Quantitative Killer Cell Immunoglobulin-Like-Rezeptor (KIR) halbautomatische Eingabe (qKAT) ist eine einfache, hohem Durchsatz und kostengünstige Methode zur Nummer Typ KIR -Gene für ihre Anwendung in Bevölkerung und Krankheit Assoziationsstudien zu kopieren.
Killer Cell Immunoglobulin-Like-Rezeptoren (KIR) sind eine Reihe von hemmende und aktivierende immun Rezeptoren auf natürlichen Killer (NK) und T-Zellen, die durch eine polymorphe Cluster von Genen auf Chromosom 19 kodiert. Ihre besten charakterisierten Liganden sind die humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Moleküle, die in großen Histocompatibility complex (MHC) Locus auf Chromosom 6 kodiert sind. Es gibt deutliche Hinweise, dass sie eine bedeutende in der Immunität, Reproduktion und Transplantation Rolle, macht es wichtig, Techniken zu haben, die genau Genotyp kann ihnen. High-Sequenzhomologie, sowie Allele und Kopie Nummer Variation, erschweren jedoch es Design-Methoden, die präzise und effizient Genotyp alle KIR -Gene. Traditionelle Methoden sind in der Regel in die Auflösung der gewonnenen Daten, Durchsatz, Wirtschaftlichkeit und der Zeitaufwand für die Einrichtung und Betreuung der Versuche begrenzt. Wir beschreiben eine Methode namens quantitative KIR halbautomatische Eingabe (qKAT), das ist eine Hochdurchsatz-multiplex Real-Time Polymerase Kettenreaktion-Methode, die die gen Heftnummern für alle Gene in der KIR -Locus bestimmen kann. qKAT ist eine einfache Hochdurchsatz-Methode, die KIR Kopie Nummer Feindaten, bereitstellen kann, die weiter verwendet werden können, um die Variationen in der strukturell polymorphen Haplotypen abzuleiten, die sie umfassen. Diese Kopie Zahl und Haplotyp Daten können für Studien über groß angelegte Krankheit Verbände, Populationsgenetik sowie Untersuchungen zur Expression und funktionelle Wechselwirkungen zwischen KIR und HLAvorteilhaft.
Bei Menschen, die killer Immunoglobulin-Like-Rezeptor(KIR) Locus auf dem langen Arm von Chromosom 19 innerhalb der Leukozyten Rezeptor-Komplex (LRC) zugeordnet ist. Dieser Locus ist etwa 150 kb in der Länge und umfasst 15 KIR Gene angeordnet Head-to-Tail. Die KIR -Loci, die derzeit bekannt sind sind KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, und zwei Pseudogene, KIR2DP1 und KIR3DP1. Die KIR -Gene kodieren für zweidimensionale (2D) und dreidimensionale (3D) Immunglobulin-ähnliche Domäne Rezeptoren mit kurzen (S; aktivieren) oder lang (L; hemmenden) zytoplasmatischen Endstücke, die durch natürliche Killerzellen (NK) und Teilmengen von T ausgedrückt werden Zellen. Copy Number Variation ausgestellt in der KIR -Locus-Formularen vielfältige Haplotypen mit variabler gen Inhalt1. Non-Allele homologe Rekombination (NAHR), erleichtert durch eine enge Head-to-Tail gen Anordnung und hohe Sequenzhomologie ist der Mechanismus vorgeschlagen, für die Variabilität der Haplotypic verantwortlich. Mehr als 100 verschiedenen Haplotypen wurden in Populationen weltweit1,2,3,4beschrieben. Diese Haplotypen konnte in zwei Hauptgruppen unterteilt werden: A und B Haplotypen. Die A-Haplotyp enthält 7 KIR -Gene: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1und KIR3DL2, die inhibitorische KIR -Gene und die aktivierende KIR sind gen KIR2DS4. Bis zu 70 % der Europäischen stammende Personen, die homozygot für KIR Haplotyp A ausschließlich tragen jedoch eine nicht-funktionale “Löschung” Form der KIR2DS45,6. Alle anderen KIR -gen-Kombinationen bilden Gruppe B Haplotypen, darunter mindestens eine der spezifischen KIR Gene KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, und KIR2DL5, und in der Regel zwei oder mehr aktivierenden KIR -Gene enthalten.
HLA Klasse I Moleküle wurden identifiziert als Liganden für bestimmte hemmende Rezeptoren (KIR2DL1 KIR2DL2, KIR2DL3und KIR3DL1), aktivierenden Rezeptoren (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, und KIR3DS1), und für KIR2DL4, das ist eine einzigartige KIR , die enthält eine lange zytoplasmatischen Schwänzen wie andere hemmenden KIR-Rezeptoren, sondern hat auch einen positiv geladenen Rest in der Nähe der extrazellulären Domäne ist eine gemeinsame Funktion von anderen aktivierenden KIR -Rezeptoren. Die Kombination von Varianten innerhalb der KIR-Gene und die HLA-Gene beeinflusst Rezeptor Liganden Interaktion dieser Formen möglicher NK Zelle Reaktionsfähigkeit auf der individuellen Ebene7,–8. Nachweis von genetischen Assoziationsstudien hat angedeutet, dass KIR in virale Resistenz (z. B.., humanen Immundefizienz-Virus [HIV]9 und Hepatitis C-Virus [HCV]10) eine Rolle spielt den Erfolg der Transplantation 11, das Risiko einer Schwangerschaft Störungen und Fortpflanzungserfolg12,13, der Schutz vor Rückfall nach allogenen hämatopoetischen Stammzellen Transplantation (HSCT)14,15, 16und das Risiko von Krebserkrankungen17.
Die Kombination von hohen Sequenzhomologie und Allele und Haplotypic Vielfalt präsentiert Herausforderungen in der Aufgabe genau Genotypisierung KIR -Gene. Konventionelle Methoden der KIR -Gene geben zählen Sequenz-spezifische Primer (SSP) Polymerase-Kettenreaktion (PCR)18,19,20, Sequenz-spezifische Oligonukleotid Sonden (SSOP) PCR21, und Matrix assisted Laser desorption Ionisation-Zeit des Fluges Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS)22. Die Nachteile dieser Techniken sind, dass sie nur teilweise Einblick in das Erbgut einer Person zwar auch mühsam zu führen. Vor kurzem wurde Next Generation Sequencing (NGS) angewandt, um die KIR -Locus speziell zu geben. Während diese Methode sehr mächtig ist, kann es teuer sein, und es ist zeitaufwendig, eingehende Analyse und Daten-Kontrollen durchzuführen.
qKAT ist eine Hochdurchsatz-quantitative PCR-Methode. Während herkömmliche Methoden mühsam und zeitaufwändig sind, diese Methode macht es möglich, fast 1.000 genomische DNA (gDNA) Proben in fünf Tagen ausgeführt und gibt die KIR -Genotyp sowie die Kopienzahl gen. qKAT besteht aus zehn Multiplex-Reaktionen, von die jede zwei KIR Loci richtet und ein Referenz-gen einer festen Kopie Zahl in das Genom (STAT6) verwendet für die relative Quantifizierung des Gens KIR kopieren Nummer23. Dieser Test wurde erfolgreich eingesetzt in Studien, bei denen große Population Panels und Krankheit Kohorten auf Infektionskrankheiten wie HCV, autoimmune Erkrankungen wie Typ-1-Diabetes und Schwangerschaft Störungen wie Präeklampsie, sowie eine genetische zugrunde liegenden Studien, die darauf abzielen, die NK Zelle Funktion1,4,24,25,26zu verstehen.
Wir beschrieben eine neue halbautomatische Hochdurchsatz-Methode, genannt qKAT, das erleichtert die Kopie Nummer eingeben, KIR Gene. Die Methode ist eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden wie SSP-PCR, die niedrig-Durchsatz und können nur zeigen das Vorhandensein oder Fehlen dieser höchst polymorphen Gene.
Die Genauigkeit der erhaltenen Kopie Zahl Daten ist abhängig von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Qualität und Konzentration-Einheitlichkeit der gDNA Proben und die Qualität der Reagenzien. Die Qualität und Genauigkeit der gDNA Proben über einen Teller sind extrem wichtig, da Schwankungen in der Konzentration auf den Teller legen Fehler bei der Berechnung der Kopienzahl führen können. Da die Assays mit europäischen Ursprungs-Sample-Sets validiert wurden, benötigen Daten von Kohorten aus anderen Teilen der Welt eine gründlichere Prüfungen. Dies soll sicherstellen, dass Instanzen von Allel ausfallende oder nicht-spezifische Primer/Sonden Bindung nicht als Copy Number Variation fehlinterpretiert werden.
Während die Assays wurden entworfen und optimiert, um als Hochdurchsatz-laufen, können sie geändert werden, um weniger Beispiele auszuführen. Vertrauen-Metrik in der Kopie Zahl Analysesoftware ist betroffen, wenn weniger Proben analysieren, aber dies kann verbessert werden, wenn Kontrolle genomische DNA-Proben mit bekannten KIR gen Ausfertigung eine eigene Nummer auf dem Teller enthalten sind und zusätzliche Probe repliziert werden iinklusive.
Für Labors ohne Flüssigkeit/Platte-Handling-Roboter master-Mix mit Mehrkanal-Pipetten verzichtet werden kann und Platten können manuell in das qPCR-Gerät geladen werden.
Das Hauptziel hinter der Entwicklung des qKAT war eine einfache, hohem Durchsatz, hochauflösende und kostengünstige Methode, Genotyp KIRs für Krankheit Assoziationsstudien erstellen. Dies wurde erfolgreich, da qKAT beschäftigt war, bei der Untersuchung der Rolle von KIR in mehrere große Krankheit Assoziationsstudien, einschließlich einer Reihe von Infektionskrankheiten, Autoimmunerkrankungen und Schwangerschaft Störungen4, 24 , 25 , 26.
The authors have nothing to disclose.
Das Projekt erhielt Fördermittel aus dem Medical Research Council (MRC), der European Research Council (ERC) Programms der Europäischen Union Horizont 2020 Forschung und Innovation (Grant Agreement Nr. 695551) und das National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedizinischen Forschungszentrum und NIH Forschung Blut- und Transplant Research Unit (NIHR BTRU) im Bereich der Organspende und Transplantation an der University of Cambridge und in Partnerschaft mit NHS Blood and Transplant (NHSBT). Die geäußerten Meinungen sind diejenigen der Autoren und nicht unbedingt der NHS, die NIHR, das Department of Health oder die NHSBT.
REAGENTS | |||
Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
MilliQ water | − | − | − |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
OR | |||
QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
SOFTWARE | |||
Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |