תא הרג כמותיים קולטן דמוי אימונוגלובולינים (קיר) חצי אוטומטיות הקלדה (qKAT) היא שיטה פשוטה, תפוקה גבוהה וחסכונית להעתיק מספר גנים “קיר” סוג של היישום שלהם במחקרים האגודה האוכלוסייה ומחלות.
תא הרג בנוגדנים דמוי קולטנים (KIRs) הם קבוצה של רצפטורים מעכבות, הפעלת המערכת החיסונית, על הרוצח הטבעיים (NK) ותאי T, מקודד על ידי מקבץ רב שלבית של גנים על כרומוזום 19. ליגנדים מאופיין ביותר שלהם הם מולקולות אנטיגן (הלע) לויקוציטים אנושיים מקודדים בתוך histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) לוקוס על כרומוזום 6. יש עדויות משמעותיות כי הם לשחק תפקיד משמעותי חסינות, רבייה, ההשתלה, שהופך אותו מכריע יש טכניקות יכולים במדויק גנוטיפ אותם. עם זאת, הומולוגיה גבוהה-רצף, כמו גם כמו allelic, וריאציה מס העתק, להקשות על שיטות עיצוב יכול בצורה מדויקת ויעילה גנוטיפ כל הגנים “קיר” . שיטות מסורתיות מוגבלים בדרך כלל את הרזולוציה של נתונים שהושגו, תפוקה, משתלמת, הזמן שנדרשו עבור התקנה והפעלה הניסויים. אנו מתארים שיטה הנקראת כמותיות וקיר חצי אוטומטיות הקלדה (qKAT), אשר היא שיטה תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת מולטיפלקס תפוקה גבוהה שיכול לקבוע את מספרי עותק ג’ין עבור כל הגנים במיקומה “קיר” . qKAT היא שיטה פשוטה תפוקה גבוהה שיכול לספק ברזולוציה גבוהה וקיר עותק מספר נתונים, אשר יכול לשמש עוד יותר להסיק הווריאציות haplotypes רב-צורתיות מבנית, שמעבירים אותם. מספר זה העתק נתונים haplotype יכול להועיל במחקרים על עמותות המחלה בקנה מידה גדול, גנטיקה של אוכלוסיות, כמו גם חקירות על הביטוי ואינטראקציות פונקציונלי בין קיר הלע.
בבני אדם, הקולטן בנוגדנים כמו רוצח(“קיר”) לוקוס ממופה על הזרוע הארוכה של כרומוזום 19 בתוך הקולטן ליקוציט מורכבים (LRC). לוקוס זה בסביבות 150 kb אורך וכוללת 15 וקיר הגנים מסודרים ראש זנב. לוקוסים וקיר הידועות כיום הם KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, שני pseudogenes, KIR2DP1 ו- KIR3DP1. הגנים וקיר קידוד עבור דו מימדי (2D) ואת רצפטורים תלת מימדי (3D) בנוגדנים כמו תחום עם קצר (S; הפעלת) או ארוכים (L; מעכבות) cytoplasmic זנבות, הבאים לידי ביטוי על ידי תאים הרוצח הטבעיים (NK) קבוצות משנה של T תאים. וריאציה מספר עותק הציג בתוך הצורות לוקוס וקיר haplotypes מגוונת עם תוכן משתנה ג’ין1. Non-allelic רקומבינציה הומולוגית (לבנון), בהנחייתם של סידור הגן ראש זנב קרוב והומולוגיה גבוהה-רצף, הוא המנגנון המוצע להיות אחראי על ההשתנות haplotypic. מעל 100 haplotypes שונות דווחו אוכלוסיות ברחבי העולם1,2,3,4. כל haplotypes האלה יכול להיות מחולק לשתי קבוצות עיקריות: A ו- B haplotypes. A haplotype מכיל גנים קיר 7: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, ואשר הינם גנים וקיר מעכבות, את הפעלת “קיר” ג’ין KIR2DS4. עם זאת, למעלה עד 70% של אנשים ממוצא אירופי homozygous על קיר haplotype A באופן בלעדי לשאת צורה פונקציונלי “מחיקת” של5, KIR2DS46. כל השילובים גנים אחרים וקיר בצורת haplotypes קבוצה B, כולל לפחות באחד מהגנים קיר מסוים KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, KIR2DL5, וכוללים בדרך כלל שניים או יותר גנים “קיר” הפעלת.
הלע מחלקה אני מולקולות זוהו על ליגנדים עבור מסוימים רצפטורים מעכבים (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1), הפעלת קולטנים (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, ו KIR3DS1), KIR2DL4, אשר הוא ייחודי קיר מכיל של זנב ארוך cytoplasmic כמו אחרים קולטנים וקיר מעכבות, אך גם יש משקע הטעון חיובית ליד המחשבים חוץ-תאית אשר נפוצה תכונה של אחרים הפעלת קולטני “קיר” . השילוב של משתנים בתוך הגנים “קיר”, הגנים הלע משפיע על האינטראקציה ליגנד לקולטן הזה צורות אפשריות NK תא תגובתיות-ברמת הפרט7,8. עדויות ממחקרים שיוך גנטי ציין כי וקיר משחק תפקיד ההתנגדות ויראלי (למשל., וירוס הכשל החיסוני האנושי [HIV]9 ו הפטיטיס C וירוס [בזכות]10), ההצלחה של השתלת 11, הסיכון של הפרעות הריון12,הצלחה הרבייה13, הגנה מפני נסיגה לאחר14,(HSCT) השתלת תא גזע allogeneic hematopoietic15, 16, את הסיכון של סרטן17.
השילוב של high-רצף הומולוגיה, allelic ואתגרים haplotypic גיוון מתנות במשימה של מדויק genotyping וקיר גנים. שיטות קונבנציונליות כדי להקליד “קיר” הגנים כוללים רצף ספציפי פריימר (SSP) פולימראז תגובת שרשרת (PCR)18,19,20, רצף ספציפי oligonucleotide בדיקה PCR (SSOP)21, ו לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון-שעת הטיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS)22. החסרונות של טכניקות אלה הן רק הם מספקים תובנה חלקית גנוטיפ של הפרט אך גם מפרך כדי לבצע. לאחרונה הוחל הדור הבא רצפי (הגדרות) כדי להקליד את לוקוס וקיר במיוחד. בעוד ששיטה זו היא רבת עוצמה, זה יכול להיות יקר כדי להפעיל, וזה זמן רב כדי לערוך בדיקות מעמיקה בניתוח ונתונים.
qKAT היא שיטת ה-PCR כמותי תפוקה גבוהה. בעוד שיטות קונבנציונליות מפרך וצורך, שיטה זו מאפשרת להפעיל כמעט 1,000 דגימות דנ א (gDNA) גנומית בחמישה ימים ונותן של גנוטיפ “קיר” , כמו גם את מספר עותק גנטי. qKAT מורכב עשר תגובות מולטיפלקס, שכל אחד מהם מטרות שני לוקוסים וקיר והעתק אחד הגנים הפניה של מספר עותק קבוע של הגנום (STAT6) משמש כימות היחסי של הגן וקיר מספר23. Assay הזה שימש בהצלחה בלימודי מעורבים לוחות אוכלוסייה גדולה לבין המחלה המפחידה על מחלות זיהומיות כגון בזכות, מחלות אוטואימוניות כמו בסוכרת מסוג 1, הריון הפרעות כגון רעלת, וכן מתן גנטי לגורם המרכזי עליו מושתתת על מחקרים להבנת NK תא פונקציה1,4,24,25,26.
אנו המתואר הרומן חצי אוטומטיות תפוקה גבוהה בשיטה, הנקראת qKAT, אשר מקלה על הקלדת מספר עותק של “קיר” גנים. השיטה היא שיפור על פני שיטות קונבנציונליות כמו SSP-PCR, תפוקה נמוכה והם יכולים רק להצביע על נוכחות או היעדרות של גנים אלה מאוד רב שלבית.
הדיוק של הנתונים מספר עותק שהושג תלויה גורמים רבים, כולל את האיכות ואת ריכוז-אחידות של הדגימות gDNA והאיכות של ריאגנטים. האיכות והדיוק של הדגימות gDNA על פני צלחת חשובים ביותר מאז וריאציות בריכוז על פני הצלחת עלולה לגרום לשגיאות בחישוב של המספר עותק. מאז מבחני היו מאומת באמצעות ערכות המדגם האירופי-מקור, נתונים גדודים משאר חלקי העולם דורשות בדיקות יסודית יותר. זו היא להבטיח כי מקרים של נשירת אלל או שאינם ספציפיים פריימר/בדיקה איגוד הם לא טעו לחשוב כמו העתק מספר וריאציות.
בעוד מבחני היו מעוצבות וממוטבות לרוץ כמו תפוקה גבוהה, ניתן לשנותן כדי להפעיל פחות דגימות. מדד ביטחון בתוכנת ניתוח מספר עותק מושפע בעת ניתוח דגימות פחות, אבל זה יכול להשתפר אם בקרת דגימות די אן איי גנומית עם מספר ידוע של עותק הגן וקיר כלולים בצלחת נוספים דוגמת משכפל כלל.
עבור מעבדות ללא נוזל/צלחת-טיפול רובוטים, מיקס מאסטר יכול ובשמפו באמצעות פיפטות רב ערוצית, צלחות ניתן לטעון ידנית לתוך הכלי qPCR.
המטרה העיקרית מאחורי התפתחות qKAT הייתה ליצור פשוטה, תפוקה גבוהה, ברזולוציה גבוהה, וחסכונית שיטה גנוטיפ KIRs למחלה האגודה מחקרים. דבר זה הושג בהצלחה מאז qKAT ננקטה חוקרים את התפקיד של “קיר” במספר מחקרים האגודה מחלה גדולה, כולל מגוון של מחלות זיהומיות, מחלות אוטואימוניות הריון הפרעות4, 24 , 25 , 26.
The authors have nothing to disclose.
הפרויקט קיבל מימון של המועצה למחקר רפואי (MRC), אירופה מחקר המועצה (ERC) תחת אופק 2020 מחקר וחדשנות התכנית של האיחוד האירופי (גרנט הסכם מס 695551) וקיימברידג המכון הלאומי לבריאות (NIH) ביו המרכז לחקר דם מחקר NIH והשתלת יחידת המחקר (NIHR BTRU) תרומת איברים והשתלות -מנדרינית, בשיתוף עם דם NHS השתלה (NHSBT). הדיעות הם אלה היוצרים ואלה לא בהכרח של בקופת חולים, את NIHR, מחלקת הבריאות או את NHSBT.
REAGENTS | |||
Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
MilliQ water | − | − | − |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
OR | |||
QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
SOFTWARE | |||
Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |