Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

qKAT: Semi-automated כמותיים הקלדה של הרוצח-תא גנים קולטני דמוי נוגדן

doi: 10.3791/58646 Published: March 6, 2019

Summary

תא הרג כמותיים קולטן דמוי אימונוגלובולינים (קיר) חצי אוטומטיות הקלדה (qKAT) היא שיטה פשוטה, תפוקה גבוהה וחסכונית להעתיק מספר גנים "קיר" סוג של היישום שלהם במחקרים האגודה האוכלוסייה ומחלות.

Abstract

תא הרג בנוגדנים דמוי קולטנים (KIRs) הם קבוצה של רצפטורים מעכבות, הפעלת המערכת החיסונית, על הרוצח הטבעיים (NK) ותאי T, מקודד על ידי מקבץ רב שלבית של גנים על כרומוזום 19. ליגנדים מאופיין ביותר שלהם הם מולקולות אנטיגן (הלע) לויקוציטים אנושיים מקודדים בתוך histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) לוקוס על כרומוזום 6. יש עדויות משמעותיות כי הם לשחק תפקיד משמעותי חסינות, רבייה, ההשתלה, שהופך אותו מכריע יש טכניקות יכולים במדויק גנוטיפ אותם. עם זאת, הומולוגיה גבוהה-רצף, כמו גם כמו allelic, וריאציה מס העתק, להקשות על שיטות עיצוב יכול בצורה מדויקת ויעילה גנוטיפ כל הגנים "קיר" . שיטות מסורתיות מוגבלים בדרך כלל את הרזולוציה של נתונים שהושגו, תפוקה, משתלמת, הזמן שנדרשו עבור התקנה והפעלה הניסויים. אנו מתארים שיטה הנקראת כמותיות וקיר חצי אוטומטיות הקלדה (qKAT), אשר היא שיטה תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת מולטיפלקס תפוקה גבוהה שיכול לקבוע את מספרי עותק ג'ין עבור כל הגנים במיקומה "קיר" . qKAT היא שיטה פשוטה תפוקה גבוהה שיכול לספק ברזולוציה גבוהה וקיר עותק מספר נתונים, אשר יכול לשמש עוד יותר להסיק הווריאציות haplotypes רב-צורתיות מבנית, שמעבירים אותם. מספר זה העתק נתונים haplotype יכול להועיל במחקרים על עמותות המחלה בקנה מידה גדול, גנטיקה של אוכלוסיות, כמו גם חקירות על הביטוי ואינטראקציות פונקציונלי בין קיר הלע.

Introduction

בבני אדם, הקולטן בנוגדנים כמו רוצח("קיר") לוקוס ממופה על הזרוע הארוכה של כרומוזום 19 בתוך הקולטן ליקוציט מורכבים (LRC). לוקוס זה בסביבות 150 kb אורך וכוללת 15 וקיר הגנים מסודרים ראש זנב. לוקוסים וקיר הידועות כיום הם KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, שני pseudogenes, KIR2DP1 ו- KIR3DP1. הגנים וקיר קידוד עבור דו מימדי (2D) ואת רצפטורים תלת מימדי (3D) בנוגדנים כמו תחום עם קצר (S; הפעלת) או ארוכים (L; מעכבות) cytoplasmic זנבות, הבאים לידי ביטוי על ידי תאים הרוצח הטבעיים (NK) קבוצות משנה של T תאים. וריאציה מספר עותק הציג בתוך הצורות לוקוס וקיר haplotypes מגוונת עם תוכן משתנה ג'ין1. Non-allelic רקומבינציה הומולוגית (לבנון), בהנחייתם של סידור הגן ראש זנב קרוב והומולוגיה גבוהה-רצף, הוא המנגנון המוצע להיות אחראי על ההשתנות haplotypic. מעל 100 haplotypes שונות דווחו אוכלוסיות ברחבי העולם1,2,3,4. כל haplotypes האלה יכול להיות מחולק לשתי קבוצות עיקריות: A ו- B haplotypes. A haplotype מכיל גנים קיר 7: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, ואשר הינם גנים וקיר מעכבות, את הפעלת "קיר" ג'ין KIR2DS4. עם זאת, למעלה עד 70% של אנשים ממוצא אירופי homozygous על קיר haplotype A באופן בלעדי לשאת צורה פונקציונלי "מחיקת" של5, KIR2DS46. כל השילובים גנים אחרים וקיר בצורת haplotypes קבוצה B, כולל לפחות באחד מהגנים קיר מסוים KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, KIR2DL5, וכוללים בדרך כלל שניים או יותר גנים "קיר" הפעלת.

הלע מחלקה אני מולקולות זוהו על ליגנדים עבור מסוימים רצפטורים מעכבים (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1), הפעלת קולטנים (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, ו KIR3DS1), KIR2DL4, אשר הוא ייחודי קיר מכיל של זנב ארוך cytoplasmic כמו אחרים קולטנים וקיר מעכבות, אך גם יש משקע הטעון חיובית ליד המחשבים חוץ-תאית אשר נפוצה תכונה של אחרים הפעלת קולטני "קיר" . השילוב של משתנים בתוך הגנים "קיר", הגנים הלע משפיע על האינטראקציה ליגנד לקולטן הזה צורות אפשריות NK תא תגובתיות-ברמת הפרט7,8. עדויות ממחקרים שיוך גנטי ציין כי וקיר משחק תפקיד ההתנגדות ויראלי (למשל., וירוס הכשל החיסוני האנושי [HIV]9 ו הפטיטיס C וירוס [בזכות]10), ההצלחה של השתלת 11, הסיכון של הפרעות הריון12,הצלחה הרבייה13, הגנה מפני נסיגה לאחר14,(HSCT) השתלת תא גזע allogeneic hematopoietic15, 16, את הסיכון של סרטן17.

השילוב של high-רצף הומולוגיה, allelic ואתגרים haplotypic גיוון מתנות במשימה של מדויק genotyping וקיר גנים. שיטות קונבנציונליות כדי להקליד "קיר" הגנים כוללים רצף ספציפי פריימר (SSP) פולימראז תגובת שרשרת (PCR)18,19,20, רצף ספציפי oligonucleotide בדיקה PCR (SSOP)21, ו לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון-שעת הטיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS)22. החסרונות של טכניקות אלה הן רק הם מספקים תובנה חלקית גנוטיפ של הפרט אך גם מפרך כדי לבצע. לאחרונה הוחל הדור הבא רצפי (הגדרות) כדי להקליד את לוקוס וקיר במיוחד. בעוד ששיטה זו היא רבת עוצמה, זה יכול להיות יקר כדי להפעיל, וזה זמן רב כדי לערוך בדיקות מעמיקה בניתוח ונתונים.

qKAT היא שיטת ה-PCR כמותי תפוקה גבוהה. בעוד שיטות קונבנציונליות מפרך וצורך, שיטה זו מאפשרת להפעיל כמעט 1,000 דגימות דנ א (gDNA) גנומית בחמישה ימים ונותן של גנוטיפ "קיר" , כמו גם את מספר עותק גנטי. qKAT מורכב עשר תגובות מולטיפלקס, שכל אחד מהם מטרות שני לוקוסים וקיר והעתק אחד הגנים הפניה של מספר עותק קבוע של הגנום (STAT6) משמש כימות היחסי של הגן וקיר מספר23. Assay הזה שימש בהצלחה בלימודי מעורבים לוחות אוכלוסייה גדולה לבין המחלה המפחידה על מחלות זיהומיות כגון בזכות, מחלות אוטואימוניות כמו בסוכרת מסוג 1, הריון הפרעות כגון רעלת, וכן מתן גנטי לגורם המרכזי עליו מושתתת על מחקרים להבנת NK תא פונקציה1,4,24,25,26.

Protocol

1. ציפוי מתוך ה-DNA והכנה

  1. לכמת במדויק את הריכוז gDNA שימוש בכלי spectrophotometric או fluorometric.
  2. לדלל את הדנ א כדי ng/µL 4 על צלחת עמוקה 96-טוב-טוב. כוללים אחד לפחות שליטה מדגם gDNA עם מספר עותק הידוע ושליטה שאינם מתבנית אחת.
  3. Centrifuge הלוחות 96-ובכן ב x 450 גרם למשך 2 דקות.
  4. שימוש בכלי טיפול בנוזלים, לוותר על כל מדגם ב ארבע פעמים על גבי לוחות qPCR 384-ובכן כך בכל טוב יש 10 ng של DNA (2.5 µL טוב). להכין לפחות 10 צלחות 384-. ובכן, אחד עבור כל תגובה qKAT.
  5. אם הוא להיות בגליל gDNA באמצעות גלופה 96-ובכן אחד או יותר, לבצע שטיפה מלא בנפח 2% אקונומיקה ומים הנדסה גנטית כדי לנקות את המחטים של הנוזל טיפול מערכת בין כל צלחת 96-ובכן דוגמאות gDNA.
  6. מילה נהדרת ה-DNA על ידי המקננת הלוחות 384-ובכן באזור נקי בטמפרטורת החדר במשך לפחות 24 שעות.

2. הכנת תחל וזונדים

הערה: qKAT מורכב תגובות מולטיפלקס עשר. כל התגובה כוללת שלושה זוגות פריימר וזונדים שלושה התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית המדגישים במיוחד שני גנים וקיר וג'ין הפניה אחת. הגששים שפורסמו בשנת ג'יאנג ואח27 שונו כך oligonucleotides מסומנות כעת עם צבעי אטו מאז הם מציעים פוטוסטביליטי משופרת ואורך זמן שידור. שילובים פריימר Pre-aliquoted הינם זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).

  1. הכנת תחל השילובים עבור כל תגובה לפי דילולים נתון בטבלה 1.
  2. להכין שילובים בדיקה עבור כל תגובה לפי טבלה 1. בדיקת כל בדיקה בודדים לפני קבלת השילוב.

3. הכנת המיקס מאסטר

הערה אמצעי האחסון המוזכרים להלן הם עבור ביצוע התגובה qKAT אחד על קבוצה של 10 x 384-ובכן צלחות.

  1. להבטיח כי הדגימות gDNA מצופה על לוחות 384-ובכן יבש לחלוטין. לנהל את כל השלבים על הקרח ולשמור את ריאגנטים מכוסה מחשיפה לאור ככל האפשר מאחר התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית הגששים צילום התרמו-והרגיש.
  2. מפשירים את מאגר qPCR, פריימר ולאחר בדיקה aliquots ב 4 º C.
  3. על קרח, להכין תערובת בסיס 10 x 384-ובכן הצלחות על-ידי הוספת 18.86 מ ל מים הנדסה גנטית, 20 מ"ל של מאגר qPCR, µL 1,000 שילוב פריימר preprepared µL 180 שילוב בדיקה preprepared (טבלה 2).
  4. פזר את תערובת הבסיס באופן שווה על פני צלחת 96-עמוק היטב באמצעות פיפטה של רב ערוצית, pipetting 415 µL לבאר כל. לשמור על הצלחת הזו בתיבת קרח מכוסה אור.
  5. שימוש בכלי טיפול בנוזלים, לוותר על µL 9.5 של המיקס מאסטר לבאר כל צלחת 384-טוב עם gDNA מיובשים. לאטום את הצלחת בנייר ולמקם אותו מיד ב 4 º C. חזור על תהליך זה עבור לוחות הנותרים, המבטיח כי המחטים של הנוזל טיפול מערכת נשטפים במים בין כל צלחת.
  6. Centrifuge הלוחות 384-ובכן ב 450 x g למשך 3 דקות, דגירה אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או בין 6-12 שעות כדי resuspend את ה-DNA וכדי להפיג כל בועות האוויר.

4. qPCR Assay

  1. בעקבות הדגירה לילה, צנטריפוגה ב x 450 גרם במשך 3 דקות לפרוק את כל בועות האוויר הנותרים.
  2. למטרות של אוטומציה, לחבר את המכונה qPCR (למשל, LightCycler 480) מלווה microplate (ראה טבלה של חומרים). תוכנית המטפל microplate כדי למקם את הצלחות לתוך המכונה qPCR מן מזח אחסון מקורר זה מוגן מפני אור.
    הערה מבחני צריך, בתיאוריה, לעבוד על מכונות אחרות qPCR עם הגדרות אופטיים תואם.
  3. השתמש אופניים התנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחריו 40 מחזורי 95 ° C עבור 15 s ו- C ° 66 תמורת 50 s, עם איסוף נתונים ב 66 º C.
  4. לאחר סיום ההפעלה, יש את הרובוט לאסוף את הצלחת מהמכונה qPCR ולמקם אותו לרציף להשליך.

5. פוסט-לרוץ לניתוח

  1. לאחר הגברה, לחשב את הערכים כימות מחזור (סי) באמצעות השיטה השניה המרבי נגזרות או השיטה מתאימה נקודות עם התוכנה של המכונה qPCR (ראה טבלה של חומרים), ביצוע השלבים הבאים.
  2. פתח את תוכנת qPCR, בכרטיסייה ' ניווט ', פתח את הקובץ ניסוי התגובה שנשמרו עבור לוח אחד.
  3. על הניתוח באמצעות השיטה השניה המרבי נגזרות, בחר בכרטיסיה ניתוח, וליצור ניתוח חדש בשיטת Abs Quant/Second נגזרת מקס.
    1. בחלון ' יצירת ניתוח חדש ', בחר סוג ניתוח: Abs Quant/Second נגזרת מקס שיטה, משנה: כל דגימות, תוכנית: הגברה, שם: Rx-DFO (כאשר x הוא מספר התגובה).
    2. בחר מסנן מסרק ובחר הקס/ויק/Yellow555 (533-580). פעולה זו מבטיחה כי הנתונים שנאספו עבור STAT6 נבחרה.
    3. בחר צבע פיצוי עבור VIC/HEX/Yellow555(533-580). לחץ על חשב. חזור על הפעולה עבור המשפחה (465-510) ו- Cy5/Cy5.5(618-660). לחץ על שמור קובץ.
  4. לניתוח בשיטת נקודות מתאים, בחר נקודות חשבים/Fit Abs בכרטיסיה ניתוח.
    1. בחלון ' יצירת ניתוח חדש ', בחר סוג ניתוח: נקודות חשבים/Fit Abs שיטה, משנה: כל דגימות, תוכנית: הגברה, שם: RxF-DFO (כאשר x הוא מספר התגובה).
    2. בחר את המסננים הנכונה ואת צבע פיצויים עבור STAT6 וכל אחת של גנים "קיר" (Fam/Cy5). בכרטיסייה ' Noiseband ', הגדר את להקת רעש כדי לא לכלול את רעשי הרקע.
    3. בכרטיסייה ' ניתוח ', הגדר את הנקודות מתאים ל- 3 ובחר שהצג מתאים נקודות. לחץ על חשב. לחץ על שמור קובץ.

6. ייצוא של תוצאות

  1. בהתוכנה qPCR, פתח את הנווט בכרטיסיית לבחור לייצא את התוצאות אצווה.
  2. פתח את התיקייה שבה הקבצים ניסוי נשמרות, להעביר את הקבצים לתוך המקטע מצד ימין של החלון. לחץ על הבא. בחר את השם והמיקום של קובץ הייצוא.
  3. בחר סוג ניתוח Abs Quant/Second נגזרת מקס שיטה או Abs חשבים/Fit נקודות. לחץ על הבא. בדוק השם של הקובץ, התיקיה לייצא את סוג ניתוח הן נכונות, לחץ על הבא כדי להתחיל את תהליך הייצוא.
  4. המתן עד מצב ייצוא הוא בסדר. המסך יעבור אוטומטית לשלב הבא. . תבדוק את כל הקבצים שנבחרו יוצאו בהצלחה כך מספר הקבצים נכשל = 0. לחץ על לעשות.
  5. להשתמש בקבצי script split_file.pl roche2sds.pl כדי לפצל את הצלחות מיוצא תגובות בודדות עבור כל צלחת.
    הערה קבצי ה-script מסופקים על פי בקשה/GitHub.

7. העתק מספר חישובים

  1. פתח את מספר ניתוח התוכנה להעתיק (לדוגמה, CopyCaller). בחר ייבוא קובץ תוצאות ה-PCR בזמן אמת , לטעון קבצי טקסט שנוצר על-ידי roche2sds.pl.
  2. בחרו נתח , לערוך את הניתוח על-ידי גם בחירת כיל לדוגמה עם עותק הידוע מספר או על-ידי בחירת מספר עותק בתדירות הגבוהה ביותר. ראה טבלה 5 עבור המספר עותק בתדירות הגבוהה ביותר של גנים "קיר" בדרך כלל נצפתה באוכלוסיות ממוצא אירופי.

8. איכות הנתונים בודק

  1. להשתמש בקובץ script R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R לשלב העתק נתונים מספר הצלחות לתוך גיליון אלקטרוני.
    הערה קבצי ה-script מסופקים על פי בקשה/GitHub.
  2. בדוק מחדש את הנתונים הגולמיים על התוכנה ניתוח מספר עותק עבור דגימות לא תואמות הידוע תאחיזה לא שוויונית (LD) עבור קיר גנים (טבלה 6).

Representative Results

ניתוח מספר עותק יכול להתבצע על-ידי ייצוא הקבצים לתוכנה עותק מספר ניתוח, אשר מספק מספר להעתיק החזוי המשוערת בהתבסס על שיטת ΔΔCq.

המספר עותק ניתן לחזות שגם בהתבסס על עותק הידוע מספר דגימות די אן איי שליטה בצלחת או על-ידי הזנת המספר עותק גנטי בתדירות הגבוהה ביותר (טבלה 5). איור 1 מציג את התוצאות של צלחת לתגובה שמכוונת KIR2DL4 , KIR3DS1, כמו גם את הגן הפניה STAT6. המספר עותק בתדירות הגבוהה ביותר עבור KIR2DL4, גן מסגרת במיקומה "קיר" , היא שני עותקים, בעוד מספר עותק בתדירות הגבוהה ביותר של KIR3DS1, הפעלת הגן, אינו עותק אחד. התוצאות באיור מציגות החלקות הגברה PCR שנצפו על התוכנה qPCR, הנתונים מספר עותק שנוצר מהנתונים qPCR. כפי שמוצג, וזמינותו הוא היכולת להבחין בין 0, 1, 2, 3 ו- 4 מספרים עותק של ג'ין "קיר" . ניתוח מספר עותק התוכנה גם מאפשר צפייה של ההתפלגות של מספר עותק על-פני לוח תרשים עוגה או תרשים עמודות. היעילות של התחזית מספר העותק הוא נמוך יותר עבור דגימות עם העתק מספר גבוה יותר.

האיכות של כל החומרים המשמשים את התגובות gDNA, מאגר, תחל, רגשים, יכול להשפיע על הדיוק של התוצאות המתקבלות. הכתבים בתוצאות זאת, סביר להניח להיגרם עקב וריאציה הריכוז של ה-DNA על פני צלחת. טוהר gDNA חילוץ, אשר ניתן למדוד באמצעות של 260/280 ו- 260/230 יחסי, גם יכולה להיות השפעה על האיכות. יחס 260/280 של 1.8-2 ו 260/230 יחס של 2-2.2 הם רצויים. ריכוזים טווח לא אחידה של הדנ א על פני צלחת יכול להוביל השתנות גבוהה במחזור הסף (סיטי) בין הכתבים בטווח של המספר המשוער עותק ודוגמאות. התוצאות באיור 2 מציגות האפקט שהפער בין ערכיt C על פני צלחת יכולה להיות על הדיוק בניבוי של המספר עותק. הקו האדום מציין את טווח המספר המשוער עותק עבור מדגם ו, באופן אידיאלי, צריך להיות קרוב שלם ככל האפשר.

ניתן לייצא את עותק מספר נתונים, פעם ניתח, בתור קובץ הגיליון האלקטרוני בתבנית 96-ובכן. השתמשנו קובץ script R (זמין על פי בקשה) כדי לשלב את הנתונים מספר עותק של כל לוחות 10 שמופעלות כערכה לתוך גיליון אלקטרוני אחד. נתונים שפורסמו על KIRs של אוכלוסיות ממוצא אירופאי בעיקר מאפשרת נבואתו של LD הכללים הקיימים בין גנים שונים מורכבים "קיר" 1. תחזיות אלה משמשים לערוך בדיקות במורד הזרם על עותק מספר התוצאות המתקבלות (טבלה 6). דוגמאות לא תואמות תעודת הזהות החזוי בין הגנים עשוי להכיל פולימורפיזם יוצא דופן או וריאציות מבניות haplotypic. תרשים זרימה המתאר את הפרוטוקול מוצג באיור3.

כלי שנקרא "קיר" Haplotype המזהה (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) פותחה כדי להקל את מעומק של haplotypes של ערכת הנתונים. מעומק עובד על בסיס רשימת הפניה haplotypes הנהוגות האוכלוסייה האירופית-מקור1. עם זאת, הכלי מאפשרת גם עבור ערכה מותאמת אישית של הפניה haplotypes כדי להשתמש במקום זאת. שלושה קבצים נפרדים נוצרים; הקובץ הראשון מפרטת את כל השילובים haplotype עבור מדגם, הקובץ השני מספק רשימת הצירופים haplotypes שיש משולב התדרים הגבוהים החתוך, ומפרטת הקובץ השלישי כדוגמאות אין אפשרות להקצות haplotypes. Non-הקצאה של haplotypes יכול לשמש כמחוון של haplotypes רומן.

Figure 1
איור 1: התוצאות נציג של צלחת על תגובה מספר 5- (א) זה הגברה מראה החלונית חלקות. (B) לוח זה מראה להעתיק מספר חלקות. (ג) לוח זה מציג את התפלגות מספר עותק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: התוצאות נציג של צלחת עם ריכוז ה-DNA משתנה עבור התגובה מספר 5- (א) זה הגברה מראה החלונית חלקות. (B) לוח זה מראה להעתיק מספר חלקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תרשים זרימה של פרוטוקול qKAT. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Assay גנים תחל קדימה ריכוז (אן אם) תחל הפוכה ריכוז (אן אם) הגששים ריכוז (אן אם)
מס ' 1 3DP1 A4F 250 A5R 250 P4a 150
2DL 2 2DL2F4 400 C3R2 600 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 2 2DS2 A4F 400 A6R 400 P4a 200
2DL 3 D1F 400 D1R 400 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
מס ' 3 3DL 3 A8F 500 A8R 500 P4a 150
2DS4Del 2DS4Del 250 2DS4R2 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
4. לא 3DL1e4 B1F 250 B1R 125 P4b 150
3DL1e9 D4F 250 D4R2 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 5 3DS1 B2F 250 B1R 250 P4b 150
2DL 4 C1F 200 C1R 200 P5b - 2DL 4 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
6. לא 2DL 1 B3F 500 B3R 125 P4b 150
2DP1 D3F 250 D3R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
. מספר 7 2DS1 B4F 500 B4R 250 P4b 150
2DL 5 D2F 500 D2R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 8 2DS3 B5F 250 B5R 250 P4b 150
3DL2e9 D4F 250 G51 125 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 9 3DL2e4 A1F 200 A1R 200 P4a 150
2DS4FL 2DS4FL 250 2DS4R2 500 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
10. לא 2DS5 B6F2 200 B6R3 200 P4b 150
2DS4 C5F 250 C5R 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150

טבלה 1: שילוב עם ריכוז תחל וזונדים בשימוש כל תגובה qKAT 27 .

התגובה פריימר Aliquots (µL) בדיקה Aliquots (µL)
R1 3DP1 A4F A5R 2DL2F4 C3R2 מים STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DL 2 100 100 160 240 200 80 80 60 60 60
R2 2DS2 A2F A6R D1F D1R מים STAT6F STAT6R P4A P9 PSTAT6
2DL 3 160 160 160 160 160 80 80 80 60 60
שים לב: עליך µL 20 פחות מים MasterMix
R3 3DL 3 A8F A8FB A8R 2DS4DELF 2DS4R2 מים STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4DEL 100 100 200 100 100 200 80 80 60 60 60
R4 3DL1E4 B1F B1R D4F D4R2 מים STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL1E9 100 50 100 200 350 80 80 60 60 60
R5 3DS1 B2F B1R C1F C1R מים STAT6F STAT6R P4B P5B - 2L 4 PSTAT6
2DL 4 100 100 80 80 440 80 80 60 60 60
R6 2DL 1 B3F B3R D3F D3R מים STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DP1 200 50 100 200 250 80 80 60 60 60
R7 2DS1 B4F B4R D2F D2R מים STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DL 5 200 100 200 200 100 80 80 60 60 60
R8 2DS3 B5F B5R D4F D5R מים STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL2E9 100 100 100 50 450 80 80 60 60 60
R9 3DL2E4 A1F A1R 2DS4WTF 2DS4R2 מים STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4WT 80 80 100 200 340 80 80 60 60 60
R10 2DS5 B6F2 B6R3 C5F C5R מים STAT6F STAT6R P4B P5B PSTAT6
2DS4TOTAL 80 80 100 100 440 80 80 60 60 60

טבלה 2: כרכים (µL) של 100 מיקרומטר פריימר/בדיקה במלאי פתרונות פריימר ולבצע בדיקה בשילוב aliquots.

שם כיוון שינוי 5´ שינוי 3´ רצף (5' →3') אורך Tm GC % אקסון מיקום
P4a הגיוני FAM BHQ-1 TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA
27 60 44.4 4 425-451
P4b Antisense FAM BHQ-1 AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T
28 62 50 4 576-603
P5b הגיוני ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG
25 60 52 5 828 – 852
P5b - 2DL 4 הגיוני ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG
25 61 56 5 828 – 852
P9 הגיוני ATTO647N BHQ-2 CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC
24 60 62.5 9 1246-1269
PSTAT6 ATTO550 BHQ-2 CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT
26 62 50

טבלה 3: רשימה של הגששים בשימוש qKAT 1, 27. צבעי פלורסנט השתמשו בקצה 5' של הגששים oligo P5b, P5b - 2 DL 4, P9, PSTAT6 שונו כדי צבעי אטו.

ג'ין תחל כיוון רצף (5´-3´) אורך Tm GC % אקסון מיקום אמפליקון (bp) אללים עלול לפספס
3DL2e4 A1F קדימה GCCCCTGCTGAA
ATCAGG
18 52 61.1 4 399-416 179 3DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038.
A1R הפוך CTGCAAGGACAG
GCATCAA
19 53 52.6 559-577 3DL 2 * 048
3DP1 A4F קדימה GTCCCCTGGTGA
AATCAGA
19 49 52.6 4 398-416 112 אף אחד
A5R הפוך GTGAGGCGCAAA
GTGTCA
18 52 55.6 492-509 אף אחד
2DS2 A2F קדימה GTCGCCTGGTGA
AATCAGA
19 49 52.6 4 398-416 111 אף אחד
A6R הפוך TGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT
21 51 42.9 488-508 אף אחד
3DL 3 A8Fa קדימה GTGAAATCGGGA
GAGACG
18 50 55.6 4 406-423 139 אף אחד
A8Fb קדימה GGTGAAATCAGG
AGAGACG
19 50 52.6 405-423 3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
A8R הפוך AGTTGACCTGGG
AACCCG
18 51 61.1 526-543 אף אחד
3DL1e4 B1F קדימה CATCGGTCCCAT
GATGCT
18 51 55.6 4 549-566 85 3DL 1 * 00505, DL 3 1 * 006, DL 3 1 * 054, DL 3 1 * 086, DL 3 1 * 089
B1R הפוך GGGAGCTGACAA
CTGATAGG
20 52 55 614-633 3DL 1 * 00502
3DS1 B2F קדימה CATCGGTTCCAT
GATGCG
18 51 55.6 4 549-566 85 3DS1 * 047; ייתכן לאסוף 3DL 1 * 054.
B1R הפוך GGGAGCTGACAA
CTGATAGG
20 52 55 614-633 אף אחד
2DL 1 B3F קדימה TTCTCCATCAGT
CGCATGAC
20 52 50 4 544-563 96 DL 2 1 * 020, DL 2 1 * 028
B3R הפוך GTCACTGGGAGC
TGACAC
18 50 61.1 622-639 DL 2 1 * 023, DL 2 1 * 029, DL 2 1 * 030
2DS1 B4F קדימה TCTCCATCAGTC
GCATGAA
19 51 47.4 4 545-563 96 2DS1 * 001
B4R הפוך GGTCACTGGGAG
CTGAC
17 49 64.7 624-640 אף אחד
2DS3 B5F קדימה CTCCATCGGTCG
CATGAG
18 53 61.1 4 546-563 96 אף אחד
B5R הפוך GGGTCACTGGGA
GCTGAA
18 51 61.1 624-641 אף אחד
2DS5 B6F2 קדימה AGAGAGGGGACG
TTTAACC
19 50 52.6 4 475-493 173 אף אחד
B6R3 הפוך TCCAGAGGGTCA
CTGGGC
18 53 66.7 630-647 2DS5 * 003
2DL 4 C1F קדימה GCAGTGCCCAGC
ATCAAT
18 52 55.6 5 808-825 83 אף אחד
C1R הפוך CCGAAGCATCTG
TAGGTCT
19 52 52.6 872-890 2DL 4 * 018, DL 2 4 * 019
2DL 2 2DL2F4 קדימה GAGGTGGAGGCC
CATGAAT
19 52 57.9 5 778-796 151 2DL 2 * 009; 782G לשנות לא
C3R2 הפוך TCGAGTTTGACC
ACTCGTAT
20 51 45 909-928 אף אחד
2DS4 C5F קדימה TCCCTGCAGTGC
GCAGC
17 57 70.6 5 803-819 120 אף אחד
C5R הפוך TTGACCACTCGT
AGGGAGC
19 52 57.9 904-922 2DS4 * 013
2DS4Del 2DS4Del קדימה CCTTGTCCTGCA
GCTCCAT
19 54 57.9 5 750-768 203 אף אחד
2DS4R2 הפוך TGACGGAAACAA
GCAGTGGA
20 53 50 933-952 אף אחד
2DS4FL 2DS4FL קדימה CCGGAGCTCCTA
TGACATG
19 53 57.9 5 744-762 209 אף אחד
2DS4R2 הפוך TGACGGAAACAA
GCAGTGGA
20 53 50 933-952 אף אחד
2DL 3 D1F קדימה AGACCCTCAGGA
GGTGA
17 48 58.8 9 1180-1196 156 אף אחד
D1R הפוך CAGGAGACAACT
TTGGATCA
20 50 45 1316-1335 2DL 3 * 010, DL 2 3 * 017, DL 2 3 * 01801, DL 2 3 * 01802
2DL 5 D2F קדימה CACTGCGTTTTC
ACACAGAC
20 52 50 9 1214-1233 120 2DL5B * 011 ו- 2DL5B * 020
D2R הפוך GGCAGGAGACAA
TGATCTT
19 49 47.4 1315-1333 אף אחד
2DP1 D3F קדימה CCTCAGGAGGTG
ACATACGT
20 53 55 9 1184-1203 121 אף אחד
D3R הפוך TTGGAAGTTCCG
TGTACACT
20 50 45 1285-1304 אף אחד
3DL1e9 D4F קדימה CACAGTTGGATC
ACTGCGT
19 52 52.6 9 1203-1221 93 3DL 1 * 061, DL 3 1 * 068
D4R2 הפוך CCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA
23 53 43.5 1273-1295 3DL 1 * 05901, DL 3 1 * 05902, DL 3 1 * 060, DL 3 1 * 061, DL 3 1 * 064, DL 3 1 * 065, DL 3 1 * 094N, DL 3 1 * 098
3DL2e9 D4F קדימה CACAGTTGGATC
ACTGCGT
19 52 52.6 9 1203-1221 156 אף אחד
D5R הפוך GACCTGACTGTG
GTGCTCG
19 54 63.2 1340-1358 אף אחד
STAT6 STAT6F קדימה CCAGATGCCTAC
CATGGTGC
20 54 60 129
STAT6R הפוך CCATCTGCACAG
ACCACTCC
20 54 60

בטבלה 4: רצף צבעי יסוד בשימוש qKAT 1, 27-

"קיר" ג'ין 3DL 3 2DS2 2DL 2 2DL 3 2DP1 2DL 1 3DP1 2DL 4 3DL 1
EX9
3DL 1
EX9
3DS1 2DL 5 2DS3 2DS5 2DS1 2DS4
סה
2DS4
פל
2DS4
דל
3DL 2
ex4
3DL 2
EX9
מספר עותק בתדירות הגבוהה ביותר 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2

טבלה 5: העתק בתדירות הגבוהה ביותר למספר "קיר" גנים שנצפתה בדרך כלל נקודת המוצא האירופי דגימות.

תאחיזה לא שוויונית לכללי qKAT מבוסס על אוכלוסיות האירופית סימון מספר עותק
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 ו KIR3DL2 הם מסגרת הגנים המצויים על שתי haplotypes. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 , KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 , KIR2DL2 הינם LD אחד עם השני 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 ו KIR2DL3 הם אללים של אותו גן 2 DL 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 , KIR2DL1 הינם LD אחד עם השני 2DP1=2 DL 1
5 אקסון 4 של KIR3DL1 ו- KIR3DL2 שווה אקסון 9 של KIR3DL1 ו- KIR3DL2 בהתאמה. 3DL1ex4=3DL1ex9 , 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 ו KIR3DS1 הם אללים 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 , KIR2DS5 הינם LD עם KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 , KIR2DS1 הינם LD 3DS1=2DS1
9 הנוכחות של otal KIR2DS1 , KIR2DS4Tהיא שבחירה-haplotype 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL ו KIR2DS4del הם וריאציות של KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

טבלה 6: תאחיזה לא שוויונית בין "קיר" גנים נצפתה נפוץ בקרב אוכלוסיות ממוצא אירופאי יכול לשמש כדי לבדוק את הנתונים מספר עותק 1,27-

Discussion

אנו המתואר הרומן חצי אוטומטיות תפוקה גבוהה בשיטה, הנקראת qKAT, אשר מקלה על הקלדת מספר עותק של "קיר" גנים. השיטה היא שיפור על פני שיטות קונבנציונליות כמו SSP-PCR, תפוקה נמוכה והם יכולים רק להצביע על נוכחות או היעדרות של גנים אלה מאוד רב שלבית.

הדיוק של הנתונים מספר עותק שהושג תלויה גורמים רבים, כולל את האיכות ואת ריכוז-אחידות של הדגימות gDNA והאיכות של ריאגנטים. האיכות והדיוק של הדגימות gDNA על פני צלחת חשובים ביותר מאז וריאציות בריכוז על פני הצלחת עלולה לגרום לשגיאות בחישוב של המספר עותק. מאז מבחני היו מאומת באמצעות ערכות המדגם האירופי-מקור, נתונים גדודים משאר חלקי העולם דורשות בדיקות יסודית יותר. זו היא להבטיח כי מקרים של נשירת אלל או שאינם ספציפיים פריימר/בדיקה איגוד הם לא טעו לחשוב כמו העתק מספר וריאציות.

בעוד מבחני היו מעוצבות וממוטבות לרוץ כמו תפוקה גבוהה, ניתן לשנותן כדי להפעיל פחות דגימות. מדד ביטחון בתוכנת ניתוח מספר עותק מושפע בעת ניתוח דגימות פחות, אבל זה יכול להשתפר אם בקרת דגימות די אן איי גנומית עם מספר ידוע של עותק הגן וקיר כלולים בצלחת נוספים דוגמת משכפל כלל.

עבור מעבדות ללא נוזל/צלחת-טיפול רובוטים, מיקס מאסטר יכול ובשמפו באמצעות פיפטות רב ערוצית, צלחות ניתן לטעון ידנית לתוך הכלי qPCR.

המטרה העיקרית מאחורי התפתחות qKAT הייתה ליצור פשוטה, תפוקה גבוהה, ברזולוציה גבוהה, וחסכונית שיטה גנוטיפ KIRs למחלה האגודה מחקרים. דבר זה הושג בהצלחה מאז qKAT ננקטה חוקרים את התפקיד של "קיר" במספר מחקרים האגודה מחלה גדולה, כולל מגוון של מחלות זיהומיות, מחלות אוטואימוניות הריון הפרעות4, 24 , 25 , 26.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

הפרויקט קיבל מימון של המועצה למחקר רפואי (MRC), אירופה מחקר המועצה (ERC) תחת אופק 2020 מחקר וחדשנות התכנית של האיחוד האירופי (גרנט הסכם מס 695551) וקיימברידג המכון הלאומי לבריאות (NIH) ביו המרכז לחקר דם מחקר NIH והשתלת יחידת המחקר (NIHR BTRU) תרומת איברים והשתלות -מנדרינית, בשיתוף עם דם NHS השתלה (NHSBT). הדיעות הם אלה היוצרים ואלה לא בהכרח של בקופת חולים, את NIHR, מחלקת הבריאות או את NHSBT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Oligonucleotides Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit Bioline BIO-86020
MilliQ water
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor Eppendorf(or equivalent) Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000
OR
QuBit Fluorometer Life Technologies Q33216
Matrix Hydra Thermo Scientific 109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well Roche 05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) Caliper Life Sciences 204135
Vortex mixer Biosan BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) Gilson(or equivalent) F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) Starlab (or equivalent) S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL STARLAB E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube STARLAB E1450-0200
96-well deep well plate Fisher Scientific 12194162
LC480 384 Multi-well plates Roche 04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil Roche 04729757001
Name Company Catalog Number Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, W., et al. Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors. Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).
  2. Nemat-Gorgani, N., et al. Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa. The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).
  3. Norman, P. J., et al. Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans. PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).
  4. Nakimuli, A., et al. Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population. Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).
  5. Bontadini, A., et al. Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population. Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).
  6. Graef, T., et al. KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).
  7. Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150, 248-264 (2017).
  8. Blokhuis, J. H., et al. KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans. Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).
  9. Martin, M. P., et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS. Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).
  10. Khakoo, S. I., et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection. Science. 305, 872-874 (2004).
  11. van Bergen, J., et al. KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation. American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).
  12. Hiby, S. E., et al. Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).
  13. Nakimuli, A., et al. A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).
  14. van Bergen, J., et al. HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model. The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).
  15. Bachanova, V., et al. Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).
  16. Cooley, S., et al. Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 116, 2411-2419 (2010).
  17. Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians. Human Immunology. 79, 218-223 (2018).
  18. Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments. Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).
  19. Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling. Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).
  20. Martin, M. P., Carrington, M. KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis. Methods in Molecular Biology. 49-64 (2008).
  21. Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires. Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).
  22. Houtchens, K. A., et al. High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles. Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  24. Traherne, J. A., et al. KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families. Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).
  25. Hydes, T. J., et al. The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways. Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).
  26. Dunphy, S. E., et al. 2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells. Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).
  27. Jiang, W., et al. qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination. Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).
qKAT: Semi-automated כמותיים הקלדה של הרוצח-תא גנים קולטני דמוי נוגדן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).More

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter