मात्रात्मक हत्यारा सेल इम्युनोग्लोबुलिन की तरह रिसेप्टर (कीर) अर्द्ध स्वचालित टाइपिंग (qkat) एक सरल, उच्च थ्रॉपुट, और लागत प्रभावी तरीका संख्या प्रकार कीर जीन जनसंख्या और रोग एसोसिएशन के अध्ययन में अपने आवेदन के लिए कॉपी करने के लिए है ।
हत्यारा सेल इम्युनोग्लोबुलिन की तरह रिसेप्टर्स (kirs) निरोधात्मक और सक्रिय प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स का एक सेट कर रहे हैं, प्राकृतिक हत्यारा (nk) और टी कोशिकाओं, पर जीन के एक बहुरूपी क्लस्टर द्वारा इनकोडिंग गुणसूत्र 19. उनकी सबसे अच्छी विशेषता लाइगैंडों मानव ल्यूकोसाइट antigen (hla) अणुओं है कि प्रमुख हिस्टोसंगतता परिसर के भीतर इनकोडिंग कर रहे हैं (mhc) गुणसूत्र पर लोकस 6. वहां पर्याप्त सबूत है कि वे प्रतिरक्षा, प्रजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और प्रत्यारोपण, यह महत्वपूर्ण तकनीकों है कि उंहें सही जीनोटाइप कर सकते है बनाने के लिए । हालांकि, उच्च अनुक्रम होमोलॉजी, साथ ही विकल्पी और प्रतिलिपि संख्या भिन्नता, यह मुश्किल है कि सही ढंग से और कुशलता से सभी कीर जीन जीनोटाइप कर सकते हैं डिजाइन करने के लिए बनाने के लिए । पारंपरिक तरीकों आमतौर पर प्राप्त डेटा के संकल्प में सीमित कर रहे हैं, throughput, लागत प्रभावशीलता, और समय की स्थापना और प्रयोगों को चलाने के लिए लिया. हम मात्रात्मक कीर अर्ध स्वचालित टाइपिंग (qkat) नामक एक विधि का वर्णन करते हैं, जो एक उच्च-थ्रॉपुट मल्टीप्लेक्स रीयल-टाइम पॉलीमरस चेन रिएक्शन विधि है जो कीर लोकस में सभी जीन के लिए जीन कॉपी संख्या निर्धारित कर सकता है । qkat एक सरल उच्च-थ्रॉपुट विधि है जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन कीर कॉपी संख्या डेटा प्रदान कर सकती है, जिसे आगे चलकर संरचनात्मक रूप से पॉलीमोर्फिक हप्लोटाइप में भिन्नता का अनुमान लगाया जा सकता है जो उन्हें शामिल करता है । यह प्रति संख्या और haplotype डेटा बड़े पैमाने पर रोग संघों, जनसंख्या आनुवंशिकी पर अध्ययन के लिए फायदेमंद हो सकता है, साथ ही साथ अभिव्यक्ति और कीर और hlaके बीच कार्यात्मक बातचीत पर जांच ।
मनुष्यों में, खूनी इम्यूनोग्लोबुलिन की तरह रिसेप्टर(कीर) लोकस ल्यूकोसाइट रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स (एलआरसी) के भीतर गुणसूत्र 19 के लंबे हाथ पर मैप किया जाता है । इस लोकस लंबाई में १५० kb के आसपास है और 15 कीर जीन की व्यवस्था सिर से पूंछ भी शामिल है । वर्तमान में ज्ञात कीर loci हैं KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, और दो स्यूडोजीन, KIR2DP1 और KIR3DP1। दो आयामी (2d) और तीन आयामी (3 डी) इम्युनोग्लोबुलिन की तरह डोमेन रिसेप्टर्स के लिए कीर जीन सांकेतिक शब्दों में बदलना कम (एस सक्रिय) या लंबे समय (एल; निरोधात्मक) कोशिकाद्रव्यी पूंछ, जो प्राकृतिक हत्यारा द्वारा व्यक्त कर रहे हैं (nk) कोशिकाओं और टी के सबसेट कक्षों. कॉपी संख्या कीर लोकस के भीतर प्रदर्शित भिंनता चर जीन सामग्री1के साथ विविध haplotypes रूपों । गैर-विकल्पी समजात पुनर्योजन (nahr), एक करीबी सिर से पूंछ जीन व्यवस्था और उच्च अनुक्रम homology द्वारा सुविधा है, तंत्र के लिए अगुणित परिवर्तनशीलता के लिए जिंमेदार होना प्रस्तावित है । १०० से अधिक विभिंन haplotypes आबादी में रिपोर्ट किया गया है दुनिया भर में1,2,3,4। इन सभी हप्पप्रकारों को दो प्रमुख समूहों में बांटा जा सकता है: ए और बी हैप्लोटाइप । एक haplotype 7 कीर जीन शामिल हैं: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, और KIR3DL2, जो निरोधात्मक कीर जीन हैं, और सक्रिय कीर जीन KIR2DS4. हालांकि, अप करने के लिए ७०% यूरोपीय मूल के व्यक्तियों को जो कर रहे हैं के लिए homozygous कीर haplotype एक विशेष रूप से ले जाने के एक गैर कार्यात्मक “विलोपन” फार्म KIR2DS45,6. अन्य सभी कीर जीन संयोजन के रूप में समूह बी haplotypes, विशिष्ट कीर जीन KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2में से कम एक सहित, और KIR2DL5, और आम तौर पर दो या अधिक सक्रिय कीर जीन शामिल हैं ।
hla वर्ग मैं अणु कुछ निरोधात्मक रिसेप्टर्स (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, और KIR3DL1) के लिए लाइगैंडों के रूप में पहचान की गई है, रिसेप्टर्स को सक्रिय (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, और KIR3DS1), और KIR2DL4के लिए है, जो एक अद्वितीय कीर है कि अंय निरोधात्मक कीर रिसेप्टर्स की तरह एक लंबी कोशिकाद्रव्यी पूंछ शामिल है, लेकिन यह भी extracellular डोमेन के पास एक सकारात्मक आरोप अवशेष है जो एक आम है अन्य सक्रिय कीर रिसेप्टर्स की सुविधा । कीर जीन और hla जीन के भीतर वेरिएंट का संयोजन व्यक्तिगत स्तर7,8पर संभावित nk सेल प्रतिसादिता आकार कि रिसेप्टर संलग्नी बातचीत को प्रभावित करता है । आनुवंशिक एसोसिएशन के अध्ययनों से सबूत संकेत दिया है कि कीर वायरल प्रतिरोध में एक भूमिका निभाताहै (जैसे, मानव इम्यूनो वायरस [एचआईवी]9 और हेपेटाइटिस सी वायरस [hcv]10), प्रत्यारोपण की सफलता 11, गर्भावस्था विकारों और प्रजनन सफलता के जोखिम12,13, allogeneic हेमटोपोइटिक स्टेम सेल ट्रांसप्लांटेशन (hsct) के बाद पतन के खिलाफ संरक्षण14,15, 16, और कैंसर का खतरा17।
उच्च अनुक्रम समजातता और विकल्पी और haplotypic विविधता का संयोजन सही genotyping कीर जीन के कार्य में चुनौतियां प्रस्तुत करता है । कीर जीन टाइप करने के लिए पारंपरिक तरीकों अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमर (एसएसपी) पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)18,19,20, अनुक्रम-विशिष्ट oligonucleotide जांच (ssop) पीसीआर21, और मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर विशोषण ionization-उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री के समय (माल्डी-tof एमएस)22। इन तकनीकों की कमियां है कि वे केवल एक व्यक्ति whilst के जीनोटाइप में भी श्रमसाध्य प्रदर्शन करने के लिए आंशिक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । हाल ही में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (ngs) को विशेष रूप से कीर लोकस टाइप करने के लिए लागू किया गया है । हालांकि यह विधि बहुत शक्तिशाली है, इसे चलाने के लिए महंगा हो सकता है, और यह गहराई से विश्लेषण और डेटा जांच के संचालन के लिए समय लेने वाला है ।
qkat एक उच्च throughput मात्रात्मक पीसीआर विधि है । जबकि परम्परागत पद्धतियां श्रमसाध्य और समय लेने वाली होती हैं, इस विधि से पाँच दिनों में लगभग १,००० जीनोमिक डीएनए (जीडीआई) के नमूनों को चलाना संभव बनाता है और कीर जीणोटाइप देता है, साथ ही जीन की प्रतिलिपि संख्या भी. qkat दस मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रियाओं के होते हैं, जिनमें से प्रत्येक दो कीर loci और एक संदर्भ जीनोम में एक निश्चित प्रतिलिपि संख्या के जीन (STAT6) कीर जीन की प्रतिलिपि संख्या23के सापेक्ष परिमाणन के लिए इस्तेमाल लक्ष्य । इस परख सफलतापूर्वक इस तरह के hcv के रूप में संक्रामक रोगों पर बड़ी आबादी पैनलों और रोग साथियों को शामिल अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है, प्रकार 1 मधुमेह की तरह स्व-प्रतिरक्षित शर्तों, और preeclampsia जैसे गर्भावस्था विकारों, साथ ही एक आनुवंशिक प्रदान nk सेल समारोह1,4,24,25,26को समझने के उद्देश्य से अध्ययन के लिए underpinning ।
हम एक उपंयास अर्द्ध स्वचालित उच्च throughput विधि, qkat कहा जाता है, जो कीर जीन की नकल संख्या टाइपिंग की सुविधा का वर्णन किया। विधि एसएसपी-पीसीआर की तरह पारंपरिक तरीकों पर एक सुधार है, जो कम throughput हैं और केवल उपस्थिति या इन अत्यधिक बहुरूपी जीन की अनुपस्थिति का संकेत कर सकते हैं ।
प्रतिलिपि संख्या डेटा प्राप्त की सटीकता की गुणवत्ता और एकाग्रता-gdna नमूनों की एकरूपता और अभिकर्मकों की गुणवत्ता सहित कई कारकों पर निर्भर है । एक थाली भर में gdna नमूनों की गुणवत्ता और सटीकता बेहद महत्वपूर्ण है क्योंकि थाली में एकाग्रता में बदलाव की प्रतिलिपि संख्या की गणना में त्रुटियों में परिणाम कर सकते हैं । चूंकि assays यूरोपीय मूल नमूना सेट का उपयोग कर मांय किया गया, दुनिया के अंय भागों से समानता रखने वाले डेटा और अधिक गहन जांच की आवश्यकता है । यह सुनिश्चित करना है कि एलील छोड़ने या गैर-विशिष्ट प्राइमर/जांच बाइंडिंग के उदाहरणों की प्रतिलिपि संख्या भिंनता के रूप में गलत व्याख्या न की जाए ।
assays डिजाइन और उच्च throughput के रूप में चलाने के लिए अनुकूलित किया गया है, जबकि वे कम नमूनों को चलाने के लिए संशोधित किया जा सकता है । कम नमूनों का विश्लेषण करते समय प्रति संख्या विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में विश्वास मीट्रिक प्रभावित होती है, लेकिन यह तब सुधारा जा सकता है जब एक ज्ञात कीर जीन प्रति संख्या के साथ नियंत्रण जीनोमिक डीएनए नमूनों को प्लेट पर शामिल किया जाता है और अतिरिक्त नमूना प्रतिकृति शामिल.
बिना तरल/प्लेट-हैंडलिंग रोबोटों के लिए, मास्टर मिक्स को मल्टी-चैनल पिप्ट्स और प्लेटों का उपयोग करके तिरस्कृत किया जा सकता है, जिसे मैन्युअल रूप से qpcr इंस्ट्रूमेंट में लोड किया जा सकता है ।
qkat के विकास के पीछे मुख्य उद्देश्य एक सरल, उच्च थ्रूपुट, उच्च संकल्प, और लागत प्रभावी तरीके से रोग एसोसिएशन के अध्ययन के लिए जीनोटाइप kirs बनाने के लिए बनाया गया था । यह सफलतापूर्वक प्राप्त किया गया था के बाद से qkat कई बड़े रोग एसोसिएशन के अध्ययन में कीर की भूमिका की जांच में कार्यरत किया गया है, संक्रामक रोगों की एक श्रृंखला सहित, स्व-प्रतिरक्षित शर्तों, और गर्भावस्था विकारों4, 24 , 25 , 26.
The authors have nothing to disclose.
परियोजना को चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (ग्रांट एग्रीमेंट नंबर ६९५५५१) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (nih) कैम्ब्रिज के तहत धन प्राप्त हुआ जैव चिकित्सा अनुसंधान केंद्र और nih अनुसंधान रक्त और प्रत्यारोपण अनुसंधान इकाई (nih btru) में अंग दान और प्रत्यारोपण विश्वविद्यालय में कैम्ब्रिज और nhs रक्त और प्रत्यारोपण के साथ साझेदारी में (nhsbt). व्यक्त विचार लेखकों के उन है और जरूरी नहीं कि एनएचएस के उन, nihr, स्वास्थ्य विभाग, या nhsbt हैं ।
REAGENTS | |||
Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
MilliQ water | − | − | − |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
OR | |||
QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
SOFTWARE | |||
Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |