Pilha de assassino quantitativa imunoglobulina-como receptor (KIR) semi-automático digitação (qKAT) é um método simples, alto rendimento e baixo custo para copiar números genes KIR de tipo para sua aplicação em estudos de associação de população e a doença.
Receptores de imunoglobulina-like da pilha de assassino (KIRs) são um conjunto de receptores imunes inibitórios e ativando, assassinas naturais (NK) e células T, codificadas por um cluster polimórfico de genes no cromossomo 19. Seus ligantes mais bem caracterizadas são as moléculas de antigénios (HLA) de leucócito humano que são codificadas dentro o locus de (MHC) complexo principal de histocompatibilidade no cromossomo 6. Não há evidências substanciais de que desempenham um papel significativo na imunidade, reprodução e transplante de órgãos, tornando-se crucial ter técnicas que podem com precisão genótipo-los. No entanto, sequência de alta homologia, também como alélica e variação do número de cópia, dificultam ao genótipo e, eficientemente, métodos de projeto que podem com precisão todos os genes KIR . Os métodos tradicionais são geralmente limitados a resolução dos dados obtidos, produtividade, rentabilidade e o tempo necessário para configurar e executar os experimentos. Nós descrevemos um método chamado quantitativo KIR digitação semi-automática (qKAT), que é um método de reação em cadeia de polimerase em tempo real multiplex do elevado-throughput que pode determinar o número de cópias do gene para todos os genes no locus do KIR . qKAT é um método simples de alto rendimento que pode fornecer dados de alta resolução KIR cópia números, que podem ser mais usados para inferir as variações nos haplótipos estruturalmente polimórficas que eles englobam. Dados de número e haplótipo esta cópia podem ser benéficos para estudos sobre associações de doença em grande escala, genética de populações, bem como investigações sobre a expressão e interações funcionais entre KIR e HLA.
Em humanos, os receptores de imunoglobulina-como assassino(KIR) locus é mapeado no braço longo do cromossomo 19 dentro o leucócitos do receptor complexo (LRC). Esse locus é cerca de 150 kb de comprimento e inclui 15 KIR genes arranjados cabeça a cauda. Os loci KIR que é atualmente conhecidos são KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3 KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, e dois pseudogenes, KIR2DP1 e KIR3DP1. Os genes KIR codificam para bidimensional (2D) e tridimensionais (3D) domínio de imunoglobulina-como receptores com short (S; ativando) ou longa (L; inibitório) cauda citoplasmática, que é expressos por células assassinas naturais (NK) e subconjuntos de T células. Variação de número de cópia exibiu dentro das formas de locus KIR diversos haplótipos com gene variável conteúdo1. Recombinação homóloga não-alélica (NAHR), facilitada por um arranjo de gene de cabeça-de-cauda estreita e sequência de alta homologia, é o mecanismo proposto para ser responsável para a variabilidade de haplotypic. Mais de 100 diferentes haplótipos foram relatados em populações em todo o mundo1,2,3,4. Todos estes haplótipos podiam ser divididos em dois grandes grupos: A e B haplótipos. O haplótipo A contém 7 genes KIR : KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1e KIR3DL2, que são inibitórios genes KIR e a activação KIR gene KIR2DS4. No entanto, até 70% de indivíduos de origem europeia que são homozigotos para KIR haplótipo A exclusivamente levar para uma forma de “exclusão” não-funcional de KIR2DS45,6. Todas as outras combinações de genes KIR formam grupo B haplótipos, incluindo pelo menos um dos genes KIR específicos KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, e KIR2DL5e tipicamente incluem dois ou mais genes KIR ativando.
Moléculas de HLA classe I foram identificados como ligantes para determinados receptores inibitórios (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3e KIR3DL1), ativando os receptores (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5e KIR3DS1), e para KIR2DL4, que é um exclusivo KIR que contém um longo citoplasmático rabos como outros receptores KIR inibitórios, mas também tem um resíduo de carga positiva perto o domínio extracelular, que é um comum característica de outros receptores KIR ativando. A combinação de variantes dentro dos genes KIR e os genes HLA influencia a interação do ligante do receptor que formas potencial NK célula capacidade de resposta a nível individual7,8. Evidências de estudos genéticos Associação indicou que KIR desempenha um papel na resistência viral (ex.., vírus de imunodeficiência humana [HIV]9 e hepatite C vírus [HCV]10), o sucesso do transplante de 11, o risco de gravidez transtornos e sucesso reprodutivo12,13, a proteção contra a recaída após células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH)14,15, 16e o risco de cancros17.
A combinação de sequência de alta homologia e alélica e haplotypic diversidade apresenta desafios na tarefa de genes KIR com precisão genotipagem. Métodos convencionais para digitar genes KIR incluem a primeira demão de sequência-específica (SSP) do polymerase reação em cadeia (PCR)18,19,20, sequência específica oligonucleotide sonda PCR (SSOP)21, e laser assistida matriz desorção ionização-tempo de voo de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS)22. As desvantagens dessas técnicas são que eles só fornecem visão parcial sobre o genótipo de um indivíduo enquanto também ser trabalhoso executar. Recentemente, sequenciamento de próxima geração (NGS) tem sido aplicado para digitar o locus KIR especificamente. Enquanto este método é muito poderoso, pode ser caro executar, e é demorado para realizar verificações de dados e análise em profundidade.
qKAT é um método PCR quantitativo elevado-throughput. Enquanto os métodos convencionais são laborioso e demorado, este método torna possível executar quase 1.000 amostras de DNA (gDNA) genômicas em cinco dias e dá o genótipo KIR , bem como o número de cópia do gene. qKAT é composto por dez reações multiplex, cada um dos quais metas dois loci KIR e um gene de referência de um número fixo de cópia no genoma (STAT6) utilizado para a quantificação relativa do gene KIR copiar número23. Este ensaio tem sido usado com sucesso em estudos envolvendo painéis de grande população e doença coortes sobre doenças infecciosas como HCV, doenças auto-imunes, como diabetes tipo 1 e transtornos da gravidez como pré-eclâmpsia, bem como fornecendo uma genética na base de estudos que visa compreender o NK celular função1,4,24,25,26.
Nós descrevemos um método de alta produtividade semi-automatizadas romance, chamado qKAT, que facilita a digitação de número cópia dos genes KIR . O método é uma melhoria sobre os métodos convencionais como SSP-PCR, que são de baixo rendimento e só podem indicar a presença ou ausência destes genes altamente polimórficos.
A precisão dos dados cópia números obtidos é dependente de vários fatores, incluindo a qualidade e uniformidade-concentração de amostras gDNA e a qualidade dos reagentes. A qualidade e a precisão das amostras gDNA através de uma placa são extremamente importantes, uma vez que as variações na concentração do outro lado da placa podem resultar em erros no cálculo do número de cópia. Desde os ensaios foram validados utilizando conjuntos de exemplo de origem europeia, dados de coortes de outras partes do mundo exigem verificações mais minuciosa. Isto é para garantir que instâncias do abandono do alelo ou ligação não-específica da primeira demão/sonda não são mal interpretadas como variação de número de cópia.
Enquanto os ensaios foram projetados e otimizados para rodar como alta produtividade, eles podem ser modificados para executar amostras menos. A métrica de confiança no software de análise do número cópia é afectada quando analisando amostras de menos, mas isso pode ser melhorado se amostras de DNA genômicas controle com um número de cópia de gene conhecido do KIR estão incluídas na placa e repetições de exemplo adicionais são incluído.
Para os laboratórios sem líquido/placa-manipulação de robôs, mistura de mestre pode ser dispensada usando pipetas multicanais e chapas podem ser carregadas manualmente dentro do instrumento qPCR.
O principal objetivo por trás do desenvolvimento de qKAT foi criar um simples, alta produtividade, alta resolução e econômica método genótipo KIRs para doença estudos de associação. Isto foi conseguido com sucesso desde que qKAT tem sido empregado em investigar o papel do KIR em vários estudos de associação grande doença, incluindo uma variedade de doenças infecciosas, doenças auto-imunes e distúrbios de gravidez4, 24 , 25 , 26.
The authors have nothing to disclose.
O projeto recebido financiamento do Conselho de pesquisa médica (MRC), o Conselho Europeu de investigação (CEI) sob o programa União Europeia do Horizonte 2020 pesquisa e inovação (grant acordo n. º 695551) e a National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedical Research Centre e sangue de pesquisa de NIH e Transplant Research Unit (NIHR BTRU) na transplantação e na Universidade de Cambridge e em parceria com o sangue de NHS e transplante (NHSBT). As opiniões expressadas são as dos autores e não necessariamente aqueles de NHS, o NIHR, o departamento de saúde ou o NHSBT.
REAGENTS | |||
Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
MilliQ water | − | − | − |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
OR | |||
QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
SOFTWARE | |||
Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |