Kvantitative killer celle immunglobulin-lignende receptor (KIR) semi-automatiske typing (qKAT) er en enkel, høj overførselshastighed og omkostningseffektiv metode til at kopiere nummer type KIR gener for deres anvendelse i befolkningen og sygdom association studier.
Killer celle immunglobulin-lignende receptorer (KIRs) er et sæt af hæmmende og aktiverende immun receptorer, natural killer (NK) og T-celler, kodet af en polymorf klynge af gener på kromosom 19. Deres bedst karakteriserede ligander er human leukocyt antigen (HLA) molekyler, der er kodet i store histocompatibility complex (MHC) locus på kromosom 6. Der er betydelige beviser at de spiller en væsentlig rolle i immunitet, reproduktion og transplantation, hvilket gør det afgørende at have teknikker, der kan præcist genotype dem. Men høj-sekvens homologi, såvel som allel og copy number variation, gør det vanskeligt at designmetoder, der kan præcist og effektivt genotype alle KIR gener. Traditionelle metoder er som regel begrænset opløsning af data indhentet, overførselshastighed, omkostningseffektivitet og den tid, det tager for opsætning og drift af eksperimenter. Vi beskriver en metode kaldet kvantitative KIR halvautomatiske typing (qKAT), som er en høj overførselshastighed multiplex real-time polymerase kædereaktion metode, der kan afgøre gen kopi numre for alle gener i KIR locus. qKAT er en simpel høj overførselshastighed metode, der kan give høj opløsning KIR kopi nummer data, hvilket yderligere kan bruges til at udlede variationerne i de strukturelt polymorfe haplotypes, som omfatter dem. Denne kopi nummer og haplotype data kan være gavnligt for undersøgelser på storstilet sygdom foreninger, populationsgenetik, samt undersøgelser på udtryk og funktionel interaktioner mellem KIR og HLA.
Hos mennesker er den killer immunglobulin-lignende receptor(KIR) locus er kortlagt på den lange arm af kromosom 19 inden for leukocyt receptor kompleks (LRC). Denne locus er omkring 150 kb i længde og omfatter 15 KIR gener arrangeret hoved-til-hale. KIR loci, der er kendt for i øjeblikket er KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, og to pseudogenes, KIR2DP1 og KIR3DP1. KIR gener koder for todimensionale (2D) og tredimensionale (3D) immunglobulin-lignende domæne receptorer med kort (S, aktivering) eller lang (L; hæmmende) cytoplasmatisk hale, som er fremført af naturlige dræberceller (NK) og delmængder af T celler. Copy number variation udstillet i KIR locus former forskellige haplotypes med variabel gen indhold1. Non-allel homologe rekombination (NAHR), lettes ved en tæt hoved-til-hale gen arrangement og høj-sekvens homologi, er det, som foreslås at være ansvarlig for haplotypic variationen. Over 100 forskellige haplotypes er blevet rapporteret hos populationer på verdensplan1,2,3,4. Alle disse haplotypes kan opdeles i to hovedgrupper: A og B haplotypes. A haplotype indeholder 7 KIR gener: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, og KIR3DL2, som er hæmmende KIR gener, og den aktiverende KIR gen KIR2DS4. Men op til 70% af EU-oprindelse personer, der er homozygot for KIR haplotype A udelukkende medfører en ikke-funktionel “sletningen” form for KIR2DS45,6. Alle andre KIR gen kombinationer danne gruppe B haplotypes, herunder mindst én af de specifikke KIR gener KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, og KIR2DL5, og indeholder typisk to eller flere aktiverende KIR gener.
HLA klasse I molekylerne er blevet identificeret som ligander for visse hæmmende receptorer (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3og KIR3DL1), aktiverende receptorer (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, og KIR3DS1), og for KIR2DL4, som er en unik KIR , der indeholder en lang cytoplasmatisk hale som andre hæmmende KIR-receptorer, men også har et positivt ladede rester nær det ekstracellulære domæne, der er en fælles funktionen af andre aktiverende KIR -receptorer. Kombinationen af varianter inden for KIR gener og HLA-gener påvirker receptor ligand interaktion at figurer potentielle NK celle respons på det individuelle niveau7,8. Beviser fra genetiske association undersøgelser har antydet, at KIR spiller en rolle i viral modstand (e.g., human immundefekt virus [HIV]9 og hepatitis C virus [HCV]10), en vellykket transplantation 11, risikoen for graviditet lidelser og reproduktiv succes12,13, beskyttelse mod tilbagefald efter allogen hæmatopoietisk stamcelle transplantation (HSCT)14,15, 16, og risikoen for kræft17.
Kombinationen af høj-sekvens homologi og allel og haplotypic mangfoldighed præsenterer udfordringer i opgaven med præcist genotypebestemmelse KIR gener. Konventionelle metoder til at skrive KIR gener omfatter sekvens-specifikke primer (SSP) polymerase kædereaktion (PCR)18,19,20, sekvens-specifikke oligonukleotid sonde (SSOP) PCR21, og matrix assisted laser desorption ionisering-tid for flyvning massespektrometri (MALDI-TOF MS)22. Ulemperne ved disse teknikker er, at de kun giver delvis indblik genotypen hos en enkeltperson, samtidig også være besværlig at udføre. Seneste er næste generation sequencing (NGS) blevet anvendt for at skrive KIR locus specifikt. Mens denne metode er meget kraftfuld, det kan være dyrt at køre, og det er tidskrævende at udføre dybdegående analyser og data kontrol.
qKAT er en høj overførselshastighed kvantitativ PCR metode. Mens konventionelle metoder er besværlig og tidskrævende, denne metode gør det muligt at køre næsten 1.000 genomisk DNA (gDNA) prøver i fem dage og giver KIR genotype, såvel som gen kopi nummer. qKAT består af ti multiplex reaktioner, som hver er rettet mod to KIR loci og en reference gen af en fast eksemplarnummer i genomet (STAT6) anvendes til den relative kvantificering af KIR -genet kopiere nummer23. Denne analyse har held været anvendt i studier med stor befolkning paneler og sygdom kohorter på infektionssygdomme som HCV, autoimmune sygdomme som type 1 diabetes, og graviditet lidelser såsom preeclampsia, samt give en genetisk understøttelse til undersøgelser med henblik på forståelse af NK celle funktion1,4,24,25,26.
Vi beskrev en roman halvautomatiske høj overførselshastighed metode, kaldet qKAT, som letter kopi nummer typning af KIR gener. Metoden er en forbedring over konventionelle metoder som SSP-PCR, som er lav-overførselshastighed og kan kun angive tilstedeværelsen eller fraværet af disse meget polymorfe gener.
Rigtigheden af den kopi nummer data indhentet er afhængig af flere faktorer, herunder kvalitet og koncentration-ensartethed af gDNA prøver og kvaliteten af reagenserne. Kvaliteten og nøjagtigheden af gDNA prøver på tværs af en plade er yderst vigtig da variationer i koncentrationen i hele pladen kan resultere i fejl i beregningen af antal kopier. Da assays blev valideret ved hjælp af EU-oprindelse prøve sæt, kræver data fra kohorter fra andre dele af verden mere grundig kontrol. Dette er at sikre, at forekomster af allel frafald eller ikke-specifikke primer/sonden bindende ikke misfortolkes som copy number variation.
Mens assays blev designet og optimeret til at køre som høj overførselshastighed, kan de ændres for at køre færre prøver. Tillid til metrikværdien i kopi nummer analyse software påvirkes når analyserer færre prøver, men dette kan forbedres, hvis kontrol genomisk DNA-prøver med et kendt KIR gen kopi nummer er medtaget på pladen og ekstra prøve replikater er inkluderet.
For laboratorier uden væske/plade-håndtering robotter, master mix kan udleveres ved hjælp af multi-kanal pipetter og plader kan indlæses manuelt i qPCR instrument.
Hovedformålet bag udviklingen af qKAT var at skabe en enkel, hurtig databehandling, høj opløsning og omkostningseffektiv metode til at genotype KIRs for sygdom association studier. Dette blev realiseret siden qKAT har været ansat i undersøge KIR rolle i flere store sygdom association undersøgelser, herunder en række smitsomme sygdomme, autoimmune sygdomme og graviditet lidelser4, 24 , 25 , 26.
The authors have nothing to disclose.
Projektet har modtaget støtte fra medicinsk forskning Rådet (MRC), det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs Horisont 2020 forskning og innovation program (grant aftale nr. 695551) og National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedical Research Centre og NIH forskning blod og transplantation Research Unit (NIHR BTRU) i organdonation og Transplantation på University of Cambridge og i partnerskab med NHS Blood og transplantation (NHSBT). De fremsatte synspunkter er dem af forfatterne og ikke nødvendigvis NHS, NIHR, Department of Health eller NHSBT.
REAGENTS | |||
Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
MilliQ water | − | − | − |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
OR | |||
QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
SOFTWARE | |||
Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |