聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的荧光银染色
Summary
在这里, 我们描述了一个详细的协议, 概述了一种新的荧光染色技术的总蛋白检测在聚丙烯酰胺凝胶。该协议采用了银离子特异性荧光开启探针, 可检测银+蛋白复合物, 并消除了传统的铬性银渍的某些限制。
Abstract
银染色是一种比色技术, 广泛用于可视化聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质带, 遵循十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)。经典的银渍有一定的缺点, 如背景染色高、蛋白质恢复不良、重现性差、定量线性动态范围窄、与质谱 (MS) 的相容性有限。现在, 利用氟生成银 + 探针 Tpe-4ta ,我们开发了一种荧光银染色方法, 用于聚丙烯酰胺凝胶中的总蛋白可视化。这种新的污渍避免了传统银渍中麻烦的银还原步骤。此外, 荧光银染色在蛋白质检测中具有良好的重现性、灵敏度和线性定量性, 是一种实用的蛋白质凝胶染色。
Introduction
许多染色方法已被用来可视化蛋白质凝胶电泳后, 例如使用比色染料, 如铜丝明亮蓝, 银染色, 荧光, 或放射性标记1,2,3 个,4. 银染色被认为是蛋白质检测最敏感的技术之一, 需要简单和廉价的试剂。它可分为两个主要的家庭: 氨银染色和硝酸银染色5,6。在碱性氨基银法中, 用氨和氢氧化钠生产银-二胺复合物, 并在开发过程中使用酸性甲醛溶液还原为金属银。该染色可有效地适应基本蛋白质, 但对酸性和中性蛋白表现出的性能受到损害, 而且仅限于经典的甘氨酸和牛磺酸电泳系统。相比之下, 硝酸银污渍利用了银离子对蛋白质的高生物亲和力, 主要是侧链中的磺基和羧基, 并倾向于更有效地染色酸性蛋白质 7.银离子结合后, 开发中的溶液 (通常由含有甲醛和硫代硫酸钠的金属碳酸盐溶液制成) 被用来减少银离子对金属银粒, 这就建立了一个棕色到深色的可视化蛋白带。
虽然银染色自1970年代8以来一直以其多功能性和高灵敏度而闻名, 但这种方法经常被认为是棘手的。银染法具有时间限制的步骤, 重现性低。由于银染色的颜色通常不均匀, 依赖于还原步骤, 这是很难控制的, 银染色不是一个定量的方法, 因此, 不建议用于凝胶比较研究和蛋白质定量9。在灵敏度上优化的方法可以利用醛, 这也可以提供更均匀的染色10。然而, 这是以牺牲进一步的下游分析为代价的, 因为蛋白质通过醛的交联。快速协议大多结合或缩短步骤, 以减少时间, 损害了染色的重现性和均匀性5。因此, 在蛋白质凝胶染色中有许多银染色变种, 每一种都经过优化, 以满足某些要求;例如, 用于下游分析的简单性、灵敏度或肽回收率。这些属性也可能对彼此产生影响, 在一个协议中满足所有要求可能会很困难。
本文介绍了一种新的聚丙烯酰胺凝胶蛋白质检测荧光银染色方法。在这种方法中, 我们使用了银离子的荧光探针Tpe-4ta (图 1), 以可视化浸银的蛋白质11。Tpe-4ta是根据聚合诱导发射 (aie) 原理设计的。它在水溶液中溶解时不具有发射性, 但在银离子存在的情况下具有高度的发射性。荧光银方法取代了传统银污渍中的显色发育, 从而使总蛋白质在减少背景的情况下进行了鲁棒染色。
此外, 荧光银染色在蛋白质定量方面表现出良好的动态线性范围, 与广泛使用的 SYPRO 红宝石染色相当, 与传统的银染色无法实现。这种凝胶可以在许多生物实验室的常用凝胶文档系统上成像 (激发波长: 302165nm 通道; 发射: ~ 490-530 nm)。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文介绍了一种新的聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质荧光银染色方法。这种策略集成了传统的银渍和荧光污渍。染色利用银离子与其他银渍中的蛋白质的选择性结合, 但采用了高度敏感的荧光银探针Tpe-4ta 来点燃银结合蛋白。由于荧光探针Tpe-4ta 可以在纳米摩尔范围11中以相当低的浓度检测银离子, 因此它能够进行高度敏感的检测, 而无需进一步要求传统中需要的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢卡洛林斯卡研究所明围流康复医学中心的陈嘉诚的技术支持。S. X. 感谢瑞典研究理事会的支持 (2017-06344 号批准)。
Materials
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | – | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | – | Equipment |
References
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