Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

qKAT: kvantitativa Semi-automated typning av Killer-cell immunglobulin-like Receptor gener

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58646
Automatic Translation
1,2,3,4, 1, 1,5, 1,6, 1,7, 1
1Department of Pathology, University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences, University of Cambridge

Summary

Kvantitativa killer cell immunglobulin-like receptor (KIR) halvautomatisk maskinskrivning (qKAT) är en enkel, hög genomströmning och kostnadseffektiv metod för att kopiera nummer typ KIR gener för deras tillämpning i befolkningen och sjukdom associationsstudier.

Abstract

Killer cell immunglobulin-liknande receptorer (KIRs) är en uppsättning av hämmande och aktiverande immun receptorer, naturliga mördarceller (NK) och T-celler, kodas av en polymorf kluster av gener på kromosom 19. Deras bäst kännetecknas ligander är humant leukocyt antigen (HLA) molekylerna som kodas inom det stora histocompatibility komplexa (MHC) locus på kromosom 6. Det finns påtagliga bevis att de spelar en betydande roll i immunitet, reproduktion och transplantation, vilket gör det viktigt att ha tekniker som kan exakt genotyp dem. Dock gör hög-sekvenshomologi, samt som alleliska och kopia nummer variation, det svårt att designmetoder som kan exakt och effektivt genotyp alla KIR gener. Traditionella metoder är vanligen begränsade upplösningen av uppgifter som erhållits, genomströmning, kostnadseffektivitet och tiden för att starta och driva experimenten. Vi beskriver en metod som kallas kvantitativa KIR halvautomatisk skriva (qKAT), som är en metod av hög genomströmning multiplex realtid polymeras-kedjereaktion som kan avgöra gen kopiera siffrorna för alla gener i den KIR -locus. qKAT är en enkel hög genomströmning metod som kan ge högupplösta KIR kopia nummer data, vilket ytterligare kan användas för att härleda variationerna i den strukturellt polymorfa haplotyper som omsluta dem. Kopiera nummer och haplotyp data kan vara fördelaktigt för studier på storskaliga sjukdom föreningar, populationsgenetik, samt utredningar på uttryck och funktionella interaktioner mellan KIR och HLA.

Introduction

I människor, killer immunglobulin-liknande receptorn(KIR) locus är mappad på den långa armen av kromosom 19 inom leukocyt-receptorkomplexet (LRC). Detta locus är omkring 150 kb i längd och omfattar 15 KIR gener ordnade head-to-tail. De KIR -lokus som är för närvarande kända är KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, och två pseudogener, KIR2DP1 och KIR3DP1. KIR generna kodar för tvådimensionell (2D) och tredimensionella (3D) immunglobulin-liknande domän receptorer med kort (S; aktivera) eller lång (L; hämmande) cytoplasmiska svansar, som uttrycks av naturliga mördarceller (NK) och delmängder av T celler. Kopiera nummer variation uppvisade inom formulären KIR locus olika haplotyper med variabel gene innehåll1. Icke-alleliska homolog rekombination (NAHR), underlättas av en nära huvud till svans gen arrangemang och hög-sekvenshomologi, är den mekanism som föreslås bli ansvarig för den haplotypic variationen. Över 100 olika haplotyper har rapporterats i populationer i världen1,2,3,4. Alla dessa haplotyper kunde delas in i två huvudgrupper: A och B haplotyper. Den A haplotypen innehåller 7 KIR gener: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1och KIR3DL2, som är inhiberande KIR gener och den aktiverande KIR gen KIR2DS4. Dock upp till 70% av EU-ursprung individer som är homozygota för KIR haplotyp A uteslutande utföra en icke-funktionella ”strykning” form av KIR2DS45,6. Alla andra KIR gen kombinationer bildar grupp B haplotyper, inklusive minst en av de specifika generna som KIR KIR2DS1, KIR2DS3, KIR3DS1, KIR2DS5, KIR2DS2, KIR2DL2, och KIR2DL5, och omfattar vanligtvis två eller flera aktiverande KIR gener.

HLA klass I molekyler har identifierats som liganderna för vissa hämmande receptorer (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3och KIR3DL1), aktiverande receptorer (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, och KIR3DS1), och för KIR2DL4, som är en unik KIR som innehåller en lång cytoplasmiska svansar som andra inhiberande KIR-receptorer men har också ett positivt laddade rester nära den extracellulära domänen som är ett vanligt funktion i andra aktiverande KIR -receptorer. Kombinationen av varianter inom KIR generna och de HLA-generna påverkar receptor ligand interaktion att former potentiella NK cell lyhördhet på individuell nivå7,8. Bevis från genetiska associationsstudier har antytt att KIR spelar en roll i viral resistens (e.g., humant immunbristvirus [HIV]9 och hepatit C-virus [HCV]10), framgången för transplantation 11, risken för graviditet sjukdomar och reproduktiv framgång12,13, skydd mot återfall efter allogen hematopoetiska stamceller transplantation (HSCT)14,15, 16, och risken för cancer17.

Kombinationen av hög-sekvenshomologi och alleliska och haplotypic mångfald presenterar utmaningar i uppgift att exakt genotypning KIR gener. Konventionella metoder skriva KIR gener inkluderar sekvens-specifik primer (SSP) polymeras-kedjereaktion (PCR)18,19,20, sekvens-specifika oligonukleotiden sond (SSOP) PCR21, och Matrix assisterad laser desorption jonisering-tid av flygning masspektrometri (MALDI-TOF MS)22. Nackdelarna med dessa tekniker är att de ger bara delvis inblick i genotypen hos en individ samtidigt vara arbetsamt att utföra. Nästa generations sekvensering (NGS) har nyligen tillämpats skriver det KIR locus specifikt. Även denna metod är mycket kraftfull, det kan bli dyrt att köra, och det är tidskrävande att genomföra djupgående analys och data kontroller.

qKAT är en hög genomströmning kvantitativa PCR-metod. Medan konventionella metoder är mödosam och tidskrävande, denna metod gör det möjligt att köra nästan 1.000 genomisk DNA (gDNA) prover i fem dagar och ger KIR genotypen, liksom antalet gen kopia. qKAT består av tio multiplex reaktioner, vilka riktar två KIR loci och en referens gen av en fast kopienumret i genomet (STAT6) används för relativ kvantifiering av genen KIR kopiera nummer23. Denna analys har använts framgångsrikt i studier som involverar stora befolkning paneler och sjukdom kohorter på infektionssjukdomar som HCV, autoimmuna sjukdomar som diabetes typ 1 och graviditet störningar såsom havandeskapsförgiftning, samt att ge en genetisk som ligger till grund till studier som syftar till att förstå den NK cell funktion1,4,24,25,26.

Protocol

1. beredning och plätering av DNA

  1. Exakt kvantifiera gDNA koncentrationen använder en spektrofotometrisk eller fluorometric instrument.
  2. Späd DNA till 4 ng/µL på en plattan med 96 brunnar djupa brunnar. Inkludera minst en gDNA kontrollprov med ett känt exemplar nummer och en icke-mall kontroll.
  3. Centrifugera 96 brunnar plattorna på 450 x g i 2 min.
  4. Med hjälp av ett instrument för vätskehantering, avstå från varje prov i fyra exemplar på 384-väl qPCR plattor så att varje brunn har 10 ng DNA (2,5 µL per brunn). Bered minst tio 384 brunnar, en för varje qKAT reaktion.
  5. Om gDNA dispenserats från mer än en plattan med 96 brunnar, utföra en full-volym tvätt med 2% blekmedel och ultrarent vatten för att rengöra nålar hos vätskehanterande system mellan varje plattan med 96 brunnar gDNA prover.
  6. Lufttorka DNA genom ruvning 384-väl plattorna i ett rent område vid rumstemperatur under minst 24 h.

2. utarbetandet av Primers och sonder

Obs: qKAT består av tio multiplex reaktioner. Varje reaktion inkluderar tre primer par och tre fluorescens-märkt sonder som specifikt förstärker två KIR gener och en referens-genen. Sonderna som publicerades i Jiang et al.27 ändrades så att oligonukleotider är nu märkta med ATTO färgämnen eftersom de erbjuder förbättrad photostability och lång signal livstider. Pre-aliquoted primer kombinationer finns kommersiellt tillgänglig (se Tabell för material).

  1. Förbereda primer kombinationer för varje reaktion enligt de utspädningar som anges i tabell 1.
  2. Förbereda sonden kombinationer för varje reaktion enligt tabell 1. Testa varje enskilda sond innan de gör kombinationen.

3. beredning av Master Mix

Obs De volymer som nämns nedan är för att utföra en qKAT reaktion på en uppsättning av 10 x 384 brunnar.

  1. Säkerställa att gDNA proverna pläterade på 384-väl plattorna är helt torra. Genomföra alla åtgärder på is och hålla de reagens som omfattas från exponering för ljus så mycket som möjligt eftersom de fluorescens-märkt sonderna är foto - och termo-känsliga.
  2. Frosta av qPCR buffert, primer och sonden alikvoter vid 4 ° C.
  3. På isen, förbereda en master mix 10 x 384 brunnar genom att lägga till 18.86 mL ultrarent vatten, 20 mL av qPCR buffert, 1000 µL av förberedd primer kombination och 180 µL av förberedd sonden kombination (tabell 2).
  4. Fördela huvudmixen jämnt över en väl 96-djup tallrik med flerkanalig pipett, pipett 415 µL till varje brunn. Hålla denna platta i en ice box omfattas från ljus.
  5. Med hjälp av ett instrument för vätskehantering, Dispensera 9,5 µL master mix i varje brunn av 384-väl plattan med torkade gDNA. Försegla plattan med en folie och placera den omedelbart vid 4 ° C. Upprepa denna process för de resterande plattorna, säkerställa att nålar hos vätskehanterande system är tvättas med vatten mellan varje platta.
  6. Centrifugera de 384 brunnar vid 450 x g i 3 min och ruva dem vid 4 ° C över natten eller mellan 6-12 h att resuspendera DNA och att skingra eventuella luftbubblor.

4. qPCR Assay

  1. Efter den natten inkubationen, Centrifugera 450 x g för 3 min att avleda eventuella kvarvarande luftbubblor.
  2. Ramen för automation, qPCR apparaten (t.ex. LightCycler 480) anslutas till en mikroplattan hanterare (se Tabell för material). Programmet mikroplattan hanteraren att placera plåtarna till qPCR maskinen från en kyld förvaring docka som skyddas från ljus.
    NOT analyserna bör, i teorin, arbeta på andra qPCR maskiner med kompatibel fiberoptiska inställningar.
  3. Använd följande cykling villkor: 95 ° C i 5 min följt av 40 cykler av 95 ° C för 15 s och 66 ° C för 50 s, med datainsamling på 66 ° C.
  4. När körningen är klar, har roboten samlar in plattan från qPCR maskinen och placera den i släng dock.

5. efter kör analys

  1. Efter förstärkning, beräkna kvantifiering cykel (Cq) värdena med antingen den andra derivat maximal eller Fit Points metoden med programvaran av qPCR maskinen (se Tabell för material), följer stegen nedan.
  2. Öppna programvaran för qPCR och öppna filen sparade reaktion experiment för en platta i fliken Navigator .
  3. Välj fliken analys för analysen med metoden för andra derivat maximalt, och skapa en ny analys med Abs Quant/Second derivat Max metod.
    1. I fönstret Skapa ny analys väljer analystyp: Abs Quant/Second derivat Max metod, delmängd: alla prover, program: förstärkning, namn: Rx-DFO (där x är antalet reaktion).
    2. Välj Filter kam och VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Detta säkerställer att data som samlas in för STAT6 är markerat.
    3. Välj färg ersättning för VIC/HEX/Yellow555(533-580). Klicka på Beräkna. Upprepa detta för Fam (465-510) och Cy5/Cy5.5(618-660). Klicka på Spara fil.
  4. För analysen med metoden Fit Points, Välj Abs Quant/Fit Points på fliken analys.
    1. I fönstret Skapa ny analys väljer analystyp: Abs Quant/Fit Points metod, delmängd: alla prover, program: förstärkning, namn: RxF-DFO (där x är antalet reaktion).
    2. Välj rätt filter och färg kompensation till STAT6 och var och en av generna som KIR (Fam/Cy5). Ställ in buller bandet att utesluta bakgrundsljud på fliken Noiseband .
    3. Analys på fliken ange punkterna som passar till 3 och välj Visa passar punkter. Klicka på Beräkna. Klicka på Spara fil.

6. export av resultaten

  1. Öppna navigatorn i programvaran qPCR, tab. Välj Resultat Batch Export.
  2. Öppna mappen där experimentet filer sparas och överföra filer i avsnittet till höger i fönstret. Klicka på Nästa. Välj namnet och platsen för exportfilen.
  3. Välj analystyp Abs Quant/Second derivat Max metod eller Abs Quant/Fit Points. Klicka på Nästa. Kontrollera att namnet på filen, mappen export och analystypen är korrekta och klicka på Nästa för att starta exportprocessen.
  4. Vänta tills Exportera Status är Ok. Skärmen flyttas automatiskt till nästa steg. Kontrollera att alla markerade filer har exporterats framgångsrikt så att antalet filer misslyckades = 0. Klicka på klar.
  5. Använda skript split_file.pl och roche2sds.pl för att dela exporterade plattorna i individuella reaktioner för varje platta.
    NOT skript tillhandahålls på begäran/GitHub.

7. Kopiera antal beräkningar

  1. Öppna kopia nummer analys programvara (t.ex. CopyCaller). Välj Importera realtids PCR-resultatfil och ladda textfiler som skapats av roche2sds.pl.
  2. Välj analysera och genomföra analysen genom antingen välja kalibrator prov med kända exemplar nummer eller välja Kopiera typvärdet. Se tabell 5 för mest frekventerar kopia antalet KIR gener vanligen observerats i Europeiska-ursprung populationer.

8. kvalitetskontroller data-

  1. Använd R skript KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R att kombinera kopiera nummer data från alla plattorna i ett kalkylblad.
    NOT skript tillhandahålls på begäran/GitHub.
  2. Dubbelgranska rådata på kopia nummer analys programvara för prover som inte överensstämmer med den kända linkage disequilibrium (LD) för KIR gener (tabell 6).

Representative Results

Kopiera nummer analys kan utföras genom att exportera filer till kopia nummer analys programvara, vilket ger beräknade och uppskattade kopienumret utifrån metoden ΔΔCq.

Kopienumret kan förutsägas antingen baserat på kända kopia antalet kontroll DNA-prover på plattan eller genom att mata in gen kopia typvärdet (tabell 5). Figur 1 visar resultatet av en platta för en reaktion som riktar KIR2DL4 och KIR3DS1, samt referensgenen STAT6. Kopia typvärdet för KIR2DL4, en ram-gen i det KIR locus, är två kopior, medan kopia typvärdet för KIR3DS1, en aktiverande gen, är en kopia. Resultaten i figur visar PCR-amplifiering tomterna observerats på qPCR programvaran och kopiera numreradatan genereras från qPCR data. Som visad, är analysen kunna skilja mellan 0, 1, 2, 3 och 4 KIR gen kopia nummer. Kopia nummer analys programvara möjliggör också en visning av fördelningen av kopienumret över plattan som ett cirkeldiagram eller ett stapeldiagram. Effekten av kopia nummer prognos är lägre för prover med högre kopia nummer.

Kvaliteten på alla de material som används i reaktioner, gDNA, buffert, primers och sonder, kan påverka noggrannheten i resultaten. Discordance i resultat är dock mest sannolikt att orsakas på grund av variation i koncentrationen av DNA över en tallrik. Renheten av den extraherade gDNA, som kan mätas med hjälp av de 260/280 och 260/230 nyckeltal, kan också ha en inverkan på kvalitet. 1.8-2 och en 260/230 förhållandet mellan 2-2.2 260/280 förhållandet är önskvärda. En ojämn utbud av DNA koncentrationer över en tallrik kan leda till en hög variabilitet i tröskeln cykeln (Ct) mellan prover och discordance mellan uppskattade kopienumret. Resultaten i figur 2 visar effekten skillnaderna mellan Ct värdena över en tallrik kan ha på riktigheten i förutsägelsen av kopienumret. Den röda linjen visar utbudet av uppskattade kopienumret för ett prov och i idealfallet bör vara så nära ett heltal som möjligt.

Kopiera nummer data, som en gång analyseras, kan exporteras som en kalkylbladsfil i ett format som 96 brunnar. Vi använde ett R skript (tillgänglig på begäran) för att kombinera numreradatan kopia av alla 10 plattor som körs som en uppsättning i ett kalkylblad. Publicerade data om KIRs från främst europeiska-ursprung populationer kan förutsägelse av LD regler som finns mellan olika gener i KIR komplexa1. Dessa förutsägelser används för att utföra efterföljande kontroller på kopia nummer resultat (tabell 6). Prover som inte överensstämmer med den förutspådda LD mellan generna kan innehålla ovanligt polymorfism eller haplotypic strukturella variationer. Ett flödesschema som beskriver protokollet visas i figur 3.

Ett verktyg som kallas KIR haplotyp identifierare (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) utvecklades för att underlätta imputering av haplotyper från datauppsättningen. Imputering arbetar utifrån en förteckning över referens haplotyper observerats i en EU-ursprung befolkningen1. Verktyget tillåter dock även för en anpassad uppsättning referens haplotyper som ska användas i stället. Tre separata filer genereras. den första filen listar alla haplotyp kombinationer för ett prov, den andra filen innehåller en trimmade lista haplotyper kombinationer som har de högsta kombinera frekvenserna och den tredje filen listar de prover som inte kan tilldelas haplotyper. Icke-tilldelning av haplotyper skulle kunna användas som en indikator på romanen haplotyper.

Figure 1
Figur 1: representativa resultat platta för reaktion nummer 5. (A) panel visar tydligare tomter. (B) denna panel visar kopiera antal tomter. (C), denna panel visar kopia nummer fördelningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa resultat av en platta med en variabel DNA-koncentration för reaktion nummer 5. (A) panel visar tydligare tomter. (B) denna panel visar kopiera antal tomter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: flödesschema av protokollet qKAT. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Assay Gener Framåt grundfärger Koncentration (nM) Omvänd grundfärger Koncentration (nM) Sonder Koncentration (nM)
Nr 1 3DP1 A4F 250 A5R 250 P4a 150
2DL 2 2DL2F4 400 C3R2 600 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr 2 2DS2 A4F 400 A6R 400 P4a 200
2DL 3 D1F 400 D1R 400 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr 3 3DL 3 A8F 500 A8R 500 P4a 150
2DS4Del 2DS4Del 250 2DS4R2 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr 4 3DL1e4 B1F 250 B1R 125 P4b 150
3DL1e9 D4F 250 D4R2 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr 5 3DS1 B2F 250 B1R 250 P4b 150
2DL 4 C1F 200 C1R 200 P5b - 2DL 4 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr 6 2DL 1 B3F 500 B3R 125 P4b 150
2DP1 D3F 250 D3R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr 7 2DS1 B4F 500 B4R 250 P4b 150
2DL 5 D2F 500 D2R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr 8 2DS3 B5F 250 B5R 250 P4b 150
3DL2e9 D4F 250 D5R 125 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr 9 3DL2e4 A1F 200 A1R 200 P4a 150
2DS4FL 2DS4FL 250 2DS4R2 500 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr 10 2DS5 B6F2 200 B6R3 200 P4b 150
2DS4 C5F 250 C5R 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150

Tabell 1: kombination och koncentration av primers och sonder används i varje qKAT reaktion 27 .

Reaktion Primer alikvoter (µL) Sonden alikvoter (µL)
R1 3DP1 A4F A5R 2DL2F4 C3R2 VATTEN STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DL 2 100 100 160 240 200 80 80 60 60 60
R2 2DS2 A2F A6R D1F D1R VATTEN STAT6F STAT6R P4A P9 PSTAT6
2DL 3 160 160 160 160 160 80 80 80 60 60
Obs: måste 20 µL mindre vatten i MasterMix
R3 3DL 3 A8F A8FB A8R 2DS4DELF 2DS4R2 VATTEN STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4DEL 100 100 200 100 100 200 80 80 60 60 60
R4 3DL1E4 B1F B1R D4F D4R2 VATTEN STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL1E9 100 50 100 200 350 80 80 60 60 60
R5 3DS1 B2F B1R C1F C1R VATTEN STAT6F STAT6R P4B P5B - 2L 4 PSTAT6
2DL 4 100 100 80 80 440 80 80 60 60 60
R6 2DL 1 B3F B3R D3F D3R VATTEN STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DP1 200 50 100 200 250 80 80 60 60 60
R7 2DS1 B4F B4R D2F D2R VATTEN STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DL 5 200 100 200 200 100 80 80 60 60 60
R8 2DS3 B5F B5R D4F D5R VATTEN STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL2E9 100 100 100 50 450 80 80 60 60 60
R9 3DL2E4 A1F A1R 2DS4WTF 2DS4R2 VATTEN STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4WT 80 80 100 200 340 80 80 60 60 60
R10 2DS5 B6F2 B6R3 C5F C5R VATTEN STAT6F STAT6R P4B P5B PSTAT6
2DS4TOTAL 80 80 100 100 440 80 80 60 60 60

Tabell 2: Volymer (µL) av 100 µM grundfärg/sond stamlösningar att göra primer och sond kombination alikvoter.

Namn Riktning 5´ modifiering 3´ modifiering Sekvens (5' →3') Längd TM GC % EXoN Ställning
P4a Känsla FAM BHQ-1 TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA		 27 60 44,4 4 425-451
P4b Antisense FAM BHQ-1 AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T		 28 62 50 4 576-603
P5b Känsla ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG		 25 60 52 5 828-852
P5b - 2DL 4 Känsla ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG		 25 61 56 5 828-852
P9 Känsla ATTO647N BHQ-2 CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC		 24 60 62,5 9 1246-1269
PSTAT6 ATTO550 BHQ-2 CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT		 26 62 50

Tabell 3: lista över rymdsonder som används i qKAT 1, 27. de fluorescerande färgerna som används i 5' slutet av de oligo-proberna P5b, P5b - 2 DL 4, P9 och PSTAT6 ändrades till ATTO färgämnen.

Gene Grundfärger Riktning Sekvens (5´-3´) Längd TM GC % EXoN Ställning Amplikon (bp) Alleler kan missas
3DL2e4 A1F Framåt GCCCCTGCTGAA
ATCAGG		 18 52 61,1 4 399-416 179 3DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038.
A1R Omvänd CTGCAAGGACAG
GCATCAA		 19 53 52,6 559-577 3DL 2 * 048
3DP1 A4F Framåt GTCCCCTGGTGA
AATCAGA		 19 49 52,6 4 398-416 112 Ingen
A5R Omvänd GTGAGGCGCAAA
GTGTCA		 18 52 55,6 492-509 Ingen
2DS2 A2F Framåt GTCGCCTGGTGA
AATCAGA		 19 49 52,6 4 398-416 111 Ingen
A6R Omvänd TGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT		 21 51 42,9 488-508 Ingen
3DL 3 A8Fa Framåt GTGAAATCGGGA
GAGACG		 18 50 55,6 4 406-423 139 Ingen
A8Fb Framåt GGTGAAATCAGG
AGAGACG		 19 50 52,6 405-423 3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
A8R Omvänd AGTTGACCTGGG
AACCCG		 18 51 61,1 526-543 Ingen
3DL1e4 B1F Framåt CATCGGTCCCAT
GATGCT		 18 51 55,6 4 549-566 85 3DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
B1R Omvänd GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		 20 52 55 614-633 3DL 1 * 00502
3DS1 B2F Framåt CATCGGTTCCAT
GATGCG		 18 51 55,6 4 549-566 85 3DS1 * 047; kan plocka upp 3DL 1 * 054.
B1R Omvänd GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		 20 52 55 614-633 Ingen
2DL 1 B3F Framåt TTCTCCATCAGT
CGCATGAC		 20 52 50 4 544-563 96 2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
B3R Omvänd GTCACTGGGAGC
TGACAC		 18 50 61,1 622-639 2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1 B4F Framåt TCTCCATCAGTC
GCATGAA		 19 51 47,4 4 545-563 96 2DS1 * 001
B4R Omvänd GGTCACTGGGAG
CTGAC		 17 49 64,7 624-640 Ingen
2DS3 B5F Framåt CTCCATCGGTCG
CATGAG		 18 53 61,1 4 546-563 96 Ingen
B5R Omvänd GGGTCACTGGGA
GCTGAA		 18 51 61,1 624-641 Ingen
2DS5 B6F2 Framåt AGAGAGGGGACG
TTTAACC		 19 50 52,6 4 475-493 173 Ingen
B6R3 Omvänd TCCAGAGGGTCA
CTGGGC		 18 53 66,7 630-647 2DS5 * 003
2DL 4 C1F Framåt GCAGTGCCCAGC
ATCAAT		 18 52 55,6 5 808-825 83 Ingen
C1R Omvänd CCGAAGCATCTG
TAGGTCT		 19 52 52,6 872-890 2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 2 2DL2F4 Framåt GAGGTGGAGGCC
CATGAAT		 19 52 57,9 5 778-796 151 2DL 2 * 009; 782G ändras till A.
C3R2 Omvänd TCGAGTTTGACC
ACTCGTAT		 20 51 45 909-928 Ingen
2DS4 C5F Framåt TCCCTGCAGTGC
GCAGC		 17 57 70,6 5 803-819 120 Ingen
C5R Omvänd TTGACCACTCGT
AGGGAGC		 19 52 57,9 904-922 2DS4 * 013
2DS4Del 2DS4Del Framåt CCTTGTCCTGCA
GCTCCAT		 19 54 57,9 5 750-768 203 Ingen
2DS4R2 Omvänd TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		 20 53 50 933-952 Ingen
2DS4FL 2DS4FL Framåt CCGGAGCTCCTA
TGACATG		 19 53 57,9 5 744-762 209 Ingen
2DS4R2 Omvänd TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		 20 53 50 933-952 Ingen
2DL 3 D1F Framåt AGACCCTCAGGA
GGTGA		 17 48 58,8 9 1180-1196 156 Ingen
D1R Omvänd CAGGAGACAACT
TTGGATCA		 20 50 45 1316-1335 2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 och 2DL 3 * 01802
2DL 5 D2F Framåt CACTGCGTTTTC
ACACAGAC		 20 52 50 9 1214-1233 120 2DL5B * 011 och 2DL5B * 020
D2R Omvänd GGCAGGAGACAA
TGATCTT		 19 49 47,4 1315-1333 Ingen
2DP1 D3F Framåt CCTCAGGAGGTG
ACATACGT		 20 53 55 9 1184-1203 121 Ingen
D3R Omvänd TTGGAAGTTCCG
TGTACACT		 20 50 45 1285-1304 Ingen
3DL1e9 D4F Framåt CACAGTTGGATC
ACTGCGT		 19 52 52,6 9 1203-1221 93 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
D4R2 Omvänd CCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA		 23 53 43,5 1273-1295 3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9 D4F Framåt CACAGTTGGATC
ACTGCGT		 19 52 52,6 9 1203-1221 156 Ingen
D5R Omvänd GACCTGACTGTG
GTGCTCG		 19 54 63,2 1340-1358 Ingen
STAT6 STAT6F Framåt CCAGATGCCTAC
CATGGTGC		 20 54 60 129
STAT6R Omvänd CCATCTGCACAG
ACCACTCC		 20 54 60

Tabell 4: sekvenser av primers används i qKAT 1, 27.

KIR gen 3DL 3 2DS2 2DL 2 2DL 3 2DP1 2DL 1 3DP1 2DL 4 3DL 1
EX9		 3DL 1
EX9		 3DS1 2DL 5 2DS3 2DS5 2DS1 2DS4
Totalt		 2DS4
FL		 2DS4
DEL		 3DL 2
EX4		 3DL 2
EX9
Mest frekventerar kopienumret 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2

Tabell 5: Mest frekventerar kopia nummer för KIR gener som vanligt förekommande i Europeiska-ursprung prover.

Linkage disequilibrium regler för qKAT baserat på Europeiska populationer Kopiera nummer kontrollera
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 och KIR3DL2 är ramen gener närvarande på båda haplotyper. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 och KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 och KIR2DL2 är i LD med varandra 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 och KIR2DL3 är alleler av samma gen 2 DL 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 och KIR2DL1 är i LD med varandra 2DP1=2 DL 1
5 EXoN 4 i KIR3DL1 och KIR3DL2 är lika med exon 9 i KIR3DL1 och KIR3DL2 respektive. 3DL1ex4=3DL1ex9 och 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 och KIR3DS1 är alleler 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 och KIR2DS5 är i LD med KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 och KIR2DS1 är i LD 3DS1=2DS1
9 Förekomsten av KIR2DS1 och KIR2DS4TUmma är ömsesidigt uteslutande på en haplotyp 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL och KIR2DS4del är varianter av KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tabell 6: Linkage disequilibrium mellan KIR gener som vanligt förekommande i Europeiska-ursprung populationer kan användas för att kontrollera tal kopieringsdata 1,27.

Discussion

Vi beskrev en roman halvautomatisk hög genomströmning-metod, som kallas qKAT, vilket underlättar kopia nummer typning av KIR gener. Metoden är en förbättring jämfört med konventionella metoder som SSP-PCR, som låg genomströmning och kan bara ange närvaron eller frånvaron av dessa starkt polymorfa gener.

Riktigheten av kopia nummer uppgifterna är beroende av flera faktorer, inklusive kvalitet och koncentration-enhetlig gDNA proverna och kvaliteten av reagenser. Kvalitet och noggrannhet av gDNA proverna över en tallrik är oerhört viktiga eftersom variationer i koncentration över plattan kan leda till fel i beräkningen av antalet exemplar. Eftersom analyserna har validerats med hjälp av Europeiska-ursprung provningssatser, kräver data från kohorter från andra delar av världen grundligare kontroller. Detta är att säkerställa att instanser av allel avhopp eller icke-specifik primer/sond bindande inte är misstolkas som kopia nummer variant.

Medan analyserna var utformade och optimerade för att köra som hög genomströmning, kan de ändras för att köra färre prover. Förtroende måttet i programvaran kopia nummer analys påverkas när analysera färre prover, men detta kan förbättras om kontroll genomisk DNA-prover med ett känt KIR gen kopia antal ingår på plattan och ytterligare prov replikat är ingår.

För laboratorier utan vätska/plattan-hantering robotar, master mix kan doseras med flerkanaligt pipetter och plattor kan laddas manuellt i qPCR instrumentet.

Det huvudsakliga syftet bakom utvecklingen av qKAT var att skapa en enkel, hög genomströmning, högupplösta och kostnadseffektiv metod att genotyp KIRs för sjukdom associationsstudier. Detta uppnåddes framgångsrikt eftersom qKAT har varit anställd i undersöka KIR roll i flera stora sjukdom föreningen studier, inklusive en rad infektionssjukdomar, autoimmuna sjukdomar och graviditet störningar4, 24 , 25 , 26.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Projektet fick finansiering från medicinsk forskning rådet (MRC), den Europeiska forskningsrådet (ERC) under Europeiska unionens programmet Horisont 2020 forskning och innovation (grant avtal nr 695551) och National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedical Research Centre och NIH forskning blod och Transplant Research Unit (NIHR BTRU) i organdonation och Transplantation på universitetet i Cambridge och i partnerskap med NHS blod och transplantera (NHSBT). De åsikter som framförs är författarnas och inte nödvändigtvis de av NHS, NIHR, Institutionen för hälsa eller NHSBT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Oligonucleotides Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit Bioline BIO-86020 −
MilliQ water − − −
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor Eppendorf(or equivalent) Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000
OR
QuBit Fluorometer Life Technologies Q33216
Matrix Hydra Thermo Scientific 109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well Roche 05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) Caliper Life Sciences 204135
Vortex mixer Biosan BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) Gilson(or equivalent) F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) Starlab (or equivalent) S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL STARLAB E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube STARLAB E1450-0200
96-well deep well plate Fisher Scientific 12194162
LC480 384 Multi-well plates Roche 04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil Roche 04729757001
Name Company Catalog Number Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, W., et al. Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors. Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).
  2. Nemat-Gorgani, N., et al. Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa. The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).
  3. Norman, P. J., et al. Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans. PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).
  4. Nakimuli, A., et al. Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population. Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).
  5. Bontadini, A., et al. Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population. Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).
  6. Graef, T., et al. KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).
  7. Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150, 248-264 (2017).
  8. Blokhuis, J. H., et al. KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans. Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).
  9. Martin, M. P., et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS. Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).
  10. Khakoo, S. I., et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection. Science. 305, 872-874 (2004).
  11. van Bergen, J., et al. KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation. American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).
  12. Hiby, S. E., et al. Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).
  13. Nakimuli, A., et al. A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).
  14. van Bergen, J., et al. HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model. The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).
  15. Bachanova, V., et al. Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).
  16. Cooley, S., et al. Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 116, 2411-2419 (2010).
  17. Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians. Human Immunology. 79, 218-223 (2018).
  18. Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments. Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).
  19. Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling. Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).
  20. Martin, M. P., Carrington, M. KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis. Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).
  21. Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires. Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).
  22. Houtchens, K. A., et al. High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles. Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  24. Traherne, J. A., et al. KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families. Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).
  25. Hydes, T. J., et al. The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways. Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).
  26. Dunphy, S. E., et al. 2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells. Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).
  27. Jiang, W., et al. qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination. Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).

Tags

Genetik fråga 145 immunogenetik killer cell immunglobulin-like receptor (KIRs) kopiera nummer variation haplotyp humant leukocytantigen (HLA) natural killer cell kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR)
qKAT: kvantitativa Semi-automated typning av Killer-cell immunglobulin-like Receptor gener
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di,… More

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter