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Genetics

qkat: मात्रात्मक अर्द्ध-हत्यारा सेल immunoglobulin की तरह रिसेप्टर जीन की स्वचालित टाइपिंग

doi: 10.3791/58646 Published: March 6, 2019

Summary

मात्रात्मक हत्यारा सेल इम्युनोग्लोबुलिन की तरह रिसेप्टर (कीर) अर्द्ध स्वचालित टाइपिंग (qkat) एक सरल, उच्च थ्रॉपुट, और लागत प्रभावी तरीका संख्या प्रकार कीर जीन जनसंख्या और रोग एसोसिएशन के अध्ययन में अपने आवेदन के लिए कॉपी करने के लिए है ।

Abstract

हत्यारा सेल इम्युनोग्लोबुलिन की तरह रिसेप्टर्स (kirs) निरोधात्मक और सक्रिय प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स का एक सेट कर रहे हैं, प्राकृतिक हत्यारा (nk) और टी कोशिकाओं, पर जीन के एक बहुरूपी क्लस्टर द्वारा इनकोडिंग गुणसूत्र 19. उनकी सबसे अच्छी विशेषता लाइगैंडों मानव ल्यूकोसाइट antigen (hla) अणुओं है कि प्रमुख हिस्टोसंगतता परिसर के भीतर इनकोडिंग कर रहे हैं (mhc) गुणसूत्र पर लोकस 6. वहां पर्याप्त सबूत है कि वे प्रतिरक्षा, प्रजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और प्रत्यारोपण, यह महत्वपूर्ण तकनीकों है कि उंहें सही जीनोटाइप कर सकते है बनाने के लिए । हालांकि, उच्च अनुक्रम होमोलॉजी, साथ ही विकल्पी और प्रतिलिपि संख्या भिन्नता, यह मुश्किल है कि सही ढंग से और कुशलता से सभी कीर जीन जीनोटाइप कर सकते हैं डिजाइन करने के लिए बनाने के लिए । पारंपरिक तरीकों आमतौर पर प्राप्त डेटा के संकल्प में सीमित कर रहे हैं, throughput, लागत प्रभावशीलता, और समय की स्थापना और प्रयोगों को चलाने के लिए लिया. हम मात्रात्मक कीर अर्ध स्वचालित टाइपिंग (qkat) नामक एक विधि का वर्णन करते हैं, जो एक उच्च-थ्रॉपुट मल्टीप्लेक्स रीयल-टाइम पॉलीमरस चेन रिएक्शन विधि है जो कीर लोकस में सभी जीन के लिए जीन कॉपी संख्या निर्धारित कर सकता है । qkat एक सरल उच्च-थ्रॉपुट विधि है जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन कीर कॉपी संख्या डेटा प्रदान कर सकती है, जिसे आगे चलकर संरचनात्मक रूप से पॉलीमोर्फिक हप्लोटाइप में भिन्नता का अनुमान लगाया जा सकता है जो उन्हें शामिल करता है । यह प्रति संख्या और haplotype डेटा बड़े पैमाने पर रोग संघों, जनसंख्या आनुवंशिकी पर अध्ययन के लिए फायदेमंद हो सकता है, साथ ही साथ अभिव्यक्ति और कीर और hlaके बीच कार्यात्मक बातचीत पर जांच ।

Introduction

मनुष्यों में, खूनी इम्यूनोग्लोबुलिन की तरह रिसेप्टर(कीर) लोकस ल्यूकोसाइट रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स (एलआरसी) के भीतर गुणसूत्र 19 के लंबे हाथ पर मैप किया जाता है । इस लोकस लंबाई में १५० kb के आसपास है और 15 कीर जीन की व्यवस्था सिर से पूंछ भी शामिल है । वर्तमान में ज्ञात कीर loci हैं KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, और दो स्यूडोजीन, KIR2DP1 और KIR3DP1। दो आयामी (2d) और तीन आयामी (3 डी) इम्युनोग्लोबुलिन की तरह डोमेन रिसेप्टर्स के लिए कीर जीन सांकेतिक शब्दों में बदलना कम (एस सक्रिय) या लंबे समय (एल; निरोधात्मक) कोशिकाद्रव्यी पूंछ, जो प्राकृतिक हत्यारा द्वारा व्यक्त कर रहे हैं (nk) कोशिकाओं और टी के सबसेट कक्षों. कॉपी संख्या कीर लोकस के भीतर प्रदर्शित भिंनता चर जीन सामग्री1के साथ विविध haplotypes रूपों । गैर-विकल्पी समजात पुनर्योजन (nahr), एक करीबी सिर से पूंछ जीन व्यवस्था और उच्च अनुक्रम homology द्वारा सुविधा है, तंत्र के लिए अगुणित परिवर्तनशीलता के लिए जिंमेदार होना प्रस्तावित है । १०० से अधिक विभिंन haplotypes आबादी में रिपोर्ट किया गया है दुनिया भर में1,2,3,4। इन सभी हप्पप्रकारों को दो प्रमुख समूहों में बांटा जा सकता है: ए और बी हैप्लोटाइप । एक haplotype 7 कीर जीन शामिल हैं: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, और KIR3DL2, जो निरोधात्मक कीर जीन हैं, और सक्रिय कीर जीन KIR2DS4. हालांकि, अप करने के लिए ७०% यूरोपीय मूल के व्यक्तियों को जो कर रहे हैं के लिए homozygous कीर haplotype एक विशेष रूप से ले जाने के एक गैर कार्यात्मक "विलोपन" फार्म KIR2DS45,6. अन्य सभी कीर जीन संयोजन के रूप में समूह बी haplotypes, विशिष्ट कीर जीन KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2में से कम एक सहित, और KIR2DL5, और आम तौर पर दो या अधिक सक्रिय कीर जीन शामिल हैं ।

hla वर्ग मैं अणु कुछ निरोधात्मक रिसेप्टर्स (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, और KIR3DL1) के लिए लाइगैंडों के रूप में पहचान की गई है, रिसेप्टर्स को सक्रिय (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, और KIR3DS1), और KIR2DL4के लिए है, जो एक अद्वितीय कीर है कि अंय निरोधात्मक कीर रिसेप्टर्स की तरह एक लंबी कोशिकाद्रव्यी पूंछ शामिल है, लेकिन यह भी extracellular डोमेन के पास एक सकारात्मक आरोप अवशेष है जो एक आम है अन्य सक्रिय कीर रिसेप्टर्स की सुविधा । कीर जीन और hla जीन के भीतर वेरिएंट का संयोजन व्यक्तिगत स्तर7,8पर संभावित nk सेल प्रतिसादिता आकार कि रिसेप्टर संलग्नी बातचीत को प्रभावित करता है । आनुवंशिक एसोसिएशन के अध्ययनों से सबूत संकेत दिया है कि कीर वायरल प्रतिरोध में एक भूमिका निभाताहै (जैसे, मानव इम्यूनो वायरस [एचआईवी]9 और हेपेटाइटिस सी वायरस [hcv]10), प्रत्यारोपण की सफलता 11, गर्भावस्था विकारों और प्रजनन सफलता के जोखिम12,13, allogeneic हेमटोपोइटिक स्टेम सेल ट्रांसप्लांटेशन (hsct) के बाद पतन के खिलाफ संरक्षण14,15, 16, और कैंसर का खतरा17

उच्च अनुक्रम समजातता और विकल्पी और haplotypic विविधता का संयोजन सही genotyping कीर जीन के कार्य में चुनौतियां प्रस्तुत करता है । कीर जीन टाइप करने के लिए पारंपरिक तरीकों अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमर (एसएसपी) पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)18,19,20, अनुक्रम-विशिष्ट oligonucleotide जांच (ssop) पीसीआर21, और मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर विशोषण ionization-उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री के समय (माल्डी-tof एमएस)22। इन तकनीकों की कमियां है कि वे केवल एक व्यक्ति whilst के जीनोटाइप में भी श्रमसाध्य प्रदर्शन करने के लिए आंशिक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । हाल ही में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (ngs) को विशेष रूप से कीर लोकस टाइप करने के लिए लागू किया गया है । हालांकि यह विधि बहुत शक्तिशाली है, इसे चलाने के लिए महंगा हो सकता है, और यह गहराई से विश्लेषण और डेटा जांच के संचालन के लिए समय लेने वाला है ।

qkat एक उच्च throughput मात्रात्मक पीसीआर विधि है । जबकि परम्परागत पद्धतियां श्रमसाध्य और समय लेने वाली होती हैं, इस विधि से पाँच दिनों में लगभग १,००० जीनोमिक डीएनए (जीडीआई) के नमूनों को चलाना संभव बनाता है और कीर जीणोटाइप देता है, साथ ही जीन की प्रतिलिपि संख्या भी. qkat दस मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रियाओं के होते हैं, जिनमें से प्रत्येक दो कीर loci और एक संदर्भ जीनोम में एक निश्चित प्रतिलिपि संख्या के जीन (STAT6) कीर जीन की प्रतिलिपि संख्या23के सापेक्ष परिमाणन के लिए इस्तेमाल लक्ष्य । इस परख सफलतापूर्वक इस तरह के hcv के रूप में संक्रामक रोगों पर बड़ी आबादी पैनलों और रोग साथियों को शामिल अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है, प्रकार 1 मधुमेह की तरह स्व-प्रतिरक्षित शर्तों, और preeclampsia जैसे गर्भावस्था विकारों, साथ ही एक आनुवंशिक प्रदान nk सेल समारोह1,4,24,25,26को समझने के उद्देश्य से अध्ययन के लिए underpinning ।

Protocol

1. तैयारी और डीएनए के बाहर चढ़ाना

  1. सही ढंग से एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक या फ्लोरोमेट्रिक उपकरण का उपयोग कर gdna एकाग्रता यों तो.
  2. ९६-अच्छी तरह से डीप-वेल प्लेट पर 4 एनजी/μl को डीएनए को पतला करें । एक ज्ञात प्रतिलिपि संख्या और एक गैर-टेंपलेट नियंत्रण के साथ कम से कम एक नियंत्रण gdna नमूना शामिल है ।
  3. ९६-अच्छी तरह से 2 मिनट के लिए ४५० एक्स जी पर प्लेटों centrifuge ।
  4. एक तरल हैंडलिंग साधन का उपयोग करना, प्रत्येक नमूने को ३८४ पर चौगुना कर दिया जाता है-अच्छी तरह से क्यूपीसीआर प्लेटें ताकि हर अच्छी तरह से डीएनए के 10 एनजी (२.५ μl/ प्रत्येक qkat प्रतिक्रिया के लिए एक अच्छी तरह से १० ३८४-खैर प्लेटें, एक तैयार करें ।
  5. यदि gdna से अधिक १ ९६ से तिरस्कृत किया जा रहा है-अच्छी थाली, 2% ब्लीच और ultrapure पानी के साथ एक पूर्ण मात्रा धोने प्रदर्शन करने के लिए प्रत्येक ९६-gdna नमूनों की अच्छी तरह थाली के बीच तरल हैंडलिंग प्रणाली की सुई साफ ।
  6. वायु-शुष्क डीएनए को एक साफ क्षेत्र में ३८४-अच्छी तरह से प्लेटों को न्यूनतम 24 ज के लिए कमरे के तापमान पर ।

2. प्राइमर्स और जांच की तैयारी

नोट: qkat दस मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रियाओं के होते हैं । प्रत्येक प्रतिक्रिया तीन प्राइमर जोड़े और तीन प्रतिदीप्ति-लेबल जांच शामिल है कि विशेष रूप से दो कीर जीन और एक संदर्भ जीन बढ़ाना । जांच है कि जियांग एट अल.27 में प्रकाशित किया गया तो संशोधित किया गया है कि oligonucleotides अब atto रंजक के साथ लेबल के बाद से वे बेहतर photostability और लंबे समय संकेत जंमे की पेशकश कर रहे हैं । प्री-एलिकोटेड प्राइमर युग्म व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ( सामग्री तालिकादेखें) ।

  1. तालिका 1में दिए गए dilutions के अनुसार प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए प्राइमर संयोजन तैयार करें ।
  2. 1 तालिकाके अनुसार प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए जांच संयोजन तैयार करें । संयोजन बनाने से पहले प्रत्येक व्यक्ति की जांच का परीक्षण करें ।

3. मास्टर मिक्स की तैयारी

ध्यान दें नीचे उल्लेख किया संस्करणों 10x ३८४-अच्छी तरह से प्लेटों के एक सेट पर एक qkat प्रतिक्रिया प्रदर्शन के लिए कर रहे हैं ।

  1. सुनिश्चित करें कि gdna ३८४ पर चढ़ाया नमूने-खैर प्लेटों पूरी तरह से शुष्क हैं । बर्फ पर सभी चरणों का संचालन और के रूप में अधिक से अधिक के रूप में संभव के रूप में प्रकाश के लिए जोखिम से कवर अभिकर्मकों रखने के बाद से प्रतिदीप्ति-लेबल जांच फोटो और थर्मो संवेदनशील हैं ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर क्यूपीसीआर बफर, प्राइमर, और जांच aliquots defrost ।
  3. बर्फ पर, 10x ३८४ के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार-अच्छी तरह से प्लेटों को जोड़कर १८.८६ मिलीलीटर ultrapure पानी, 20 मिलीलीटर qpcr बफर, preprepared प्राइमरी संयोजन के १,००० μl, और preprepared जांच संयोजन के १८० μl (तालिका 2).
  4. एक ९६-गहरी अच्छी तरह से एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग कर थाली, एक अच्छी तरह से में ४१५ μl pipette के पार मास्टर मिक्स समान रूप से वितरित । इस प्लेट को हल्के से ढक कर एक आइस बॉक्स में रखें ।
  5. एक तरल हैंडलिंग साधन का उपयोग कर, सूखे gdna के साथ ३८४-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में मास्टर मिश्रण के ९.५ μl वितरण । एक पन्नी के साथ प्लेट को सील करें और तुरंत इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर लगाएं । शेष प्लेटों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं, यह सुनिश्चित करना कि तरल हैंडलिंग प्रणाली की सुई प्रत्येक थाली के बीच पानी से धोया जाता है ।
  6. ३८४-अच्छी तरह से 3 मिनट के लिए ४५० एक्स जी पर प्लेटें और उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते या 6-12 एच के बीच डीएनए resuspend के लिए और किसी भी हवाई बुलबुले फैलने ।

4. क्यूपीसीआर परख

  1. रात में ऊष्मायन के बाद, किसी भी शेष हवा के बुलबुले को नष्ट करने के लिए 3 मिनट के लिए ४५० एक्स जी पर अपकेंद्रिप ।
  2. स्वचालन के प्रयोजनों के लिए, qpcr मशीन कनेक्ट (उदाहरण के लिए, lightcycler ४८०) एक microplate हैंडलर के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें). कार्यक्रम microplate हेंडलर एक ठंडा भंडारण गोदी है कि प्रकाश से संरक्षित है से qpcr मशीन में प्लेटों जगह है ।
    नोट assays सिद्धांत में, संगत ऑप्टिक सेटिंग्स के साथ अंय qpcr मशीनों पर काम करना चाहिए ।
  3. निम्नलिखित सायक्लिंग शर्तों का उपयोग करें: ९५ ° c 5 min के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस के ४० चक्र के बाद के लिए 15 s और ६६ ° c ५० s के लिए, ६६ डिग्री सेल्सियस पर डेटा संग्रह के साथ.
  4. एक बार चलाने पूरा हो गया है, रोबोट qpcr मशीन से थाली इकट्ठा और छंटे गोदी में जगह है ।

5. पोस्ट-रन विश्लेषण

  1. प्रवर्धन के बाद, परिमाणन चक्र (cq) या तो दूसरा व्युत्पन्न अधिकतम विधि या qpcr मशीन के सॉफ्टवेयर के साथ फिट अंक विधि का उपयोग कर मूल्यों की गणना ( सामग्री की तालिकादेखें), नीचे दिए गए चरणों का पालन.
  2. qpcr सॉफ़्टवेयर खोलें और, नेविगेटर टैब में, एक प्लेट के लिए सहेजी गई प्रतिक्रिया प्रयोग फ़ाइल खोलें ।
  3. दूसरी व्युत्पंन अधिकतम विधि का उपयोग कर विश्लेषण के लिए, विश्लेषण टैब का चयन करें, और एक नए Abs quant का उपयोग कर विश्लेषण बनाने/
    1. नया विश्लेषण बनाएँ विंडो में, विश्लेषण प्रकार का चयन करें : Abs quant/दूसरा व्युत्पन्न अधिकतम विधि, सबसेट: सभी नमूने, प्रोग्राम: प्रवर्धन, नाम: Rx-dfo (जहां एक्स प्रतिक्रिया संख्या है).
    2. फ़िल्टर कंघी का चयन करें और VIC/हेक्स/Yellow555 (533-580)चुनें । यह सुनिश्चित करता है कि STAT6 के लिए एकत्रित डेटा चयनित है ।
    3. विक/हेक्स/Yellow555 (533-580)के लिए रंग क्षतिपूर्ति का चयन करें । परिकलितकरेंक्लिक करें । इस के लिए दोहराएं Fam (465-510) and Cy5/cy 5.5 (618-660) । फ़ाइल सहेजेंक्लिककरें ।
  4. फिट अंक विधि का उपयोग कर विश्लेषण के लिए, विश्लेषण टैब में Abs quant/फिट अंक का चयन करें ।
    1. नया विश्लेषण बनाएँ विंडो में, विश्लेषण प्रकार का चयन करें : Abs quant/फ़िट अंक विधि, सबसेट: सभी नमूने, प्रोग्राम: प्रवर्धन, नाम: rxf-dfo (जहाँ x प्रतिक्रिया संख्या है) ।
    2. सही फिल्टर और STAT6 के लिए रंग मलता है और प्रत्येक कीर जीन (Fam/Cy5) का चयन करें । noiseband टैब में, पृष्ठभूमि शोर को छोड़ने के लिए शोर बैंड सेट करें.
    3. विश्लेषण टैब में, फ़िट बिंदु को 3 पर सेट करें और फ़िट बिंदु दिखाएँका चयन करते हैं. परिकलितकरेंक्लिक करें । फ़ाइल सहेजेंक्लिककरें ।

6. परिणामों का निर्यात

  1. qpcr सॉफ़्टवेयर में, खोलें नेविगेटर टैब का चयन करें परिणाम बैच निर्यात
  2. वह फ़ोल्डर खोलें जिसमें प्रयोग फ़ाइलें सहेजी जाती है और फ़ाइलों को विंडो के दाईं ओर अनुभाग में स्थानांतरित करें । अगलाक्लिककरें । नाम और निर्यात फ़ाइल का स्थान का चयन करें ।
  3. विश्लेषण प्रकार abs quant/दूसरा व्युत्पन्न अधिकतम विधि या abs quant/फिट अंकका चयन करें । अगलाक्लिककरें । जांचें कि फ़ाइल का नाम, निर्यात फ़ोल्डर, और विश्लेषण प्रकार सही है और निर्यात प्रक्रिया प्रारंभ करने के लिए अगला क्लिक करें ।
  4. निर्यात स्थिति ठीकहै जब तक प्रतीक्षा करें । स्क्रीन स्वचालित रूप से अगले चरण पर ले जाएगा । जांचें कि सभी चयनित फ़ाइलें सफलतापूर्वक निर्यात की गई है ताकि फ़ाइलों की संख्या विफल रही = 0 । पूर्णक्लिक करें ।
  5. का प्रयोग करें लिपियों split_file. pl और roche2sds.pl प्रत्येक थाली के लिए व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं में निर्यात प्लेटों विभाजित करने के लिए ।
    नोट स्क्रिप्ट पर अनुरोध/github प्रदान किए जाते हैं ।

7. कॉपी संख्या गणना

  1. प्रति संख्या विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें (उदा., copycaller). रीयल-टाइम PCR परिणाम फ़ाइल आयात करें और roche2sds.plद्वारा बनाई गई पाठ फ़ाइलों को लोड करेंका चयन करे ।
  2. विश्लेषण का चयन करें और या तो ज्ञात प्रतिलिपि संख्या के साथ अंशनित्र नमूने का चयन करके या सबसे अधिक बार प्रतिलिपि संख्याका चयन करके analysis आचरण. विशेष रूप से यूरोपीय मूल की आबादी में देखा कीर जीन की सबसे लगातार प्रतिलिपि संख्या के लिए तालिका 5 देखें ।

8. डेटा गुणवत्ता की जांच

  1. R स्क्रिप्ट KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215 का उपयोग करें । R एक स्प्रेडशीट में सभी प्लेटों से कॉपी संख्या डेटा गठबंधन करने के लिए ।
    नोट स्क्रिप्ट पर अनुरोध/github प्रदान किए जाते हैं ।
  2. उन नमूनों के लिए प्रतिलिपि संख्या विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पर अपुष्ट डेटा की पुन: जांच करें जो ज्ञात लिंकेज असंतुलन (LD) के लिए कीर जीन (तालिका 6) के अनुरूप नहीं हैं ।

Representative Results

प्रतिलिपि संख्या विश्लेषण की प्रतिलिपि संख्या विश्लेषण सॉफ्टवेयर है, जो की भविष्यवाणी की है और अनुमानित प्रतिलिपि की संख्या प्रदान करता है के लिए फ़ाइलों को निर्यात द्वारा किया जा सकता है के आधार पर δ δ cq विधि ।

कॉपी संख्या या तो प्लेट पर नियंत्रण डीएनए नमूनों की ज्ञात प्रति संख्या के आधार पर या सबसे अक्सर जीन की नकल संख्या (तालिका 5) inputting द्वारा भविष्यवाणी की जा सकती है । चित्रा 1 एक प्रतिक्रिया है कि लक्ष्य KIR2DL4 और KIR3DS1, साथ ही संदर्भ जीन STAT6 के लिए एक थाली के परिणाम से पता चलता है KIR2DL4 के लिए सबसे लगातार प्रतिलिपि संख्या, कीर locus में एक रूपरेखा जीन, दो प्रतियां है, जबकि KIR3DS1के लिए सबसे लगातार प्रतिलिपि संख्या, एक सक्रिय जीन, एक प्रतिलिपि है । आंकड़ा में परिणाम qpcr सॉफ्टवेयर और qpcr डेटा से उत्पन्न कॉपी संख्या डेटा पर मनाया पीसीआर प्रवर्धन भूखंडों दिखा । के रूप में दिखाया गया है, परख के बीच अंतर करने में सक्षम है 0, 1, 2, 3, और 4 कीर जीन की नकल संख्या । कॉपी संख्या विश्लेषण सॉफ्टवेयर भी एक पाई चार्ट या एक बार ग्राफ के रूप में थाली भर में कॉपी संख्या के वितरण के एक देखने के लिए सक्षम बनाता है । प्रति संख्या भविष्यवाणी की प्रभावकारिता एक उच्च प्रतिलिपि संख्या के साथ नमूनों के लिए कम है.

प्रतिक्रियाओं, gdna, बफर, primers, और जांच में इस्तेमाल सभी सामग्रियों की गुणवत्ता, प्राप्त परिणामों की सटीकता को प्रभावित कर सकते हैं । हालांकि, परिणामों में कलह सबसे अधिक एक थाली भर में डीएनए की एकाग्रता में भिन्नता के कारण होने की संभावना है. निकाला gdna की शुद्धता, जो 260/280 और 260/230 अनुपात का उपयोग कर मापा जा सकता है, भी गुणवत्ता पर एक प्रभाव हो सकता है. १.८-2 का 260/280 अनुपात तथा 2-२.२ का 260/230 अनुपात वांछनीय है । एक थाली भर में डीएनए सांद्रता की एक असमान रेंज दहलीज चक्र में एक उच्च परिवर्तनशीलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं (सीटी) नमूनों और बेअडांस के बीच अनुमानित प्रतिलिपि संख्या की सीमा में. चित्रा 2 में परिणाम प्रभाव एक थाली भर सीटी मूल्यों के बीच असमानता की नकल संख्या की भविष्यवाणी में सटीकता पर हो सकता है दिखाने के लिए । लाल रेखा किसी नमूने के लिए अनुमानित प्रतिलिपि संख्या की श्रेणी को इंगित करती है और, आदर्श रूप से, यथासंभव पूर्णांक के करीब होनी चाहिए ।

प्रतिलिपि संख्या डेटा, एक बार विश्लेषण, एक ९६-well प्रारूप में एक स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जा सकता है । हम एक एक स्प्रेडशीट में एक सेट के रूप में चला रहे हैं कि सभी 10 प्लेटों की प्रतिलिपि संख्या डेटा गठबंधन करने के लिए एक R स्क्रिप्ट (अनुरोध पर उपलब्ध) का इस्तेमाल किया. ज्यादातर यूरोपीय मूल आबादी से kirs के बारे में प्रकाशित डेटा LD नियम है कि कीर परिसर1में विभिंन जीन के बीच मौजूद की भविष्यवाणी में सक्षम बनाता है । इन भविष्यवाणियों की प्रतिलिपि संख्या परिणाम प्राप्त (तालिका 6) पर डाउनस्ट्रीम जाँच का संचालन करने के लिए उपयोग किया जाता है । नमूने जो जीन के बीच पूर्वानुमानित एलडी के अनुरूप नहीं हैं, उनमें असामान्य बहुरूपता या अगुणित संरचनात्मक विविधताएं हो सकती हैं । चित्र 3में प्रोटोकॉल का वर्णन करने वाला एक फ़्लोचार्ट दिखाया गया है ।

एक उपकरण कीर haplotype पहचानकर्ता (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) बुलाया डेटा सेट से haplotype की आरोपण की सुविधा के लिए विकसित किया गया था । आरोपण एक यूरोपीय मूल जनसंख्या1में मनाया संदर्भ haplotypes की एक सूची के आधार पर काम करता है । हालांकि, उपकरण भी संदर्भ haplotypes के बजाय उपयोग किया जा करने के लिए कस्टम सेट के लिए अनुमति देता है । तीन अलग फ़ाइलें उत्पंन कर रहे हैं; पहली फ़ाइल एक नमूने के लिए सभी haplotype संयोजनों को सूची बद्ध करता है, दूसरी फ़ाइल उच्चतम संयुक्त आवृत्तियों है haplotype संयोजनों की एक छंटनी की सूची उपलब्ध कराता है, और तीसरी फ़ाइल नमूने जो haplotype असाइन नहीं किया जा सकता सूचीबद्ध करता है । अलोपप्रकारों के गैर-असाइनमेंट को उपन्यास हप्लोटाइप के संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिक्रिया संख्या 5 के लिए एक थाली के प्रतिनिधि परिणाम. () यह पैनल प्रवर्धन भूखंड दिखाता है । () यह फलक प्रति संख्या भूखंड दिखाता है । () यह पैनल प्रति संख्या वितरण दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिक्रिया संख्या 5 के लिए एक चर डीएनए एकाग्रता के साथ एक थाली के प्रतिनिधि परिणाम. () यह पैनल प्रवर्धन भूखंड दिखाता है । () यह फलक प्रति संख्या भूखंड दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: qkat प्रोटोकॉल का फ़्लोचार्ट. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

परख जीन अग्रवर्ती प्राइमर्स एकाग्रता (एनएम) रिवर्स प्राइमर्स एकाग्रता (एनएम) जांच एकाग्रता (एनएम)
कोई 1 3dp1 A4F २५० A5R २५० P4a १५०
2dl2 2dl2f4 ४०० C3R2 ६०० P5b १५०
STAT6 STAT6F २०० STAT6R २०० PSTAT6 १५०
No 2 2ds2 A4F ४०० A6R ४०० P4a २००
2dl3 D1F ४०० D1R ४०० पी9 १५०
STAT6 STAT6F २०० STAT6R २०० PSTAT6 १५०
No 3 3dl3 A8F ५०० A8R ५०० P4a १५०
2ds4del 2ds4del २५० 2ds4r2 २५० P5b १५०
STAT6 STAT6F २०० STAT6R २०० PSTAT6 १५०
No 4 3dl1e4 B1F २५० B1R १२५ P4b १५०
3dl1e9 D4F २५० D4R2 ५०० पी9 १५०
STAT6 STAT6F २०० STAT6R २०० PSTAT6 १५०
कोई 5 3ds1 B2F २५० B1R २५० P4b १५०
2dl4 C1F २०० C1R २०० P5b-2dl4 १५०
STAT6 STAT6F २०० STAT6R २०० PSTAT6 १५०
No 6 2dl1 B3F ५०० B3R १२५ P4b १५०
2dp1 D3F २५० D3R ५०० पी9 १५०
STAT6 STAT6F २०० STAT6R २०० PSTAT6 १५०
न 7 2ds1 B4F ५०० B4R २५० P4b १५०
2dl5 D2F ५०० D2R ५०० पी9 १५०
STAT6 STAT6F २०० STAT6R २०० PSTAT6 १५०
No 8 2ds3 B5F २५० B5R २५० P4b १५०
3dl2e9 D4F २५० D5R १२५ पी9 १५०
STAT6 STAT6F २०० STAT6R २०० PSTAT6 १५०
No 9 3dl2e4 A1F २०० A1R २०० P4a १५०
2ds4fl 2ds4fl २५० 2ds4r2 ५०० P5b १५०
STAT6 STAT6F २०० STAT6R २०० PSTAT6 १५०
No 10 2ds5 B6F2 २०० B6R3 २०० P4b १५०
2ds4 C5F २५० C5R २५० P5b १५०
STAT6 STAT6F २०० STAT6R २०० PSTAT6 १५०

तालिका 1: प्रत्येक qkat प्रतिक्रिया में उपयोग किए गए प्राइमर्स और जांच की संयोजन और एकाग्रता 27 .

प्रतिक्रिया प्राइमरी एलिकोट्स (μl) प्रोब aliquots (μl)
R1 3dp1 A4F A5R 2dl2f4 C3R2 पानी STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2dl2 १०० १०० १६० २४० २०० ८० ८० ६० ६० ६०
R2 2ds2 A2F A6R D1F D1R पानी STAT6F STAT6R P4A पी9 PSTAT6
2dl3 १६० १६० १६० १६० १६० ८० ८० ८० ६० ६०
नोट: mastermix में 20 μl कम पानी की आवश्यकता
R3 3dl3 A8F A8FB F85 2ds4delf 2ds4r2 पानी STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2ds4del १०० १०० २०० १०० १०० २०० ८० ८० ६० ६० ६०
R4 3dl1e4 B1F B1R D4F D4R2 पानी STAT6F STAT6R P4B पी9 PSTAT6
3dl1e9 १०० ५० १०० २०० ३५० ८० ८० ६० ६० ६०
R5 3ds1 B2F B1R C1F C1R पानी STAT6F STAT6R P4B P5B-2l4 PSTAT6
2dl4 १०० १०० ८० ८० ४४० ८० ८० ६० ६० ६०
R6 2dl1 B3F B3R D3F D3R पानी STAT6F STAT6R P4B पी9 PSTAT6
2dp1 २०० ५० १०० २०० २५० ८० ८० ६० ६० ६०
R7 2ds1 B4F B4R D2F D2R पानी STAT6F STAT6R P4B पी9 PSTAT6
2dl5 २०० १०० २०० २०० १०० ८० ८० ६० ६० ६०
R8 2ds3 B5F B5R D4F D5R पानी STAT6F STAT6R P4B पी9 PSTAT6
3dl2e9 १०० १०० १०० ५० ४५० ८० ८० ६० ६० ६०
R9 3dl2e4 A1F A1R 2ds4wtf 2ds4r2 पानी STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2ds4wt ८० ८० १०० २०० ३४० ८० ८० ६० ६० ६०
R10 2ds5 B6F2 B6R3 C5F C5R पानी STAT6F STAT6R P4B P5B PSTAT6
2ds4total ८० ८० १०० १०० ४४० ८० ८० ६० ६० ६०

तालिका 2: खंड (μl) की १०० μm प्राइमर/जांच स्टॉक समाधान प्राइमर और जांच संयोजन aliquots बनाने के लिए ।

नाम दिशा 5 ́ संशोधन 3 ́ संशोधन अनुक्रम (5 ' → 3 ') लंबाई Tm जीसी एक्सॉन स्थिति
P4a भावना Fam bhq-1 tcatcctgc
aatgttggt
cagatgtca
27 ६० ४४.४ 4 425-451
P4b Antisense Fam bhq-1 aacagaacc
gtagcatct
gtaggtccc
टी
28 ६२ ५० 4 576-603
P5b भावना ATTO647N bhq-2 aacattcca
ggccgact
ttcctctg
25 ६० ५२ 5 828-852
P5b-2dl4 भावना ATTO647N bhq-2 aacattcca
ggccgact
tccctctg
25 ६१ ५६ 5 828-852
पी9 भावना ATTO647N bhq-2 cccttctca
gaggccca
agacacc
24 ६० ६२.५ 9 1246-1269
PSTAT6 ATTO550 bhq-2 ctgattcct
ccatgagca
tgcagctt
26 ६२ ५०

सारणी 3: qkat में प्रयुक्त जांच की सूची 1, 27. oligo जांच P5b, P5b-2dl4, P9 के 5 ' अंत में इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट रंजक, और PSTAT6 atto रंजक करने के लिए संशोधित किया गया ।

जीन प्राइमरों दिशा अनुक्रम (5 ́-3 ́) लंबाई Tm जीसी एक्सॉन स्थिति amplicon (बीपी) एललेस याद किया जा सकता है
3dl2e4 A1F आगे gcccctgctgaa
एकैग
18 ५२ ६१.१ 4 399-416 १७९ 3dl2 * 008, * 021, * 027, * ०३८ ।
A1R उल्टा ctgcaaggacag
gcatcaa
19 ५३ ५२.६ 559-577 3dl2 * 048
3dp1 A4F आगे gtcccctggtga
आतचग
19 ४९ ५२.६ 4 398-416 ११२ कोई नहीं
A5R उल्टा gtgaggcgcaaa
gtgtca
18 ५२ ५५.६ 492-509 कोई नहीं
2ds2 A2F आगे gtcgcctggtga
आतचग
19 ४९ ५२.६ 4 398-416 १११ कोई नहीं
A6R उल्टा tgaggtgcaaag
tgtccttat
21 ५१ ४२.९ 488-508 कोई नहीं
3dl3 A8Fa आगे gtgaaatcggga
gagacg
18 ५० ५५.६ 4 406-423 १३९ कोई नहीं
A8Fb आगे ggtgaaatcagg
agagacg
19 ५० ५२.६ 405-423 3dl3 * 054, 3dl3 * 00905.
F85 उल्टा agttgacctggg
aacccg
18 ५१ ६१.१ 526-543 कोई नहीं
3dl1e4 B1F आगे catcggtcccat
gatgct
18 ५१ ५५.६ 4 549-566 ८५ 3dl1 * 00505, 3dl1 * 006, 3dl1 * 054, 3dl1 * 086, 3dl1 * 089
B1R उल्टा gggagctgacaa
ctgatagg
20 ५२ ५५ 614-633 3dl1 * 00502
3ds1 B2F आगे catcggttccat
gatgcg
18 ५१ ५५.६ 4 549-566 ८५ 3ds1 * 047; 3dl1 * 054 उठा सकते हैं ।
B1R उल्टा gggagctgacaa
ctgatagg
20 ५२ ५५ 614-633 कोई नहीं
2dl1 B3F आगे ttctccatcagt
cgcatgac
20 ५२ ५० 4 544-563 ९६ 2dl1 * 020, 2dl1 * 028
B3R उल्टा gtcactgggagc
tgacac
18 ५० ६१.१ 622-639 2dl1 * 023, 2dl1 * 029, 2dl1 * 030
2ds1 B4F आगे tctccatcagtc
gcatgaa
19 ५१ ४७.४ 4 545-563 ९६ 2ds1 * 001
B4R उल्टा ggtcactgggag
ctgac
17 ४९ ६४.७ 624-640 कोई नहीं
2ds3 B5F आगे ctccatcggtcg
catgag
18 ५३ ६१.१ 4 546-563 ९६ कोई नहीं
B5R उल्टा gggtcactggga
gctgaa
18 ५१ ६१.१ 624-641 कोई नहीं
2ds5 B6F2 आगे agagaggggacg
tttaacc
19 ५० ५२.६ 4 475-493 १७३ कोई नहीं
B6R3 उल्टा tccagggtca
ctgggc
18 ५३ ६६.७ 630-647 2ds5 * 003
2dl4 C1F आगे gcagtgcccagc
atcaat
18 ५२ ५५.६ 5 808-825 ८३ कोई नहीं
C1R उल्टा ccgaagcatctg
taggtct
19 ५२ ५२.६ 872-890 2dl4 * 018, 2dl4 * 019
2dl2 2dl2f4 आगे gaggtggaggcc
catgaat
19 ५२ ५७.९ 5 778-796 १५१ 2dl2 * 009; 782g ए को बदल दिया.
C3R2 उल्टा tcgagtttgacc
actcgtat
20 ५१ ४५ 909-928 कोई नहीं
2ds4 C5F आगे tccctgcagtgc
gcagc
17 ५७ ७०.६ 5 803-819 १२० कोई नहीं
C5R उल्टा ttgaccactcgt
agggagc
19 ५२ ५७.९ 904-922 2ds4 * 013
2ds4del 2ds4del आगे ccttgtcctgca
gctccat
19 ५४ ५७.९ 5 750-768 २०३ कोई नहीं
2ds4r2 उल्टा tgacgaacaa
gcagtgga
20 ५३ ५० 933-952 कोई नहीं
2ds4fl 2ds4fl आगे ccggagctccta
tgacatg
19 ५३ ५७.९ 5 744-762 00 कोई नहीं
2ds4r2 उल्टा tgacgaacaa
gcagtgga
20 ५३ ५० 933-952 कोई नहीं
2dl3 D1F आगे agaccctcagga
ggtga
17 ४८ ५८.८ 9 1180-1196 १५६ कोई नहीं
D1R उल्टा कागगैगाएक्ट
ttggatca
20 ५० ४५ 1316-1335 2dl3 * 010, 2dl3 * 017, 2dl3 * 01801 और 2dl3 * 01802
2dl5 D2F आगे cactgcgttttc
acacagac
20 ५२ ५० 9 1214-1233 १२० 2dl5b * 011 और 2dl5b * 020
D2R उल्टा ggcaggagacaa
tgatctt
19 ४९ ४७.४ 1315-1333 कोई नहीं
2dp1 D3F आगे cctcaggaggtg
acatacgt
20 ५३ ५५ 9 1184-1203 १२१ कोई नहीं
D3R उल्टा ttggaagttccg
tgtacact
20 ५० ४५ 1285-1304 कोई नहीं
3dl1e9 D4F आगे cacagttggatc
actgcgt
19 ५२ ५२.६ 9 1203-1221 ९३ 3dl1 * 061 में दर्ज की गई, 3dl1 * 068
D4R2 उल्टा ccgtgtacaaga
tggtatctgta
23 ५३ ४३.५ 1273-1295 3dl1 * 05901, 3dl1 * 05902, 3dl1 * 060, 3dl1 * 061 में दर्ज की, 3dl1 * 064, 3dl1 * 065, 3dl1 * 094n, 3dl1 * 098
3dl2e9 D4F आगे cacagttggatc
actgcgt
19 ५२ ५२.६ 9 1203-1221 १५६ कोई नहीं
D5R उल्टा gacctgactgtg
gtgctcg
19 ५४ ६३.२ 1340-1358 कोई नहीं
STAT6 STAT6F आगे ccagatgcctac
catggtgc
20 ५४ ६० १२९
STAT6R उल्टा ccatctgcacag
accactcc
20 ५४ ६०

तालिका 4: qkat में इस्तेमाल किया प्राइमरों का जुगाड़ 1, 27.

कीर जीन 3dl3 2ds2 2dl2 2dl3 2dp1 2dl1 3dp1 2dl4 3dl1
EX9
3dl1
EX9
3ds1 2dl5 2ds3 2ds5 2ds1 2ds4
कुल
2ds4
Fl
2ds4
डेल
3dl2
ex4
3dl2
EX9
सबसे लगातार प्रतिलिपि संख्या 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2

तालिका 5: के लिए सबसे लगातार प्रतिलिपि संख्या कीर सामान्यतः यूरोपीय मूल के नमूनों में जीन देखे जाते हैं ।

संबंध-असंतुलन यूरोपीय आबादी के आधार पर qkat के लिए नियम प्रतिलिपि संख्या की जांच करें
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 और KIR3DL2 दोनों हप्पप्रकारों पर फ्रेमवर्क जीन मौजूद हैं । KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 और KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 और KIR2DL2 एक दूसरे के साथ LD में हैं 2ds2=2ds2
3 KIR2DL2 और KIR2DL3 एक ही जीन के एललेस हैं 2dl2+2dl2= 2
4 KIR2DP1 और KIR2DL1 एक दूसरे के साथ LD में हैं 2dp1=2dl1
5 एक्सॉन 4 KIR3DL1 और KIR3DL2 के एक्सॉन 9 के बराबर है KIR3DL1 और KIR3DL2 के क्रमशः । 3dl1ex4 =3dl1ex4 और 3dl1ex4=3dl1ex4
6 KIR3DL1 और KIR3DS1 हैं एललेस 3dl1+3dl1= 2
7 KIR2DS3 और KIR2DS5 के साथ LD में हैं KIR2DL5 2ds3+2ds3=2ds3
8 KIR3DS1 और KIR2DS1 LD में हैं 3ds1=2ds1
9 KIR2DS1 और KIR2DS4Tओतल की उपस्थिति एक haplotype पर परस्पर अनंय है 2ds1+2ds4total= 2
10 KIR2DS4FL और KIR2DS4del के वेरिएंट हैं KIR2DS4TOTAL 2ds4fl +2ds4fl=2ds4fl

तालिका 6: लिंकेज के बीच असंतुलन कीर यूरोपीय मूल की आबादी में सामान्यतः देखे जाने वाले जीन की कॉपी संख्या डेटा की जांच करने के लिए उपयोग की जा सकती है 1,27.

Discussion

हम एक उपंयास अर्द्ध स्वचालित उच्च throughput विधि, qkat कहा जाता है, जो कीर जीन की नकल संख्या टाइपिंग की सुविधा का वर्णन किया विधि एसएसपी-पीसीआर की तरह पारंपरिक तरीकों पर एक सुधार है, जो कम throughput हैं और केवल उपस्थिति या इन अत्यधिक बहुरूपी जीन की अनुपस्थिति का संकेत कर सकते हैं ।

प्रतिलिपि संख्या डेटा प्राप्त की सटीकता की गुणवत्ता और एकाग्रता-gdna नमूनों की एकरूपता और अभिकर्मकों की गुणवत्ता सहित कई कारकों पर निर्भर है । एक थाली भर में gdna नमूनों की गुणवत्ता और सटीकता बेहद महत्वपूर्ण है क्योंकि थाली में एकाग्रता में बदलाव की प्रतिलिपि संख्या की गणना में त्रुटियों में परिणाम कर सकते हैं । चूंकि assays यूरोपीय मूल नमूना सेट का उपयोग कर मांय किया गया, दुनिया के अंय भागों से समानता रखने वाले डेटा और अधिक गहन जांच की आवश्यकता है । यह सुनिश्चित करना है कि एलील छोड़ने या गैर-विशिष्ट प्राइमर/जांच बाइंडिंग के उदाहरणों की प्रतिलिपि संख्या भिंनता के रूप में गलत व्याख्या न की जाए ।

assays डिजाइन और उच्च throughput के रूप में चलाने के लिए अनुकूलित किया गया है, जबकि वे कम नमूनों को चलाने के लिए संशोधित किया जा सकता है । कम नमूनों का विश्लेषण करते समय प्रति संख्या विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में विश्वास मीट्रिक प्रभावित होती है, लेकिन यह तब सुधारा जा सकता है जब एक ज्ञात कीर जीन प्रति संख्या के साथ नियंत्रण जीनोमिक डीएनए नमूनों को प्लेट पर शामिल किया जाता है और अतिरिक्त नमूना प्रतिकृति शामिल.

बिना तरल/प्लेट-हैंडलिंग रोबोटों के लिए, मास्टर मिक्स को मल्टी-चैनल पिप्ट्स और प्लेटों का उपयोग करके तिरस्कृत किया जा सकता है, जिसे मैन्युअल रूप से qpcr इंस्ट्रूमेंट में लोड किया जा सकता है ।

qkat के विकास के पीछे मुख्य उद्देश्य एक सरल, उच्च थ्रूपुट, उच्च संकल्प, और लागत प्रभावी तरीके से रोग एसोसिएशन के अध्ययन के लिए जीनोटाइप kirs बनाने के लिए बनाया गया था । यह सफलतापूर्वक प्राप्त किया गया था के बाद से qkat कई बड़े रोग एसोसिएशन के अध्ययन में कीर की भूमिका की जांच में कार्यरत किया गया है, संक्रामक रोगों की एक श्रृंखला सहित, स्व-प्रतिरक्षित शर्तों, और गर्भावस्था विकारों4, 24 , 25 , 26.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

परियोजना को चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (ग्रांट एग्रीमेंट नंबर ६९५५५१) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (nih) कैम्ब्रिज के तहत धन प्राप्त हुआ जैव चिकित्सा अनुसंधान केंद्र और nih अनुसंधान रक्त और प्रत्यारोपण अनुसंधान इकाई (nih btru) में अंग दान और प्रत्यारोपण विश्वविद्यालय में कैम्ब्रिज और nhs रक्त और प्रत्यारोपण के साथ साझेदारी में (nhsbt). व्यक्त विचार लेखकों के उन है और जरूरी नहीं कि एनएचएस के उन, nihr, स्वास्थ्य विभाग, या nhsbt हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Oligonucleotides Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit Bioline BIO-86020
MilliQ water
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor Eppendorf(or equivalent) Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000
OR
QuBit Fluorometer Life Technologies Q33216
Matrix Hydra Thermo Scientific 109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well Roche 05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) Caliper Life Sciences 204135
Vortex mixer Biosan BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) Gilson(or equivalent) F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) Starlab (or equivalent) S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL STARLAB E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube STARLAB E1450-0200
96-well deep well plate Fisher Scientific 12194162
LC480 384 Multi-well plates Roche 04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil Roche 04729757001
Name Company Catalog Number Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

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qkat: मात्रात्मक अर्द्ध-हत्यारा सेल immunoglobulin की तरह रिसेप्टर जीन की स्वचालित टाइपिंग
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Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).More

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).

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