Количественные клеток-киллеров иммуноглобулина подобный рецептор (KIR) полуавтоматические ввод (qKAT) является простой, высокой пропускной способности и экономически метод, чтобы скопировать номер типа Кир генов для их применения в ассоциации исследований населения и болезней.
Иммуноглобулин подобные рецепторы клеток-киллеров (Кирс) представляют собой набор тормозящее и активация иммунных рецепторов, на природные убийца (НК) и Т-клеток, кодируемых кластер полиморфных генов на хромосоме 19. Их наиболее характерны лигандов являются человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) молекулы, которые кодируются в комплекс (MHC) локуса гистосовместимости на хромосоме 6. Есть существенные доказательства того, что они играют значительную роль в иммунитет, воспроизводства и трансплантации, что делает его крайне важно иметь методы, которые можно точно генотип их. Однако, высокий последовательности гомологии, а также аллельных и копии номер изменения, затрудняют методов проектирования, которые можно точно и эффективно генотип все гены Кир . Традиционные методы обычно ограничены в резолюции полученных данных, пропускная способность, эффективности затрат и времени для настройки и выполнения экспериментов. Мы описываем метод, называемый количественных Кир полуавтоматические ввода (qKAT), который является высок объём Мультиплекс в реальном времени полимеразной цепной реакции метод, который можно определить номера копии гена для всех генов в локусе Кир . qKAT представляет собой простой метод высокой пропускной способности, которая может обеспечить высоким разрешением Кир копирования числовые данные, которые могут в дальнейшем использоваться для выведения вариации в структурно полиморфных гаплотипов, что охватить их. Эта копия номер и гаплотип данные могут быть полезными для исследований на крупномасштабных болезни ассоциаций, популяционной генетики, а также расследований на выражение и функционального взаимодействия между Кир и HLA.
В организме человека, убийца рецептора иммуноглобулина как(Кир) локус сопоставляется на длинном плече хромосомы 19 в рамках комплекс рецептор лейкоцитов (LRC). Этот локус в длину около 150 КБ и включает в себя 15 Кир гены расположены головы до хвоста. Кир локусов, которые известны в настоящее время являются KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, и два pseudogenes, KIR2DP1 и KIR3DP1. Кир гены кодировать для двумерного (2D) и трехмерных (3D) домен иммуноглобулина подобных рецепторов с короткими (S; активации) или длинным (L; тормозящее) цитоплазматических хвосты, которые выражаются в естественных киллеров (НК) и подмножество T клетки. Номер варианта копирования выставлены в Кир локуса формы различных гаплотипов с переменной ген содержание1. Non аллельные гомологичная рекомбинация (НАХР), способствовало тесное голова хвост гена договоренности и высокой последовательности гомологии, является механизм, предложенный отвечает за haplotypic изменчивости. Более 100 различных гаплотипов были зарегистрированы в населения во всем мире1,2,3,4. Все эти гаплотипов можно разделить на две основные группы: A и B гаплотипов. Гаплотип A содержит 7 Кир генов: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1и KIR3DL2, которые ингибирующее Кир генов и активации Кир гена KIR2DS4. Однако до 70% лиц европейского происхождения, которые гомозиготных для Кир гаплотип А исключительно несут нефункциональные «удаление» форма KIR2DS45,6. Все другие комбинации генов Кир формируют группы B гаплотипов, включая по крайней мере один из конкретных генов Кир , KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, и KIR2DL5и обычно включают в себя два или более Активация Кир генов.
HLA класса I молекулы были названы лигандов для определенных рецепторов ингибирующих (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3и KIR3DL1), активируя рецепторы (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5и KIR3DS1), и для KIR2DL4, который является уникальный Кир , который содержит долго цитоплазматических хвосты, как других рецепторов ингибирующих Кир, но также имеет положительно заряженных остатков вблизи внеклеточного домена, которая является общей особенность других активирующий рецепторы Кир . Сочетание вариантов внутри Кир генов и HLA генов влияет взаимодействия лигандов рецепторов потенциал клеток отзывчивость НК что фигуры на индивидуальный уровень7,–8. Доказательства из исследований генетических ассоциации указал, что Кир играет определенную роль в вирусной устойчивости (например,., вирус иммунодефицита человека [ВИЧ]9 и гепатит C вирус [гепатита с]10), успех трансплантации 11, риск беременности расстройств и репродуктивный успех12,13, защиты от рецидивов после аллогенной гемопоэтических стволовых клеток трансплантации (ТГСК)14,15, 16и риск рака17.
Сочетание высокой последовательности гомологии и аллельные и haplotypic разнообразие представляет проблемы в задаче точно генотипирования Кир генов. Обычные методы типа Кир генов включают последовательности специфического праймера (SSP) полимеразной цепной реакции (ПЦР)18,19,20, специфичные для последовательности олигонуклеотида зонд PCR (SSOP)21, и Матрица помощь лазерной десорбции ионизации время полета масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS)22. Недостатки этих методов являются, что они только обеспечивают частичное понимание генотип человека, а также трудоемкий для выполнения. Недавно секвенирование нового поколения (НГС) был применен к типу Кир Локус специально. Хотя этот метод является очень мощным, он может быть дорогим для запуска, и это требует много времени для проведения углубленного анализа и данных проверок.
qKAT является методом высок объём количественного PCR. В то время как обычные методы трудоемким и длительным, этот метод позволяет запускать почти 1000 образцов геномной ДНК (геномная ДНК) в течение пяти дней и дает Кир генотипа, а также номер копии гена. qKAT состоит из десяти мультиплекс реакций, каждая из которых ориентирована на две Кир локусов и один ген ссылки Фиксированная копия числа в геноме (STAT6) используется для относительной квантификация гена Кир скопировать номер23. Этот assay успешно используется в исследованиях с участием большого числа панелей и когорты болезни на инфекционные заболевания, как гепатит с, аутоиммунные заболевания, как диабета типа 1 и беременность расстройств, таких как преэклампсия, а также предоставление генетических основу для исследований, направленных на понимание NK клеток функция1,4,24,25,26.
Мы описали Роман полуавтоматические высок объём метод, называемый qKAT, который облегчает копирование номер ввода Кир генов. Этот метод является улучшением по сравнению традиционными методами как SSP-PCR, низкой пропускной способностью и может только указать наличие или отсутствие этих весьма полиморфных генов.
Точность копирования число полученных данных зависит от нескольких факторов, включая качество и концентрации единообразие геномная ДНК образцов и качество реагентов. Качество и точность геномная ДНК образцов через тарелку чрезвычайно важны для различия в концентрации через пластины может привести к ошибкам при расчете числа копирования. После анализов были проверены с использованием комплектов образцов европейского происхождения, данные из когорты из других частей мира требуют более тщательной проверки. Это необходимо для того, что экземпляры аллеля отсева или неспецифических праймер/зонд привязки не истолкованы как копирование количество вариантов.
В то время как анализы были разработаны и оптимизированы для работы в качестве высокой пропускной способности, они могут быть изменены для запуска меньшее количество образцов. Метрику уверенность в копии номер анализ программного обеспечения пострадавших при анализе образцов меньше, но это можно улучшить, если управления геномной ДНК образцов с известный номер копии гена Кир включены на плите и реплицирует дополнительные примеры включены.
Для лабораторий без жидкости/плита обработки роботы мастер смесь можно обойтись с помощью многоканальных пипеток и пластины могут загружаться вручную в ПЦР инструмент.
Основная цель за развитие qKAT было создание простой, высокой пропускной способности, с высоким разрешением и экономически метод генотип Кирс болезни ассоциации исследований. Это была успешно достигнута, поскольку qKAT был нанят в расследовании роли Кир в нескольких крупных болезни ассоциации исследований, включая широкий спектр инфекционных заболеваний, аутоиммунные условий и беременность расстройств4, 24 , 25 , 26.
The authors have nothing to disclose.
Проект получил финансирование от Совета медицинских исследований (СМИ), Совет европейских исследований (ERC) под исследовательской и инновационной программы Европейского союза по Horizon 2020 (Грант соглашение № 695551) и национального института здравоохранения (НИЗ) Кембридж Биомедицинских научно-исследовательский центр и низ исследования крови и трансплантации исследовательское подразделение (NIHR BTRU) в донорства и трансплантации в Кембриджском университете и в партнерстве с NHS крови и трансплантации (NHSBT). Мнения, выраженные являются те из авторов и не обязательно ГСЗ, NIHR, Департамент здравоохранения, или NHSBT.
REAGENTS | |||
Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
MilliQ water | − | − | − |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
OR | |||
QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
SOFTWARE | |||
Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |