Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

qKAT: количественные Semi-automated типирование убийца клетки генов иммуноглобулинов подобных рецепторов

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58646
Automatic Translation
1,2,3,4, 1, 1,5, 1,6, 1,7, 1
1Department of Pathology, University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences, University of Cambridge

Summary

Количественные клеток-киллеров иммуноглобулина подобный рецептор (KIR) полуавтоматические ввод (qKAT) является простой, высокой пропускной способности и экономически метод, чтобы скопировать номер типа Кир генов для их применения в ассоциации исследований населения и болезней.

Abstract

Иммуноглобулин подобные рецепторы клеток-киллеров (Кирс) представляют собой набор тормозящее и активация иммунных рецепторов, на природные убийца (НК) и Т-клеток, кодируемых кластер полиморфных генов на хромосоме 19. Их наиболее характерны лигандов являются человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) молекулы, которые кодируются в комплекс (MHC) локуса гистосовместимости на хромосоме 6. Есть существенные доказательства того, что они играют значительную роль в иммунитет, воспроизводства и трансплантации, что делает его крайне важно иметь методы, которые можно точно генотип их. Однако, высокий последовательности гомологии, а также аллельных и копии номер изменения, затрудняют методов проектирования, которые можно точно и эффективно генотип все гены Кир . Традиционные методы обычно ограничены в резолюции полученных данных, пропускная способность, эффективности затрат и времени для настройки и выполнения экспериментов. Мы описываем метод, называемый количественных Кир полуавтоматические ввода (qKAT), который является высок объём Мультиплекс в реальном времени полимеразной цепной реакции метод, который можно определить номера копии гена для всех генов в локусе Кир . qKAT представляет собой простой метод высокой пропускной способности, которая может обеспечить высоким разрешением Кир копирования числовые данные, которые могут в дальнейшем использоваться для выведения вариации в структурно полиморфных гаплотипов, что охватить их. Эта копия номер и гаплотип данные могут быть полезными для исследований на крупномасштабных болезни ассоциаций, популяционной генетики, а также расследований на выражение и функционального взаимодействия между Кир и HLA.

Introduction

В организме человека, убийца рецептора иммуноглобулина как(Кир) локус сопоставляется на длинном плече хромосомы 19 в рамках комплекс рецептор лейкоцитов (LRC). Этот локус в длину около 150 КБ и включает в себя 15 Кир гены расположены головы до хвоста. Кир локусов, которые известны в настоящее время являются KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, и два pseudogenes, KIR2DP1 и KIR3DP1. Кир гены кодировать для двумерного (2D) и трехмерных (3D) домен иммуноглобулина подобных рецепторов с короткими (S; активации) или длинным (L; тормозящее) цитоплазматических хвосты, которые выражаются в естественных киллеров (НК) и подмножество T клетки. Номер варианта копирования выставлены в Кир локуса формы различных гаплотипов с переменной ген содержание1. Non аллельные гомологичная рекомбинация (НАХР), способствовало тесное голова хвост гена договоренности и высокой последовательности гомологии, является механизм, предложенный отвечает за haplotypic изменчивости. Более 100 различных гаплотипов были зарегистрированы в населения во всем мире1,2,3,4. Все эти гаплотипов можно разделить на две основные группы: A и B гаплотипов. Гаплотип A содержит 7 Кир генов: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1и KIR3DL2, которые ингибирующее Кир генов и активации Кир гена KIR2DS4. Однако до 70% лиц европейского происхождения, которые гомозиготных для Кир гаплотип А исключительно несут нефункциональные «удаление» форма KIR2DS45,6. Все другие комбинации генов Кир формируют группы B гаплотипов, включая по крайней мере один из конкретных генов Кир , KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, и KIR2DL5и обычно включают в себя два или более Активация Кир генов.

HLA класса I молекулы были названы лигандов для определенных рецепторов ингибирующих (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3и KIR3DL1), активируя рецепторы (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5и KIR3DS1), и для KIR2DL4, который является уникальный Кир , который содержит долго цитоплазматических хвосты, как других рецепторов ингибирующих Кир, но также имеет положительно заряженных остатков вблизи внеклеточного домена, которая является общей особенность других активирующий рецепторы Кир . Сочетание вариантов внутри Кир генов и HLA генов влияет взаимодействия лигандов рецепторов потенциал клеток отзывчивость НК что фигуры на индивидуальный уровень7,-8. Доказательства из исследований генетических ассоциации указал, что Кир играет определенную роль в вирусной устойчивости (например,., вирус иммунодефицита человека [ВИЧ]9 и гепатит C вирус [гепатита с]10), успех трансплантации 11, риск беременности расстройств и репродуктивный успех12,13, защиты от рецидивов после аллогенной гемопоэтических стволовых клеток трансплантации (ТГСК)14,15, 16и риск рака17.

Сочетание высокой последовательности гомологии и аллельные и haplotypic разнообразие представляет проблемы в задаче точно генотипирования Кир генов. Обычные методы типа Кир генов включают последовательности специфического праймера (SSP) полимеразной цепной реакции (ПЦР)18,19,20, специфичные для последовательности олигонуклеотида зонд PCR (SSOP)21, и Матрица помощь лазерной десорбции ионизации время полета масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS)22. Недостатки этих методов являются, что они только обеспечивают частичное понимание генотип человека, а также трудоемкий для выполнения. Недавно секвенирование нового поколения (НГС) был применен к типу Кир Локус специально. Хотя этот метод является очень мощным, он может быть дорогим для запуска, и это требует много времени для проведения углубленного анализа и данных проверок.

qKAT является методом высок объём количественного PCR. В то время как обычные методы трудоемким и длительным, этот метод позволяет запускать почти 1000 образцов геномной ДНК (геномная ДНК) в течение пяти дней и дает Кир генотипа, а также номер копии гена. qKAT состоит из десяти мультиплекс реакций, каждая из которых ориентирована на две Кир локусов и один ген ссылки Фиксированная копия числа в геноме (STAT6) используется для относительной квантификация гена Кир скопировать номер23. Этот assay успешно используется в исследованиях с участием большого числа панелей и когорты болезни на инфекционные заболевания, как гепатит с, аутоиммунные заболевания, как диабета типа 1 и беременность расстройств, таких как преэклампсия, а также предоставление генетических основу для исследований, направленных на понимание NK клеток функция1,4,24,25,26.

Protocol

1. Подготовка и обшивка из ДНК

  1. Точно подсчитать концентрация геномная ДНК с помощью спектрофотометрические или флуориметрический инструмента.
  2. Разбавляют ДНК до 4 нг/мкл на плиту 96-луночных глубокой скважины. Включать, по крайней мере один образец управления геномная ДНК с числом известных копии и один элемент управления-шаблон.
  3. Центрифуга 96-луночных пластины на 450 x g на 2 мин.
  4. С помощью инструмента обработки жидких, обойтись каждый образец в составленном на 384-ну ПЦР плиты так, что каждый хорошо имеет 10 нг ДНК (2,5 мкл/хорошо). Подготовка по меньшей мере десять 384-ну пластины, один для каждой qKAT реакции.
  5. Если геномная ДНК отказаться от более чем одной 96-луночных пластины, выполните полный объем промыть 2% отбеливателя и ультрачистая вода для очистки иглы жидкости системы между каждой пластины 96-луночных геномная ДНК образцов обработки.
  6. Просушите ДНК, инкубации и 384-ну пластины в чистой зоне при комнатной температуре в течение 24 часов.

2. Подготовка грунтовки и зонды

Примечание: qKAT состоит из десяти мультиплекс реакций. Каждая реакция включает в себя три пары праймера и три флуоресцировани обозначенного зондами, которые специально усиливают два Кир генов и ссылку на один ген. Датчики, которые были опубликованы в Цзян et al.27 были изменены таким образом, чтобы олигонуклеотиды теперь помечены Атто красителями, так как они предлагают улучшенный светостойкость и длинный сигнал продолжительностей жизни. Pre-aliquoted грунтовка комбинации являются коммерчески доступных (см. Таблицу материалы).

  1. Подготовьте грунт комбинации для каждой реакции согласно разведений, приведенные в таблице 1.
  2. Подготовьте зонд комбинации для каждой реакции согласно таблице 1. Каждый индивидуальный пробник до принятия комбинации.

3. Подготовка Мастер микс

Примечание Томов, упомянутых ниже, для выполнения одного qKAT реакция на наборе 10 x 384-ну пластин.

  1. Убедитесь, что геномная ДНК образцов покрытием на тарелках 384-ну абсолютно сухие. Провести все шаги на льду и держать реагентов, распространяется от воздействия света как можно больше, поскольку флуоресцировани обозначенного зонды чувствительны к фото - и термо.
  2. Размораживание буфер ПЦР, грунтовка и зонд аликвоты при 4 ° C.
  3. На льду Подготовьте мастер смесь для 10 x 384-ну пластин, добавив 18,86 мл ультрачистая вода, 20 мл ПЦР буфер, 1000 мкл вкладываемое грунтовка комбинации и 180 мкл вкладываемое зонд комбинации (Таблица 2).
  4. Равномерно распределяет Мастер микс по 96-глубокие хорошо пластину, используя многоканальные пипетки, закупорить 415 мкл в каждой скважине. Держите эту пластину в поле льда распространяется от света.
  5. С помощью инструмента обработки жидких, лунки 9,5 мкл мастер смесь в каждой скважине 384-ну пластины с сушеной геномная ДНК. Печать пластину с фольгой и сразу же поместить его на 4 ° C. Повторите этот процесс для оставшихся пластины, обеспечивая, что иглы жидкости системы обработки промывают водой между каждой плиты.
  6. Центрифуга 384-ну пластины на 450 x g 3 мин и инкубировать их в 4 ° C на ночь или между 6-12 ч до Ресуспензируйте ДНК и рассеивать любые воздушные пузыри.

4. ПЦР анализа

  1. После ночи инкубации центрифуги на 450 x g 3 мин рассеивать любые оставшиеся пузырьков воздуха.
  2. Для целей автоматизации, подключите машину ПЦР (например, LightCycler 480) Гонав обработчик (см. Таблицу материалы). Программа обработчик Гонав размещать пластины в машину ПЦР с охлаждением хранения док, который защищен от света.
    Примечание анализов должны в теории, работать на других машинах ПЦР с совместимых оптических параметров.
  3. Используйте следующие условия Велоспорт: 95 ° C за 5 мин, после чего 40 циклов 95 ° c 15 s и 66 ° C 50 сек, сбора данных на 66 ° C.
  4. После завершения выполнения, у робота собрать пластину от машины ПЦР и поместите его в док отменить.

5. После выполнения анализа

  1. После усиления, вычислить количественная оценка цикла (ов) с помощью второй производной максимальная метода или метода определяющих точек с помощью программного обеспечения машины ПЦР (см. Таблицу материалы), следуя инструкциям ниже.
  2. Откройте программное обеспечение ПЦР, на вкладке " Навигатор ", файл и открыть сохраненный реакции эксперимент для одной пластины.
  3. Для анализа с использованием метода второй производной максимальная выберите вкладку анализ и создать новый анализ с помощью метода Abs Quant/Second производная Макс.
    1. В окне Создание нового анализа , выберите тип анализа: метод Abs Quant/Second производная Макс, подмножества: все образцы, программа: усиление, имя: Rx-ДФО (где x является номером реакции).
    2. Выберите Фильтр расческу и выберите Вик/HEX/Yellow555 (533-580). Это гарантирует, что данные, собранные для STAT6 установлен.
    3. Выберите Цвет компенсации для VIC/HEX/Yellow555(533-580). Нажмите кнопку вычислить. Повторите это действие для Fam (465-510) и Cy5/Cy5.5(618-660). Нажмите кнопку сохранить файл.
  4. Для анализа с использованием метода определяющих точек выберите Abs Квант/Fit точки на вкладке анализ.
    1. В окне Создание нового анализа , выберите тип анализа: метод Abs Квант/определяющих точек, подмножества: все образцы, программа: усилители, имя: RxF-ДФО (где x является номером реакции).
    2. Выберите правильные фильтры и цвет компенсации для STAT6 и каждый из генов Кир (Fam/Cy5). В Noiseband на вкладке установите шума группу, чтобы исключить фоновый шум.
    3. На вкладке анализ равным 3 определяющих точек и выберите Показать определяющих точек. Нажмите кнопку вычислить. Нажмите кнопку сохранить файл.

6. Экспорт результатов

  1. В программном обеспечении ПЦР, откройте Навигатор tab. Выберите Экспорт пакетов результаты.
  2. Откройте папку, в которой эксперимент файлы сохраняются и передачи файлов в правой части окна. Нажмите кнопку Далее. Выберите имя и расположение файла экспорта.
  3. Выберите тип анализа, метода Abs Quant/Second производная Макс или Abs Квант/определяющие точки. Нажмите кнопку Далее. Проверьте, что имя файла, папку экспорта и тип анализа являются правильными и нажмите кнопку следующий чтобы начать процесс экспорта.
  4. Подождите, пока Состояние экспорта ОК. Экран автоматически перейдет к следующему шагу. Проверьте, что все выбранные файлы были успешно экспортированы тем, что количество файлов не = 0. Нажмите кнопку Готово.
  5. Использовать скрипты split_file.pl и roche2sds.pl разделить экспортируемый пластины на индивидуальных реакций для каждой пластины.
    Примечание сценарии предоставляются по запросу/GitHub.

7. Скопируйте число вычислений

  1. Открываете копию номером анализ программного обеспечения (например, CopyCaller). Выберите файл результатов в реальном времени PCR импорта и загрузить текстовые файлы, созданные roche2sds.pl.
  2. Выберите анализировать и проводить анализ, либо выбрав образец калибратор с числом известных копии или выбрав наиболее частого копирования номер. Смотрите в таблице 5 для наиболее частых копии количество генов Кир , обычно наблюдается в населения европейского происхождения.

8. качество данных проверяет

  1. Используйте сценарий R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R объединить копирования данных из всех плит в электронную таблицу.
    Примечание сценарии предоставляются по запросу/GitHub.
  2. Проверьте исходные данные на копию номером анализ программного обеспечения для образцов, которые не соответствуют известных связей неравновесия (LD) для Кир генов (Таблица 6).

Representative Results

Анализ копировать номера может осуществляться путем экспорта файлов для копирования номер анализ программного обеспечения, которое предоставляет номер предсказал и оценкам копирования, основанный на методе ΔΔCq.

Номер копии может быть предсказано, либо на основе известных копии количество контрольных образцов ДНК на плите или путем ввода наиболее часто номер копии гена (Таблица 5). Рисунок 1 показывает результаты пластины для реакции, предназначенный для KIR2DL4 и KIR3DS1, а также ссылка гена STAT6. Наиболее частые копии номер для KIR2DL4, рамки гена в Кир локус, — две копии, тогда как наиболее часто копии номер для KIR3DS1, активируя гена, одна копия. Результаты на рисунке показывают участки амплификации PCR, наблюдается на ПЦР программного обеспечения и копии данных создается из данных ПЦР. Как показано, assay возможность различать 0, 1, 2, 3 и 4 номеров копии гена Кир . Копия числовой анализ программного обеспечения также позволяет Просмотр распределения числа копирования через пластину как круговую диаграмму или гистограмму. Эффективность копирования номер предсказание ниже для образцов с более высоким номером копии.

Качество всех материалов, используемых в реакции, геномная ДНК, буфер, грунтовки и зонды, может повлиять на точность полученных результатов. Однако скорее всего, вызвана из-за различия в концентрации ДНК через тарелку несоответствие в результатах. Чистота извлеченные геномная ДНК, которая может быть измерена с помощью 260/280 и 260/230 коэффициенты, также может иметь влияние на качество. 260/280 отношение коэффициента 1,8-2 и 260/230 2-2,2 желательны. Неравномерным диапазон ДНК концентрации через пластины может привести к высокой изменчивости в круговороте порога (tC) между образцов и отсутствие согласованности в диапазоне сметных копия числа. Результаты на рисунке 2 показывают эффект, что может иметь расхождение между значениямиt C через тарелку на точность прогнозирования числа копирования. Красная линия указывает диапазон оценкам копии номер для образца и, в идеале, должно быть как можно ближе к целое как можно скорее.

Копирование данных, после проанализированы могут быть экспортированы в файл электронной таблицы в формате 96-луночных. Мы использовали сценарий R (доступно по запросу) для объединения копирование данных всех 10 пластин, которые запускаются как набор в одну таблицу. Опубликованные данные о Кирс основном европейского происхождения населения позволяет предсказания LD правил, которые существуют между различными генов в Кир комплекс1. Эти прогнозы используются для проверки ниже по течению на копии число результатов (Таблица 6). Образцы, которые не соответствуют прогнозируемым LD между гены могут содержать необычных полиморфизм или haplotypic структурных изменений. Блок-схемы, описывающие протокол показан на рисунке 3.

Инструмент называется Кир гаплотип идентификатор (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) была разработана для облегчения вменение гаплотипов из набора данных. Вменением работает на основе перечня справочных гаплотипов наблюдается в населения европейского происхождения1. Однако инструмент также позволяет для набора справочных гаплотипов использоваться вместо. Создаются три отдельных файлов; Первый файл содержит список всех комбинаций гаплотип для образца, второй файл предоставляет список обрезается гаплотипов комбинации, которые имеют высокие комбинированные частоты, и третий файл список образцов, которые не могут быть назначены гаплотипов. Non назначение гаплотипов могут использоваться в качестве показателя Роман гаплотипов.

Figure 1
Рисунок 1: представитель результаты пластины для реакции номер 5. (A) это усиление шоу группа участков. (B) Эта панель показывает скопировать несколько участков. (C) Эта группа показывает номер распределения копий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: представитель результаты плиты с переменной концентрации ДНК для реакции номер 5. (A) это усиление шоу группа участков. (B) Эта панель показывает скопировать несколько участков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: блок-схемы протокола qKAT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Проба Гены Форвард праймеры Концентрация (Нм) Обратный праймеры Концентрация (Нм) Зонды Концентрация (Нм)
No 1 3DP1 A4F 250 A5R 250 P4a 150
2DL 2 2DL2F4 400 C3R2 600 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 2 2DS2 A4F 400 A6R 400 P4a 200
2DL 3 D1F 400 D1R 400 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 3 3DL 3 A8F 500 A8R 500 P4a 150
2DS4Del 2DS4Del 250 2DS4R2 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 4 3DL1e4 B1F 250 B1R 125 Expal P4b 150
3DL1e9 D4F 250 D4R2 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 5 3DS1 B2F 250 B1R 250 Expal P4b 150
2 ДЛ 4 C1F 200 C1R 200 P5b - 2DL 4 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 6 2DL 1 B3F 500 B3R 125 Expal P4b 150
2DP1 D3F 250 D3R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 7 2DS1 B4F 500 B4R 250 Expal P4b 150
2DL 5 D2F 500 D2R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 8 2DS3 B5F 250 B5R 250 Expal P4b 150
3DL2e9 D4F 250 D5R 125 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 9 3DL2e4 A1F 200 A1R 200 P4a 150
2DS4FL 2DS4FL 250 2DS4R2 500 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 10 2DS5 B6F2 200 B6R3 200 Expal P4b 150
2DS4 C5F 250 C5R 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150

Таблица 1: сочетание и концентрации грунтовки и датчики, используемые в каждой реакции qKAT 27 .

Реакция Грунтовка аликвоты (мкл) Зонд аликвоты (мкл)
R1 3DP1 A4F A5R 2DL2F4 C3R2 ВОДЫ STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DL 2 100 100 160 240 200 80 80 60 60 60
R2 2DS2 A2F A6R D1F D1R ВОДЫ STAT6F STAT6R P4A P9 PSTAT6
2DL 3 160 160 160 160 160 80 80 80 60 60
Примечание: требуется 20 мкл меньше воды в MasterMix
R3 3DL 3 A8F A8FB A8R 2DS4DELF 2DS4R2 ВОДЫ STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4DEL 100 100 200 100 100 200 80 80 60 60 60
R4 3DL1E4 B1F B1R D4F D4R2 ВОДЫ STAT6F STAT6R EXPAL P4B P9 PSTAT6
3DL1E9 100 50 100 200 350 80 80 60 60 60
R5 3DS1 B2F B1R C1F C1R ВОДЫ STAT6F STAT6R EXPAL P4B P5B - 2L 4 PSTAT6
2 ДЛ 4 100 100 80 80 440 80 80 60 60 60
R6 2DL 1 B3F B3R D3F D3R ВОДЫ STAT6F STAT6R EXPAL P4B P9 PSTAT6
2DP1 200 50 100 200 250 80 80 60 60 60
R7 2DS1 B4F B4R D2F D2R ВОДЫ STAT6F STAT6R EXPAL P4B P9 PSTAT6
2DL 5 200 100 200 200 100 80 80 60 60 60
R8 2DS3 B5F B5R D4F D5R ВОДЫ STAT6F STAT6R EXPAL P4B P9 PSTAT6
3DL2E9 100 100 100 50 450 80 80 60 60 60
R9 3DL2E4 A1F A1R 2DS4WTF 2DS4R2 ВОДЫ STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4WT 80 80 100 200 340 80 80 60 60 60
R10 2DS5 B6F2 B6R3 C5F C5R ВОДЫ STAT6F STAT6R EXPAL P4B P5B PSTAT6
2DS4TOTAL 80 80 100 100 440 80 80 60 60 60

Таблица 2: Тома (мкл) 100 мкм праймер/зонд складе решения сделать грунт и зонд аликвоты комбинации.

Имя Направление модификация 5´ модификация 3´ Последовательность (5' →3') Длина TM GC % Эксон Позиция
P4a Чувство FAM BHQ-1 TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA		 27 60 44,4 4 425-451
Expal P4b Antisense FAM BHQ-1 AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T		 28 62 50 4 576-603
P5b Чувство ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG		 25 60 52 5 828-852
P5b - 2DL 4 Чувство ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG		 25 61 56 5 828-852
P9 Чувство ATTO647N BHQ-2 CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC		 24 60 62,5 9 1246-1269
PSTAT6 ATTO550 BHQ-2 CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT		 26 62 50

Таблица 3: список датчиков, используемых в qKAT 1, 27. люминесцентные красители, используемые в конце 5' oligo зонды P5b, P5b - 2 DL 4, P9 и PSTAT6 были изменены для Атто красители.

Джин Праймеры Направление Последовательность (5´-3´) Длина TM GC % Эксон Позиция Ампликон (bp) Может быть упущена аллели
3DL2e4 A1F Вперед GCCCCTGCTGAA
ATCAGG		 18 52 61.1 4 399-416 179 3DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038.
A1R Реверс CTGCAAGGACAG
GCATCAA		 19 53 52,6 559-577 3DL 2 * 048
3DP1 A4F Вперед GTCCCCTGGTGA
AATCAGA		 19 49 52,6 4 398-416 112 Нет
A5R Реверс GTGAGGCGCAAA
GTGTCA		 18 52 55,6 492-509 Нет
2DS2 A2F Вперед GTCGCCTGGTGA
AATCAGA		 19 49 52,6 4 398-416 111 Нет
A6R Реверс TGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT		 21 51 42,9 488-508 Нет
3DL 3 A8Fa Вперед GTGAAATCGGGA
GAGACG		 18 50 55,6 4 406-423 139 Нет
A8Fb Вперед GGTGAAATCAGG
AGAGACG		 19 50 52,6 405-423 3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
A8R Реверс AGTTGACCTGGG
AACCCG		 18 51 61.1 526-543 Нет
3DL1e4 B1F Вперед CATCGGTCCCAT
GATGCT		 18 51 55,6 4 549-566 85 3DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
B1R Реверс GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		 20 52 55 614-633 3DL 1 * 00502
3DS1 B2F Вперед CATCGGTTCCAT
GATGCG		 18 51 55,6 4 549-566 85 3DS1 * 047; могут забрать 3DL 1 * 054.
B1R Реверс GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		 20 52 55 614-633 Нет
2DL 1 B3F Вперед TTCTCCATCAGT
CGCATGAC		 20 52 50 4 544-563 96 2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
B3R Реверс GTCACTGGGAGC
TGACAC		 18 50 61.1 622-639 2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1 B4F Вперед TCTCCATCAGTC
GCATGAA		 19 51 47,4 4 545-563 96 2DS1 * 001
B4R Реверс GGTCACTGGGAG
CTGAC		 17 49 64,7 624-640 Нет
2DS3 B5F Вперед CTCCATCGGTCG
CATGAG		 18 53 61.1 4 546-563 96 Нет
B5R Реверс GGGTCACTGGGA
GCTGAA		 18 51 61.1 624-641 Нет
2DS5 B6F2 Вперед AGAGAGGGGACG
TTTAACC		 19 50 52,6 4 475-493 173 Нет
B6R3 Реверс TCCAGAGGGTCA
CTGGGC		 18 53 66,7 630-647 2DS5 * 003
2 ДЛ 4 C1F Вперед GCAGTGCCCAGC
ATCAAT		 18 52 55,6 5 808-825 83 Нет
C1R Реверс CCGAAGCATCTG
TAGGTCT		 19 52 52,6 872-890 2 ДЛ 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 2 2DL2F4 Вперед GAGGTGGAGGCC
CATGAAT		 19 52 57,9 5 778-796 151 2DL 2 * 009; 782G изменено на а.
C3R2 Реверс TCGAGTTTGACC
ACTCGTAT		 20 51 45 909-928 Нет
2DS4 C5F Вперед TCCCTGCAGTGC
GCAGC		 17 57 70.6 5 803-819 120 Нет
C5R Реверс TTGACCACTCGT
AGGGAGC		 19 52 57,9 904-922 2DS4 * 013
2DS4Del 2DS4Del Вперед CCTTGTCCTGCA
GCTCCAT		 19 54 57,9 5 750-768 203 Нет
2DS4R2 Реверс TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		 20 53 50 933-952 Нет
2DS4FL 2DS4FL Вперед CCGGAGCTCCTA
TGACATG		 19 53 57,9 5 744-762 209 Нет
2DS4R2 Реверс TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		 20 53 50 933-952 Нет
2DL 3 D1F Вперед AGACCCTCAGGA
GGTGA		 17 48 58,8 9 1180-1196 156 Нет
D1R Реверс CAGGAGACAACT
TTGGATCA		 20 50 45 1316-1335 2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 и 2DL 3 * 01802
2DL 5 D2F Вперед CACTGCGTTTTC
ACACAGAC		 20 52 50 9 1214-1233 120 2DL5B * 011 и 2DL5B * 020
D2R Реверс GGCAGGAGACAA
TGATCTT		 19 49 47,4 1315-1333 Нет
2DP1 D3F Вперед CCTCAGGAGGTG
ACATACGT		 20 53 55 9 1184-1203 121 Нет
D3R Реверс TTGGAAGTTCCG
TGTACACT		 20 50 45 1285-1304 Нет
3DL1e9 D4F Вперед CACAGTTGGATC
ACTGCGT		 19 52 52,6 9 1203-1221 93 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
D4R2 Реверс CCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA		 23 53 43,5 1273-1295 3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9 D4F Вперед CACAGTTGGATC
ACTGCGT		 19 52 52,6 9 1203-1221 156 Нет
D5R Реверс GACCTGACTGTG
GTGCTCG		 19 54 63,2 1340-1358 Нет
STAT6 STAT6F Вперед CCAGATGCCTAC
CATGGTGC		 20 54 60 129
STAT6R Реверс CCATCTGCACAG
ACCACTCC		 20 54 60

Таблица 4: последовательности праймеров, используемые в qKAT 1, 27.

Кир Джин 3DL 3 2DS2 2DL 2 2DL 3 2DP1 2DL 1 3DP1 2 ДЛ 4 3DL 1
EX9		 3DL 1
EX9		 3DS1 2DL 5 2DS3 2DS5 2DS1 2DS4
Итого		 2DS4
FL		 2DS4
DEL		 3DL 2
EX4		 3DL 2
EX9
Наиболее частое копирование номер 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2

Таблица 5: Наиболее частое копирование номер для Кир генов, обычно наблюдается в образцах европейского происхождения.

Связь неравновесия правила для qKAT, основанные на европейских популяций Скопируйте номер проверки
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 и KIR3DL2 являются рамки гены присутствуют на обеих гаплотипов. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 и KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 и KIR2DL2 находятся в LD друг с другом 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 и KIR2DL3 являются аллели гена же 2 DL 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 и KIR2DL1 находятся в LD друг с другом 2DP1=2 DL 1
5 Эксон 4 KIR3DL1 и KIR3DL2 равен Эксон 9 KIR3DL1 и KIR3DL2 соответственно. 3DL1ex4=3DL1ex9 и 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 и KIR3DS1 являются аллели 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 и KIR2DS5 находятся в LD с KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 и KIR2DS1 находятся в LD 3DS1=2DS1
9 Наличие KIR2DS1 и KIR2DS4Total является взаимоисключающим на гаплотипа 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL и KIR2DS4del являются варианты KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Таблица 6: взаимосвязь равновесия между Кир гены, обычно наблюдается у населения европейского происхождения может использоваться для проверки копии данных 1,-27.

Discussion

Мы описали Роман полуавтоматические высок объём метод, называемый qKAT, который облегчает копирование номер ввода Кир генов. Этот метод является улучшением по сравнению традиционными методами как SSP-PCR, низкой пропускной способностью и может только указать наличие или отсутствие этих весьма полиморфных генов.

Точность копирования число полученных данных зависит от нескольких факторов, включая качество и концентрации единообразие геномная ДНК образцов и качество реагентов. Качество и точность геномная ДНК образцов через тарелку чрезвычайно важны для различия в концентрации через пластины может привести к ошибкам при расчете числа копирования. После анализов были проверены с использованием комплектов образцов европейского происхождения, данные из когорты из других частей мира требуют более тщательной проверки. Это необходимо для того, что экземпляры аллеля отсева или неспецифических праймер/зонд привязки не истолкованы как копирование количество вариантов.

В то время как анализы были разработаны и оптимизированы для работы в качестве высокой пропускной способности, они могут быть изменены для запуска меньшее количество образцов. Метрику уверенность в копии номер анализ программного обеспечения пострадавших при анализе образцов меньше, но это можно улучшить, если управления геномной ДНК образцов с известный номер копии гена Кир включены на плите и реплицирует дополнительные примеры включены.

Для лабораторий без жидкости/плита обработки роботы мастер смесь можно обойтись с помощью многоканальных пипеток и пластины могут загружаться вручную в ПЦР инструмент.

Основная цель за развитие qKAT было создание простой, высокой пропускной способности, с высоким разрешением и экономически метод генотип Кирс болезни ассоциации исследований. Это была успешно достигнута, поскольку qKAT был нанят в расследовании роли Кир в нескольких крупных болезни ассоциации исследований, включая широкий спектр инфекционных заболеваний, аутоиммунные условий и беременность расстройств4, 24 , 25 , 26.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Проект получил финансирование от Совета медицинских исследований (СМИ), Совет европейских исследований (ERC) под исследовательской и инновационной программы Европейского союза по Horizon 2020 (Грант соглашение № 695551) и национального института здравоохранения (НИЗ) Кембридж Биомедицинских научно-исследовательский центр и низ исследования крови и трансплантации исследовательское подразделение (NIHR BTRU) в донорства и трансплантации в Кембриджском университете и в партнерстве с NHS крови и трансплантации (NHSBT). Мнения, выраженные являются те из авторов и не обязательно ГСЗ, NIHR, Департамент здравоохранения, или NHSBT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Oligonucleotides Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit Bioline BIO-86020 −
MilliQ water − − −
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor Eppendorf(or equivalent) Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000
OR
QuBit Fluorometer Life Technologies Q33216
Matrix Hydra Thermo Scientific 109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well Roche 05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) Caliper Life Sciences 204135
Vortex mixer Biosan BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) Gilson(or equivalent) F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) Starlab (or equivalent) S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL STARLAB E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube STARLAB E1450-0200
96-well deep well plate Fisher Scientific 12194162
LC480 384 Multi-well plates Roche 04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil Roche 04729757001
Name Company Catalog Number Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, W., et al. Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors. Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).
  2. Nemat-Gorgani, N., et al. Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa. The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).
  3. Norman, P. J., et al. Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans. PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).
  4. Nakimuli, A., et al. Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population. Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).
  5. Bontadini, A., et al. Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population. Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).
  6. Graef, T., et al. KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).
  7. Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150, 248-264 (2017).
  8. Blokhuis, J. H., et al. KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans. Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).
  9. Martin, M. P., et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS. Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).
  10. Khakoo, S. I., et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection. Science. 305, 872-874 (2004).
  11. van Bergen, J., et al. KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation. American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).
  12. Hiby, S. E., et al. Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).
  13. Nakimuli, A., et al. A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).
  14. van Bergen, J., et al. HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model. The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).
  15. Bachanova, V., et al. Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).
  16. Cooley, S., et al. Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 116, 2411-2419 (2010).
  17. Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians. Human Immunology. 79, 218-223 (2018).
  18. Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments. Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).
  19. Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling. Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).
  20. Martin, M. P., Carrington, M. KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis. Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).
  21. Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires. Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).
  22. Houtchens, K. A., et al. High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles. Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  24. Traherne, J. A., et al. KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families. Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).
  25. Hydes, T. J., et al. The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways. Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).
  26. Dunphy, S. E., et al. 2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells. Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).
  27. Jiang, W., et al. qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination. Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).

Tags

Генетика выпуск 145 иммуногенетики иммуноглобулин подобные рецепторы клеток-киллеров (Кирс) скопируйте число вариантов гаплотип человеческий лейкоцитарный антиген (HLA) природных клеток-киллеров количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР)
qKAT: количественные Semi-automated типирование убийца клетки генов иммуноглобулинов подобных рецепторов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di,… More

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter