Kvantitativa killer cell immunglobulin-like receptor (KIR) halvautomatisk maskinskrivning (qKAT) är en enkel, hög genomströmning och kostnadseffektiv metod för att kopiera nummer typ KIR gener för deras tillämpning i befolkningen och sjukdom associationsstudier.
Killer cell immunglobulin-liknande receptorer (KIRs) är en uppsättning av hämmande och aktiverande immun receptorer, naturliga mördarceller (NK) och T-celler, kodas av en polymorf kluster av gener på kromosom 19. Deras bäst kännetecknas ligander är humant leukocyt antigen (HLA) molekylerna som kodas inom det stora histocompatibility komplexa (MHC) locus på kromosom 6. Det finns påtagliga bevis att de spelar en betydande roll i immunitet, reproduktion och transplantation, vilket gör det viktigt att ha tekniker som kan exakt genotyp dem. Dock gör hög-sekvenshomologi, samt som alleliska och kopia nummer variation, det svårt att designmetoder som kan exakt och effektivt genotyp alla KIR gener. Traditionella metoder är vanligen begränsade upplösningen av uppgifter som erhållits, genomströmning, kostnadseffektivitet och tiden för att starta och driva experimenten. Vi beskriver en metod som kallas kvantitativa KIR halvautomatisk skriva (qKAT), som är en metod av hög genomströmning multiplex realtid polymeras-kedjereaktion som kan avgöra gen kopiera siffrorna för alla gener i den KIR -locus. qKAT är en enkel hög genomströmning metod som kan ge högupplösta KIR kopia nummer data, vilket ytterligare kan användas för att härleda variationerna i den strukturellt polymorfa haplotyper som omsluta dem. Kopiera nummer och haplotyp data kan vara fördelaktigt för studier på storskaliga sjukdom föreningar, populationsgenetik, samt utredningar på uttryck och funktionella interaktioner mellan KIR och HLA.
I människor, killer immunglobulin-liknande receptorn(KIR) locus är mappad på den långa armen av kromosom 19 inom leukocyt-receptorkomplexet (LRC). Detta locus är omkring 150 kb i längd och omfattar 15 KIR gener ordnade head-to-tail. De KIR -lokus som är för närvarande kända är KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, och två pseudogener, KIR2DP1 och KIR3DP1. KIR generna kodar för tvådimensionell (2D) och tredimensionella (3D) immunglobulin-liknande domän receptorer med kort (S; aktivera) eller lång (L; hämmande) cytoplasmiska svansar, som uttrycks av naturliga mördarceller (NK) och delmängder av T celler. Kopiera nummer variation uppvisade inom formulären KIR locus olika haplotyper med variabel gene innehåll1. Icke-alleliska homolog rekombination (NAHR), underlättas av en nära huvud till svans gen arrangemang och hög-sekvenshomologi, är den mekanism som föreslås bli ansvarig för den haplotypic variationen. Över 100 olika haplotyper har rapporterats i populationer i världen1,2,3,4. Alla dessa haplotyper kunde delas in i två huvudgrupper: A och B haplotyper. Den A haplotypen innehåller 7 KIR gener: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1och KIR3DL2, som är inhiberande KIR gener och den aktiverande KIR gen KIR2DS4. Dock upp till 70% av EU-ursprung individer som är homozygota för KIR haplotyp A uteslutande utföra en icke-funktionella ”strykning” form av KIR2DS45,6. Alla andra KIR gen kombinationer bildar grupp B haplotyper, inklusive minst en av de specifika generna som KIR KIR2DS1, KIR2DS3, KIR3DS1, KIR2DS5, KIR2DS2, KIR2DL2, och KIR2DL5, och omfattar vanligtvis två eller flera aktiverande KIR gener.
HLA klass I molekyler har identifierats som liganderna för vissa hämmande receptorer (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3och KIR3DL1), aktiverande receptorer (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, och KIR3DS1), och för KIR2DL4, som är en unik KIR som innehåller en lång cytoplasmiska svansar som andra inhiberande KIR-receptorer men har också ett positivt laddade rester nära den extracellulära domänen som är ett vanligt funktion i andra aktiverande KIR -receptorer. Kombinationen av varianter inom KIR generna och de HLA-generna påverkar receptor ligand interaktion att former potentiella NK cell lyhördhet på individuell nivå7,8. Bevis från genetiska associationsstudier har antytt att KIR spelar en roll i viral resistens (e.g., humant immunbristvirus [HIV]9 och hepatit C-virus [HCV]10), framgången för transplantation 11, risken för graviditet sjukdomar och reproduktiv framgång12,13, skydd mot återfall efter allogen hematopoetiska stamceller transplantation (HSCT)14,15, 16, och risken för cancer17.
Kombinationen av hög-sekvenshomologi och alleliska och haplotypic mångfald presenterar utmaningar i uppgift att exakt genotypning KIR gener. Konventionella metoder skriva KIR gener inkluderar sekvens-specifik primer (SSP) polymeras-kedjereaktion (PCR)18,19,20, sekvens-specifika oligonukleotiden sond (SSOP) PCR21, och Matrix assisterad laser desorption jonisering-tid av flygning masspektrometri (MALDI-TOF MS)22. Nackdelarna med dessa tekniker är att de ger bara delvis inblick i genotypen hos en individ samtidigt vara arbetsamt att utföra. Nästa generations sekvensering (NGS) har nyligen tillämpats skriver det KIR locus specifikt. Även denna metod är mycket kraftfull, det kan bli dyrt att köra, och det är tidskrävande att genomföra djupgående analys och data kontroller.
qKAT är en hög genomströmning kvantitativa PCR-metod. Medan konventionella metoder är mödosam och tidskrävande, denna metod gör det möjligt att köra nästan 1.000 genomisk DNA (gDNA) prover i fem dagar och ger KIR genotypen, liksom antalet gen kopia. qKAT består av tio multiplex reaktioner, vilka riktar två KIR loci och en referens gen av en fast kopienumret i genomet (STAT6) används för relativ kvantifiering av genen KIR kopiera nummer23. Denna analys har använts framgångsrikt i studier som involverar stora befolkning paneler och sjukdom kohorter på infektionssjukdomar som HCV, autoimmuna sjukdomar som diabetes typ 1 och graviditet störningar såsom havandeskapsförgiftning, samt att ge en genetisk som ligger till grund till studier som syftar till att förstå den NK cell funktion1,4,24,25,26.
Vi beskrev en roman halvautomatisk hög genomströmning-metod, som kallas qKAT, vilket underlättar kopia nummer typning av KIR gener. Metoden är en förbättring jämfört med konventionella metoder som SSP-PCR, som låg genomströmning och kan bara ange närvaron eller frånvaron av dessa starkt polymorfa gener.
Riktigheten av kopia nummer uppgifterna är beroende av flera faktorer, inklusive kvalitet och koncentration-enhetlig gDNA proverna och kvaliteten av reagenser. Kvalitet och noggrannhet av gDNA proverna över en tallrik är oerhört viktiga eftersom variationer i koncentration över plattan kan leda till fel i beräkningen av antalet exemplar. Eftersom analyserna har validerats med hjälp av Europeiska-ursprung provningssatser, kräver data från kohorter från andra delar av världen grundligare kontroller. Detta är att säkerställa att instanser av allel avhopp eller icke-specifik primer/sond bindande inte är misstolkas som kopia nummer variant.
Medan analyserna var utformade och optimerade för att köra som hög genomströmning, kan de ändras för att köra färre prover. Förtroende måttet i programvaran kopia nummer analys påverkas när analysera färre prover, men detta kan förbättras om kontroll genomisk DNA-prover med ett känt KIR gen kopia antal ingår på plattan och ytterligare prov replikat är ingår.
För laboratorier utan vätska/plattan-hantering robotar, master mix kan doseras med flerkanaligt pipetter och plattor kan laddas manuellt i qPCR instrumentet.
Det huvudsakliga syftet bakom utvecklingen av qKAT var att skapa en enkel, hög genomströmning, högupplösta och kostnadseffektiv metod att genotyp KIRs för sjukdom associationsstudier. Detta uppnåddes framgångsrikt eftersom qKAT har varit anställd i undersöka KIR roll i flera stora sjukdom föreningen studier, inklusive en rad infektionssjukdomar, autoimmuna sjukdomar och graviditet störningar4, 24 , 25 , 26.
The authors have nothing to disclose.
Projektet fick finansiering från medicinsk forskning rådet (MRC), den Europeiska forskningsrådet (ERC) under Europeiska unionens programmet Horisont 2020 forskning och innovation (grant avtal nr 695551) och National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedical Research Centre och NIH forskning blod och Transplant Research Unit (NIHR BTRU) i organdonation och Transplantation på universitetet i Cambridge och i partnerskap med NHS blod och transplantera (NHSBT). De åsikter som framförs är författarnas och inte nödvändigtvis de av NHS, NIHR, Institutionen för hälsa eller NHSBT.
REAGENTS | |||
Oligonucleotides | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 4 |
Probes labelled with ATTO dyes | Sigma | Custom order | SEQUENCES: Listed in Table 3 |
SensiFAST Probe No-ROX Kit | Bioline | BIO-86020 | − |
MilliQ water | − | − | − |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
EQUIPMENT | |||
Centrifuge with a swinging bucket rotor | Eppendorf(or equivalent) | Eppendorf 5810R or equivalent system | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
OR | |||
QuBit Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Matrix Hydra | Thermo Scientific | 109611 | |
LightCycler 480 II Instrument 384-well | Roche | 05015243001 | |
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) | Caliper Life Sciences | 204135 | |
Vortex mixer | Biosan | BS-010201-AAA | |
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) | Gilson(or equivalent) | F144801, F123600, F123615, F123602, F161201 | |
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) | Starlab (or equivalent) | S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001 | |
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL | STARLAB | E2310-1010 | |
50 mL Centrifuge Tube | STARLAB | E1450-0200 | |
96-well deep well plate | Fisher Scientific | 12194162 | |
LC480 384 Multi-well plates | Roche | 04729749001 | |
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | |
NAME | COMPANY | CATALOG NUMBER | COMMENTS |
SOFTWARE | |||
Roche LightCycler 480 Software v1.5 | |||
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html | ||
KIR haplotype identifier | http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/ |