-størrelse skapt av roche2sds.pl.
  2. Velg analyser og utføre analyse av enten velge kalibrator utvalg med kjente eksemplaret nummer eller velge hyppigste antall kopier. Se tabell 5 for hyppigste kopi antall KIR gener vanligvis observert europeiske opprinnelse bestander.

8. datakvaliteten sjekker

  1. Bruke R-skriptet KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R kombinere kopi nummer data fra alle platene i et regneark.
    Merk skriptene leveres på forespørsel/GitHub.
  2. Kontroller rådata om kopi nummer analyseprogramvare for prøver som ikke samsvarer med den kjente sammenhengen ulikevekt (LD) for KIR gener (tabell 6).

Representative Results

Kopier nummer analyse kan utføres ved å eksportere filene til kopi nummer analyseprogramvare, som gir de anslåtte og beregnede kopi basert på metoden ΔΔCq.

Antall kopier kan forutsies enten basert på kjente eksemplaret antall kontroll DNA-prøver på tallerkenen eller ved inntastingen hyppigste genet kopi nummeret (tabell 5). Figur 1 viser resultatene av en plate for en reaksjon som er rettet mot KIR2DL4 og KIR3DS1, samt referanse genet STAT6. Hyppigste kopi nummeret for KIR2DL4, et rammeverk gen i KIR locus, er to eksemplarer, mens hyppigste kopi nummeret for KIR3DS1, en aktivering genet, er en kopi. Resultatene i figuren viser PCR forsterkning tomter observert på qPCR programvare og kopi-datatypen tall som er generert fra qPCR data. Som vises, er analysen kunne skille mellom 0, 1, 2, 3 og 4 KIR genet kopi tallene. Kopier nummer analyseprogramvare kan også en visning av fordelingen av antall kopier over tallerkenen som et sektordiagram eller et stolpediagram. Effekten av kopi nummer er lavere for prøver med mange kopi.

Kvaliteten på alle materialer i reaksjoner, gDNA, buffer, primere og sonder, kan påvirke nøyaktigheten av resultatene. Men er discordance i resultater mest sannsynlig skyldes variasjon i konsentrasjonen av DNA på en plate. Renheten på den utpakkede gDNA, som kan måles med 260/280 og 260/230 prosenter, kan også ha en effekt på kvaliteten. 260/280 forholdet 1,8-2 og 260/230 forholdet mellom 2-2.2 er ønskelig. En ujevn utvalg av DNA konsentrasjoner på tvers av en plate kan føre til en høy variasjon i terskelen syklus (Ct) mellom prøver og discordance mellom antall estimerte kopier. Resultatene i figur 2 viser effekten forskjellen mellom Ct over en plate kan ha på nøyaktigheten i prediksjon av antall kopier. Den røde linjen angir utvalget antall estimerte kopi for et utvalg og ideelt sett bør være så nær et heltall som mulig.

Kopier nummer dataene, en gang analysert, kan eksporteres som en regnearkfil i 96-brønnen format. Vi brukte en R skript (tilgjengelig påforespørsel) kombinere kopi nummer dataene av alle 10 plater som kjøres som et sett i ett regneark. Publiserte data om KIRs fra hovedsakelig europeisk opprinnelse populasjoner kan prediksjon av LD regler som eksisterer mellom ulike gener i KIR komplekse1. Disse spådommene brukes nedstrøms sjekker på kopi nummer resultatene (tabell 6). Prøver som ikke samsvarer med den anslåtte LD mellom genene kan inneholde uvanlig polymorfisme eller haplotypic strukturelle varianter. Et flytskjema som beskriver protokollen er vist i Figur 3.

Et verktøy kalt KIR Haplotype identifikator (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) ble utviklet for å lette fremsi haplotypes fra datasettet. Fremsi fungerer basert på en liste over referanse haplotypes observert i europeiske opprinnelse befolkningen1. Men lar også verktøyet for et egendefinert sett med referanse haplotypes brukes i stedet. Tre separate filer genereres; den første filen viser alle haplotype kombinasjoner for et utvalg, den andre filen inneholder en trimmet liste haplotypes kombinasjoner som har de høyeste kombinerte frekvensene, og den tredje filen viser prøvene som ikke kan tilordnes haplotypes. Non-tildeling av haplotypes kan brukes som en indikator på romanen haplotypes.

Figure 1
Figur 1: representant resultatene av en plate for reaksjonen nummer 5. (A) dette panelet viser forsterkning tomter. (B) dette panelet viser Kopier nummer tomter. (C) dette panelet viser kopi nummer fordelingen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representant resultatene av en plate med en variabel DNA konsentrasjon for reaksjonen nummer 5. (A) dette panelet viser forsterkning tomter. (B) dette panelet viser Kopier nummer tomter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: flytskjema for qKAT protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Analysen Gener Fremover primere Konsentrasjon (nM) Omvendt primere Konsentrasjon (nM) Sonder Konsentrasjon (nM)
No 1 3DP1 A4F 250 A5R 250 P4a 150
2DL 2 2DL2F4 400 C3R2 600 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 2 2DS2 A4F 400 A6R 400 P4a 200
2DL 3 D1F 400 D1R 400 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 3 3DL 3 A8F 500 A8R 500 P4a 150
2DS4Del 2DS4Del 250 2DS4R2 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 4 3DL1e4 B1F 250 B1R 125 P4b 150
3DL1e9 D4F 250 D4R2 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 5 3DS1 B2F 250 B1R 250 P4b 150
2DL 4 C1F 200 C1R 200 P5b - 2DL 4 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr 6 2DL 1 B3F 500 B3R 125 P4b 150
2DP1 D3F 250 D3R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr. 7 2DS1 B4F 500 B4R 250 P4b 150
2DL 5 D2F 500 D2R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 8 2DS3 B5F 250 B5R 250 P4b 150
3DL2e9 D4F 250 D5R 125 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 9 3DL2e4 A1F 200 A1R 200 P4a 150
2DS4FL 2DS4FL 250 2DS4R2 500 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Ingen 10 2DS5 B6F2 200 B6R3 200 P4b 150
2DS4 C5F 250 C5R 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150

Tabell 1: kombinasjon og konsentrasjon av primere og sonder i hver qKAT reaksjon 27 .

Reaksjon Primer dele (µL) Sonden dele (µL)
R1 3DP1 A4F A5R 2DL2F4 C3R2 VANN STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DL 2 100 100 160 240 200 80 80 60 60 60
R2 2DS2 A2F A6R D1F D1R VANN STAT6F STAT6R P4A P9 PSTAT6
2DL 3 160 160 160 160 160 80 80 80 60 60
Merk: trenger 20 µL mindre vann i MasterMix
R3 3DL 3 A8F A8FB A8R 2DS4DELF 2DS4R2 VANN STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4DEL 100 100 200 100 100 200 80 80 60 60 60
R4 3DL1E4 B1F B1R D4F D4R2 VANN STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL1E9 100 50 100 200 350 80 80 60 60 60
R5 3DS1 B2F B1R C1F C1R VANN STAT6F STAT6R P4B P5B - 2L 4 PSTAT6
2DL 4 100 100 80 80 440 80 80 60 60 60
R6 2DL 1 B3F B3R D3F D3R VANN STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DP1 200 50 100 200 250 80 80 60 60 60
R7 2DS1 B4F B4R D2F D2R VANN STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DL 5 200 100 200 200 100 80 80 60 60 60
R8 2DS3 B5F B5R D4F D5R VANN STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL2E9 100 100 100 50 450 80 80 60 60 60
R9 3DL2E4 A1F A1R 2DS4WTF 2DS4R2 VANN STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4WT 80 80 100 200 340 80 80 60 60 60
R10 2DS5 B6F2 B6R3 C5F C5R VANN STAT6F STAT6R P4B P5B PSTAT6
2DS4TOTAL 80 80 100 100 440 80 80 60 60 60

Tabell 2: (ΜL) mengder 100 µM primer/sonde lager løsninger primer og undersøke kombinasjon dele.

navn Retning 5´ endring 3´ endring Sekvens (5' →3') Lengde TM GC % Ekson Posisjon
P4a Følelse FAM BHQ-1 TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA		 27 60 44.4 4 425-451
P4b Antisense FAM BHQ-1 AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T		 28 62 50 4 576-603
P5b Følelse ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG		 25 60 52 5 828-852
P5b - 2DL 4 Følelse ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG		 25 61 56 5 828-852
P9 Følelse ATTO647N BHQ-2 CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC		 24 60 62,5 9 1246-1269
PSTAT6 ATTO550 BHQ-2 CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT		 26 62 50

Tabell 3: liste over sonder i qKAT 1, 27. fluorescerende fargestoffer brukes på 5' slutten av oligo sonder P5b, P5b - 2 DL 4, P9 og PSTAT6 ble endret til ATTO fargestoffer.

Gene Primere Retning Sekvens (5´-3´) Lengde TM GC % Ekson Posisjon Amplicon (bp) Alleler kunne være savnet
3DL2e4 A1F Fremover GCCCCTGCTGAA
ATCAGG		 18 52 61.1 4 399-416 179 3DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038.
A1R Omvendt CTGCAAGGACAG
GCATCAA		 19 53 52.6 559-577 3DL 2 * 048
3DP1 A4F Fremover GTCCCCTGGTGA
AATCAGA		 19 49 52.6 4 398-416 112 Ingen
A5R Omvendt GTGAGGCGCAAA
GTGTCA		 18 52 55.6 492-509 Ingen
2DS2 A2F Fremover GTCGCCTGGTGA
AATCAGA		 19 49 52.6 4 398-416 111 Ingen
A6R Omvendt TGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT		 21 51 42.9 488-508 Ingen
3DL 3 A8Fa Fremover GTGAAATCGGGA
GAGACG		 18 50 55.6 4 406-423 139 Ingen
A8Fb Fremover GGTGAAATCAGG
AGAGACG		 19 50 52.6 405-423 3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
A8R Omvendt AGTTGACCTGGG
AACCCG		 18 51 61.1 526-543 Ingen
3DL1e4 B1F Fremover CATCGGTCCCAT
GATGCT		 18 51 55.6 4 549-566 85 3DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
B1R Omvendt GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		 20 52 55 614-633 3DL 1 * 00502
3DS1 B2F Fremover CATCGGTTCCAT
GATGCG		 18 51 55.6 4 549-566 85 3DS1 * 047; kan plukke opp 3DL 1 * 054.
B1R Omvendt GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		 20 52 55 614-633 Ingen
2DL 1 B3F Fremover TTCTCCATCAGT
CGCATGAC		 20 52 50 4 544-563 96 2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
B3R Omvendt GTCACTGGGAGC
TGACAC		 18 50 61.1 622-639 2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1 B4F Fremover TCTCCATCAGTC
GCATGAA		 19 51 47,4 4 545-563 96 2DS1 * 001
B4R Omvendt GGTCACTGGGAG
CTGAC		 17 49 64.7 624 640 Ingen
2DS3 B5F Fremover CTCCATCGGTCG
CATGAG		 18 53 61.1 4 546-563 96 Ingen
B5R Omvendt GGGTCACTGGGA
GCTGAA		 18 51 61.1 624-641 Ingen
2DS5 B6F2 Fremover AGAGAGGGGACG
TTTAACC		 19 50 52.6 4 475-493 173 Ingen
B6R3 Omvendt TCCAGAGGGTCA
CTGGGC		 18 53 66,7 630-647 2DS5 * 003
2DL 4 C1F Fremover GCAGTGCCCAGC
ATCAAT		 18 52 55.6 5 808-825 83 Ingen
C1R Omvendt CCGAAGCATCTG
TAGGTCT		 19 52 52.6 872-890 2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 2 2DL2F4 Fremover GAGGTGGAGGCC
CATGAAT		 19 52 57,9 5 778-796 151 2DL 2 * 009; 782G til A.
C3R2 Omvendt TCGAGTTTGACC
ACTCGTAT		 20 51 45 909-928 Ingen
2DS4 C5F Fremover TCCCTGCAGTGC
GCAGC		 17 57 70.6 5 803-819 120 Ingen
C5R Omvendt TTGACCACTCGT
AGGGAGC		 19 52 57,9 904-922 2DS4 * 013
2DS4Del 2DS4Del Fremover CCTTGTCCTGCA
GCTCCAT		 19 54 57,9 5 750-768 203 Ingen
2DS4R2 Omvendt TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		 20 53 50 933-952 Ingen
2DS4FL 2DS4FL Fremover CCGGAGCTCCTA
TGACATG		 19 53 57,9 5 744-762 209 Ingen
2DS4R2 Omvendt TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		 20 53 50 933-952 Ingen
2DL 3 D1F Fremover AGACCCTCAGGA
GGTGA		 17 48 58.8 9 1180-1196 156 Ingen
D1R Omvendt CAGGAGACAACT
TTGGATCA		 20 50 45 1316-1335 2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 og 2DL 3 * 01802
2DL 5 D2F Fremover CACTGCGTTTTC
ACACAGAC		 20 52 50 9 1214-1233 120 2DL5B * 011 og 2DL5B * 020
D2R Omvendt GGCAGGAGACAA
TGATCTT		 19 49 47,4 1315-1333 Ingen
2DP1 D3F Fremover CCTCAGGAGGTG
ACATACGT		 20 53 55 9 1184-1203 121 Ingen
D3R Omvendt TTGGAAGTTCCG
TGTACACT		 20 50 45 1285-1304 Ingen
3DL1e9 D4F Fremover CACAGTTGGATC
ACTGCGT		 19 52 52.6 9 1203-1221 93 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
D4R2 Omvendt CCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA		 23 53 43.5 1273-1295 3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9 D4F Fremover CACAGTTGGATC
ACTGCGT		 19 52 52.6 9 1203-1221 156 Ingen
D5R Omvendt GACCTGACTGTG
GTGCTCG		 19 54 63,2 1340-1358 Ingen
STAT6 STAT6F Fremover CCAGATGCCTAC
CATGGTGC		 20 54 60 129
STAT6R Omvendt CCATCTGCACAG
ACCACTCC		 20 54 60

Tabell 4: sekvenser av primere brukt i qKAT 1, 27.

KIR genet 3DL 3 2DS2 2DL 2 2DL 3 2DP1 2DL 1 3DP1 2DL 4 3DL 1
EX9		 3DL 1
EX9		 3DS1 2DL 5 2DS3 2DS5 2DS1 2DS4
Totalt		 2DS4
FL		 2DS4
DEL		 3DL 2
ex4		 3DL 2
EX9
Hyppigste antall kopier 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2

Tabell 5: Hyppigste kopi nummer for KIR gener ofte observert i europeiske opprinnelse prøver.

Sammenhengen ulikevekt regler for qKAT basert på europeiske befolkninger Kopier nummer av
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 og KIR3DL2 er rammen gener stede på begge haplotypes. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 og KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 og KIR2DL2 er i LD med hverandre 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 og KIR2DL3 er alleler på det samme genet 2 DL 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 og KIR2DL1 er i LD med hverandre 2DP1=2 DL 1
5 Ekson 4 KIR3DL1 og KIR3DL2 er lik ekson 9 i KIR3DL1 og KIR3DL2 . 3DL1ex4=3DL1ex9 og 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 og KIR3DS1 er alleler 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 og KIR2DS5 er i LD med KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 og KIR2DS1 er i LD 3DS1=2DS1
9 KIR2DS1 og KIR2DS4Total er gjensidig utelukkende på en haplotype 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL og KIR2DS4del er varianter av KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tabell 6: sammenhengen ulikevekt mellom KIR gener ofte observert europeiske opprinnelse bestander kan brukes til å kontrollere kopi talldata 1,27.

Discussion

Vi beskrev en roman halvautomatisk høy gjennomstrømming metoden, kalles qKAT, som muliggjør kopi tallinntasting av KIR gener. Metoden er en forbedring over konvensjonelle metoder som SSP-PCR, som lav gjennomstrømming og kan bare angi tilstedeværelse eller fravær av disse svært sammensatte gener.

Nøyaktigheten av kopi nummer dataene innhentet er avhengig av flere faktorer, inkludert kvaliteten og konsentrasjon-enhetlig gDNA prøvene og kvaliteten på reagenser. Kvaliteten og nøyaktigheten av gDNA prøvene over en plate er svært viktig siden variasjoner i konsentrasjon over platen kan føre til feil i beregning av antall kopier. Siden analyser ble validert ved hjelp av europeiske opprinnelse Prøvesett, krever data fra kohorter fra andre deler av verden mer grundige kontroller. Dette er å sikre at forekomster av allelet dropout eller uspesifisert primer/sonde binding ikke er feiltolkes som kopien antall variant.

Mens analyser ble designet og optimalisert for å kjøre som høy gjennomstrømming, kan de endres for å kjøre færre prøver. Tillit beregningen i kopi nummer analyseprogramvare påvirkes når du analyserer færre prøver, men dette kan bli bedre hvis kontrollen genomisk DNA-prøver med et kjent KIR genet kopi nummer finnes på platen og flere eksempler gjentak inkludert.

For laboratorier uten væske/plate-håndtering roboter, master blanding kan bli utlevert med flerkanals Pipetter og plater manuelt kan lastes inn i qPCR-apparatet.

Hovedformålet bak utviklingen av qKAT var å lage en enkel, høy gjennomstrømming, høy oppløsning og kostnadseffektiv metode til genotype KIRs for sykdom association studier. Dette var oppnådd siden qKAT har vært ansatt i undersøke rollen av KIR i flere store sykdom association studier, inkludert en rekke smittsomme sykdommer, autoimmune tilstander og graviditet lidelser4, 24 , 25 , 26.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Mottok landsbyen stønad fra Medical Research Council (MRC), European Research Council (ERC) under EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet (grant avtalen nr. 695551) og National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedisinsk forskningssenter og NIH forskning blod og transplantere Research Unit (NIHR BTRU) i orgel donasjon og transplantasjon ved University of Cambridge og i samarbeid med NHS blod og transplantasjon (NHSBT). Synspunktene er de av forfatterne, og ikke nødvendigvis de av NHS, NIHR, Department of Health eller i NHSBT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Oligonucleotides Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit Bioline BIO-86020 −
MilliQ water − − −
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor Eppendorf(or equivalent) Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000
OR
QuBit Fluorometer Life Technologies Q33216
Matrix Hydra Thermo Scientific 109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well Roche 05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) Caliper Life Sciences 204135
Vortex mixer Biosan BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) Gilson(or equivalent) F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) Starlab (or equivalent) S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL STARLAB E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube STARLAB E1450-0200
96-well deep well plate Fisher Scientific 12194162
LC480 384 Multi-well plates Roche 04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil Roche 04729757001
Name Company Catalog Number Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, W., et al. Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors. Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).
  2. Nemat-Gorgani, N., et al. Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa. The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).
  3. Norman, P. J., et al. Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans. PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).
  4. Nakimuli, A., et al. Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population. Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).
  5. Bontadini, A., et al. Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population. Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).
  6. Graef, T., et al. KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).
  7. Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150, 248-264 (2017).
  8. Blokhuis, J. H., et al. KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans. Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).
  9. Martin, M. P., et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS. Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).
  10. Khakoo, S. I., et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection. Science. 305, 872-874 (2004).
  11. van Bergen, J., et al. KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation. American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).
  12. Hiby, S. E., et al. Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).
  13. Nakimuli, A., et al. A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).
  14. van Bergen, J., et al. HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model. The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).
  15. Bachanova, V., et al. Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).
  16. Cooley, S., et al. Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 116, 2411-2419 (2010).
  17. Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians. Human Immunology. 79, 218-223 (2018).
  18. Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments. Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).
  19. Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling. Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).
  20. Martin, M. P., Carrington, M. KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis. Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).
  21. Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires. Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).
  22. Houtchens, K. A., et al. High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles. Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  24. Traherne, J. A., et al. KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families. Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).
  25. Hydes, T. J., et al. The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways. Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).
  26. Dunphy, S. E., et al. 2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells. Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).
  27. Jiang, W., et al. qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination. Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).

Tags

Genetikk problemet 145 Immunogenetics killer celle immunglobulin-lignende reseptor (KIRs) kopiere nummer variasjon haplotype menneskelige leukocytter antigen (HLA) naturlig killer celle kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR)
qKAT: kvantitative Semi-automated å skrive Killer-cellen immunglobulin-lignende reseptor gener
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di,… More

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter