Quantitativa delle cellule di assassino immunoglobulina-come recettore (KIR) semi-automatica digitando (qKAT) sono un metodo semplice, ad alta velocità e costi contenuto per copiare il numeri geni KIR di tipo per la loro applicazione negli studi di associazione di popolazione e la malattia.
Recettori di immunoglobulina-come delle cellule killer (KIRs) sono un insieme di ricevitori immuni inibitori e d’attivazione, il natural killer (NK) e le cellule di T, codificate da un cluster polimorfico di geni sul cromosoma 19. Loro ligandi meglio caratterizzate sono le molecole (HLA) l’antigene umano del leucocita che sono codificate all’interno il locus di istocompatibilità complex (MHC) sul cromosoma 6. Vi sono prove concrete che giocano un ruolo significativo nell’immunità, riproduzione e trapianto, rendendo fondamentale avere tecniche che possono misurare con precisione il genotipo li. Tuttavia, alta omologia, anche come allelica e variazione numero di copia, rendono difficile al genotipo ed efficientemente i metodi di progettazione che possono misurare con precisione tutti i geni KIR . Metodi tradizionali sono solitamente limitati nella risoluzione dei dati ottenuti, velocità effettiva, rapporto costo-efficacia e il tempo impiegato per l’impostazione e l’esecuzione degli esperimenti. Descriviamo un metodo chiamato quantitativa KIR semi-automatico digitando (qKAT), che è un metodo di reazione a catena multipla della polimerasi in tempo reale di alto-rendimento che può determinare i numeri di copia del gene per tutti i geni del locus di KIR . qKAT è un semplice metodo di alto-rendimento che può fornire dati ad alta risoluzione KIR copia numeri, che possono essere ulteriormente utilizzati per dedurre le variazioni negli aplotipi strutturalmente polimorfici che li comprendono. Questi dati di numero e aplotipo di copia possono essere utili per gli studi su associazioni di malattia su larga scala, genetica delle popolazioni, nonché indagini sull’espressione e interazioni funzionali tra KIR e HLA.
In esseri umani, il recettore immunoglobulina-come assassino(KIR) locus è mappato sul braccio lungo del cromosoma 19 all’interno del complesso recettoriale del leucocita (LRC). Questo locus è circa 150 kb di lunghezza e comprende 15 KIR geni disposti testa-coda. I loci KIR che sono attualmente noti sono KIR2DL1, KIR2DL2/ KIR2DL4,KIR2DL3, KIR3DL1, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5/KIR3DS1, KIR3DL2-3, e due pseudogeni, KIR2DP1 e KIR3DP1. I geni KIR codificano per bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) immunoglobulina-come dominio recettori con breve (S; attivazione) o lungo (L; inibitorio) Code citoplasmatiche che sono espresse da cellule natural killer (NK) e sottoinsiemi di T cellule. Copia numero variazione esposte all’interno delle forme di locus KIR diversi aplotipi con gene variabile contenuto1. La ricombinazione omologa non allelica (NAHR), facilitata da una composizione di gene di testa-coda stretta e alta-omologia, è il meccanismo proposto per essere responsabili della variabilità hanno. Oltre 100 diversi aplotipi sono stati segnalati in popolazioni in tutto il mondo1,2,3,4. Tutti questi aplotipi potrebbero essere diviso in due gruppi principali: gli aplotipi di A e B. L’aplotipo A contiene 7 geni KIR : KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1e KIR3DL2, che sono inibitori KIR geni e l’attivazione KIR gene KIR2DS4. Tuttavia, fino al 70% degli individui di origine europea che sono omozigotici per KIR aplotipo A esclusivamente trasportare una forma non funzionale “eliminazione” di KIR2DS45,6. Tutte le altre combinazioni di geni KIR formano aplotipi di gruppo B, tra cui almeno uno dei geni KIR specifici KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, e KIR2DL5e in genere includono due o più geni KIR d’attivazione.
Molecole HLA di classe I sono stati identificati come i ligandi per determinati recettori inibitori (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3e KIR3DL1), attivando i recettori (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5e KIR3DS1), e per KIR2DL4, che è un unico KIR che contiene un citoplasmico lunghe code come altri recettori inibitori KIR, ma ha anche un residuo di caricato positiva vicino il dominio extracellulare che è un comune caratteristica di altri recettori KIR d’attivazione. La combinazione di varianti all’interno dei geni KIR e i geni HLA influenza interazione ligando del recettore che reattività potenziali forme NK cella al livello individuale7,8. La prova dagli studi di associazione genetica ha indicato che KIR svolge un ruolo nella resistenza virale (ad es.., virus dell’immunodeficienza umana [HIV]9 ed epatite C [HCV] virus10), il successo del trapianto 11, il rischio di gravidanza disturbi e successo riproduttivo12,13, la protezione contro la ricaduta dopo trapianto ematopoietico allogeneic della cellula formativa (HSCT) trapianto14,15, 16e il rischio di cancri17.
La combinazione di alta-omologia e allelica e hanno diversità presenta sfide nel compito di accuratamente geni KIR di genotipizzazione. I metodi convenzionali di geni KIR tipo comprendono primer sequenza-specifici (SSP) polimerasi reazione a catena (PCR)18,19,20, oligonucleotide sequenza-specific sonda (SSOP) PCR21, e aghi laser assistita desorbimento ionizzazione-tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS)22. Gli svantaggi di queste tecniche sono che essi forniscono solo parziale spaccato il genotipo di un individuo pur essendo anche laborioso da eseguire. Recentemente il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è stata applicata per digitare il locus KIR specificamente. Mentre questo metodo è molto potente, può essere costoso per l’esecuzione, ed è tempo di effettuazione di verifiche approfondite analisi e dati.
qKAT è un metodo PCR quantitativo ad alta produttività. Mentre i metodi convenzionali sono laboriosa e che richiede tempo, questo metodo rende possibile eseguire quasi 1.000 campioni di DNA (gDNA) genomici in cinque giorni e dà il genotipo KIR , così come il numero di copie del gene. qKAT è costituito da dieci reazioni multiplex, ciascuno dei quali destinato a due KIR loci e copia di un gene di riferimento di un numero fisso copia nel genoma (STAT6) utilizzato per la relativa quantificazione del gene di KIR numero23. Questo test è stato utilizzato con successo negli studi che coinvolgono la popolazione grandi pannelli e coorti di malattia malattie infettive come HCV, patologie autoimmuni come il diabete di tipo 1, e disturbi della gravidanza come la preeclampsia, così come fornire una genetica alla base di studi volti a comprendere le NK cell funzione1,4,24,25,26.
Abbiamo descritto un nuovo metodo semi-automatico ad alta velocità, chiamato qKAT, che facilita la copia numero digitando dei geni KIR . Il metodo rappresenta un miglioramento rispetto ai metodi convenzionali come SSP-PCR, che sono basso-throughput e possono solo indicare la presenza o l’assenza di questi geni altamente polimorfici.
La precisione dei dati numeri copia ottenuti dipende da molteplici fattori, tra cui la qualità e la concentrazione-uniformità dei campioni gDNA e la qualità dei reagenti. La qualità e la precisione dei campioni gDNA attraverso un piatto sono estremamente importanti poiché variazioni nella concentrazione su tutta la piastra possono causare errori nel calcolo del numero della copia. Poiché i dosaggi sono stati convalidati utilizzando set di campioni di origine europea, dati dalle coorti da altre parti del mondo richiedono controlli più approfonditi. Questo è per garantire che le istanze di allele dropout o associazione non specifici primer/sonda non sono interpretati erroneamente come variazione numero di copia.
Mentre i dosaggi sono stati progettati e ottimizzati per l’esecuzione come ad alta velocità, possono essere modificati per eseguire meno campioni. La metrica di fiducia nel software di analisi numero di copia è interessata quando si analizzano campioni di meno, ma questo può essere migliorato se campioni di DNA genomici di controllo con un numero di copia del gene KIR noto sono inclusi sulla piastra e repliche di esempio aggiuntivi sono incluso.
Per i laboratori senza liquido/piastra-manipolazione robot, mix master può essere distribuito utilizzando pipette multicanale e piastre possono essere caricati manualmente nello strumento qPCR.
Lo scopo principale dietro lo sviluppo di qKAT era di creare un semplice, ad alta velocità, alta risoluzione e conveniente metodo per genotipo KIRs per malattia gli studi di associazione. Questo è stato raggiunto con successo poiché qKAT è stato impiegato nell’investigare il ruolo di KIR in parecchi studi di associazione di grande malattia, compreso una gamma di malattie infettive, malattie autoimmuni e gravidanza disturbi4, 24 , 25 , 26.
The authors have nothing to disclose.
Il progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio di ricerca medica (MRC), del Consiglio europeo della ricerca (CER) nell’ambito del programma ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell’Unione europea (grant contratto n. 695551) e il Cambridge National Institute of Health (NIH) Biomedical Research Centre e NIH ricerca sangue e trapianto di unità di ricerca (NIHR BTRU) in donazione e trapianto presso l’Università di Cambridge e in collaborazione con NHS Blood and Transplant (NHSBT). Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non necessariamente quelle di NHS, la NIHR, il Ministero della sanità o il NHSBT.
REAGENTS | |||
Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
MilliQ water | − | − | − |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
OR | |||
QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
SOFTWARE | |||
Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |