Kvantitativ killer celle immunglobulin-lignende reseptor (KIR) semi-automatisk skrive (qKAT) er en enkel, høy gjennomstrømming og kostnadseffektiv metode å kopiere nummer type KIR gener for programmet i befolkningen og sykdom association studier.
Killer celle immunglobulin-like reseptorer (KIRs) er et sett med hemmende og aktivere immun reseptorer, naturlig killer (NK) og T-celler, kodet av en polymorfisk klynge av gener på kromosom 19. Deres best preget ligander er de menneskelige leukocytter antigen (HLA) molekylene som er kodet i store histocompatibility kompleks (MHC) locus på kromosom 6. Det er betydelige bevis for at de spiller en betydelig rolle i immunitet, reproduksjon og transplantasjon, slik at det er avgjørende å ha teknikker som kan nøyaktig genotype dem. Men gjør høy-sekvens homologi, så vel som allel og kopi nummer varianten, det vanskelig å design metoder som kan nøyaktig og effektivt genotype alle KIR gener. Tradisjonelle metoder er vanligvis begrenset i oppløsningen av data innhentet, gjennomstrømning, kostnadseffektivitet og tiden konfigurere og kjøre eksperimenter. Vi beskriver en metode som kalles kvantitative KIR halvautomatisk skriver (qKAT), som er en høy gjennomstrømming multiplex sanntid polymerase kjedereaksjon metode som kan avgjøre genet kopi tallene for alle gener i KIR locus. qKAT er en enkel metode for høy gjennomstrømming som kan gi høy oppløsning KIR kopi nummer data, som kan brukes til å overvåke variasjoner i de strukturelt polymorfe haplotypes som omfatter dem videre. Kopier nummer og haplotype dataene kan være gunstig for studier av storskala sykdom foreninger samt Populasjonsgenetikk og undersøkelser på uttrykk og funksjonell samhandling mellom KIR og HLA.
Hos mennesker, killer immunglobulin-lignende reseptoren(KIR) locus er tilordnet på den lange arm av kromosom 19 i leukocytter receptor komplekse (LRC). Denne locus er rundt 150 kb i lengde og inneholder 15 KIR gener arrangert hodet til-hale. KIR loci som er kjente er KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, og to pseudogenes, KIR2DP1 og KIR3DP1. KIR genene kode for todimensjonale (2D) og tredimensjonale (3D) immunglobulin-lignende domene reseptorer med korte (S, aktivere) eller lange (L; hemmende) cytoplasmiske hale, som er uttrykt av naturlige killer (NK) celler og delsett av T celler. Kopier nummer variant utstilt i skjemaene KIR locus ulike haplotypes med variabel genet innhold1. Non-allel homologe rekombinasjon (NAHR), tilrettelagt av en nær hode til hale genet ordningen og høy-sekvens homologi, er mekanismen foreslått å være ansvarlig for haplotypic variasjon. Over 100 forskjellige haplotypes er rapportert i befolkninger over hele verden1,2,3,4. Alle disse haplotypes kan deles inn i to store grupper: A og B haplotypes. A-haplotype inneholder 7 KIR gener: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1og KIR3DL2, som er hemmende KIR gener og aktivere KIR gene KIR2DS4. Imidlertid opp til 70% av europeiske opprinnelse personer som er homozygous for KIR haplotype A utelukkende bære en ikke-fungerende “sletting av” form for KIR2DS45,6. Alle andre KIR genet kombinasjoner danne gruppe B haplotypes, inkludert minst én av bestemte KIR gener KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, og KIR2DL5, og som typisk omfatter to eller flere aktivering KIR gener.
HLA klasse I molekyler har blitt identifisert som ligander for visse hemmende reseptorer (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3og KIR3DL1), aktivere reseptorer (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, og KIR3DS1), og for KIR2DL4, som er en unik KIR som inneholder en lang cytoplasmiske hale som andre hemmende KIR-reseptorer, men har også et positivt ladet rester nær ekstracellulære domenet som er en vanlig funksjon av andre aktivering KIR -reseptorer. Kombinasjonen av varianter KIR gener og HLA gener påvirker reseptor ligand samhandling som figurer potensielle NK celle respons på enkelte nivå7,8. Bevis fra genetisk association studier har indikert at KIR spiller en rolle i viral motstand (f.eks., humant immunsviktvirus [HIV]9 og hepatitt C-viruset [HCV]10), suksess for transplantasjon 11, risikoen for graviditet lidelser og reproduktive suksess12,13, beskyttelse mot tilbakefall etter allogene blodkreft stilk cellen transplantasjon (HSCT)14,15, 16, og risikoen for kreft17.
Kombinasjonen av høy-sekvens homologi og allel og haplotypic mangfold presenterer utfordringer i oppgaven med nøyaktig genotyperingteknologi KIR gener. Konvensjonelle metoder å skrive KIR gener omfatte sekvens-spesifikke primer (SSP) polymerase kjedereaksjon (PCR)18,19,20, sekvens-spesifikke oligonucleotide sonde (SSOP) PCR21, og Matrix assistert laser desorption ionization-tid på fly massespektrometri (MALDI-TOF MS)22. Ulempene ved disse teknikkene er at de bare gir delvis innsikt genotype av en individuell mens være arbeidskrevende å utføre. Neste generasjons sekvensering (NGS) har nylig brukt til typen KIR locus spesielt. Denne metoden er svært kraftig, det kan være dyrt å kjøre, og det er tidkrevende å gjennomføre dyptgående analyse og data sjekker.
qKAT er en høy gjennomstrømming kvantitative PCR metode. Mens konvensjonelle metoder er arbeidskrevende og tidkrevende, denne metoden gjør det mulig å kjøre nesten 1000 genomisk DNA (gDNA) prøver i fem dager og gir KIR genotype, samt hvor genet kopi. qKAT består av ti multiplex reaksjoner, hvorav hver mål to KIR loci og referanse genet av en fast kopi i genomet (STAT6) brukes for den relative kvantifiseringen av KIR genet Kopier nummer23. Denne analysen har blitt brukt i studier med store befolkning paneler og sykdom kohorter på smittsomme sykdommer som hepatitt c, autoimmune tilstander som type 1 diabetes, og graviditet lidelser som preeclampsia, samt gi en genetisk underbygger studier rettet mot å forstå NK celle funksjon1,4,24,25,26.
Vi beskrev en roman halvautomatisk høy gjennomstrømming metoden, kalles qKAT, som muliggjør kopi tallinntasting av KIR gener. Metoden er en forbedring over konvensjonelle metoder som SSP-PCR, som lav gjennomstrømming og kan bare angi tilstedeværelse eller fravær av disse svært sammensatte gener.
Nøyaktigheten av kopi nummer dataene innhentet er avhengig av flere faktorer, inkludert kvaliteten og konsentrasjon-enhetlig gDNA prøvene og kvaliteten på reagenser. Kvaliteten og nøyaktigheten av gDNA prøvene over en plate er svært viktig siden variasjoner i konsentrasjon over platen kan føre til feil i beregning av antall kopier. Siden analyser ble validert ved hjelp av europeiske opprinnelse Prøvesett, krever data fra kohorter fra andre deler av verden mer grundige kontroller. Dette er å sikre at forekomster av allelet dropout eller uspesifisert primer/sonde binding ikke er feiltolkes som kopien antall variant.
Mens analyser ble designet og optimalisert for å kjøre som høy gjennomstrømming, kan de endres for å kjøre færre prøver. Tillit beregningen i kopi nummer analyseprogramvare påvirkes når du analyserer færre prøver, men dette kan bli bedre hvis kontrollen genomisk DNA-prøver med et kjent KIR genet kopi nummer finnes på platen og flere eksempler gjentak inkludert.
For laboratorier uten væske/plate-håndtering roboter, master blanding kan bli utlevert med flerkanals Pipetter og plater manuelt kan lastes inn i qPCR-apparatet.
Hovedformålet bak utviklingen av qKAT var å lage en enkel, høy gjennomstrømming, høy oppløsning og kostnadseffektiv metode til genotype KIRs for sykdom association studier. Dette var oppnådd siden qKAT har vært ansatt i undersøke rollen av KIR i flere store sykdom association studier, inkludert en rekke smittsomme sykdommer, autoimmune tilstander og graviditet lidelser4, 24 , 25 , 26.
The authors have nothing to disclose.
Mottok landsbyen stønad fra Medical Research Council (MRC), European Research Council (ERC) under EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet (grant avtalen nr. 695551) og National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedisinsk forskningssenter og NIH forskning blod og transplantere Research Unit (NIHR BTRU) i orgel donasjon og transplantasjon ved University of Cambridge og i samarbeid med NHS blod og transplantasjon (NHSBT). Synspunktene er de av forfatterne, og ikke nødvendigvis de av NHS, NIHR, Department of Health eller i NHSBT.
REAGENTS | |||
Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
MilliQ water | − | − | − |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
OR | |||
QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
SOFTWARE | |||
Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |