Fluorescerande silverfärgning av proteiner i polyakrylamidgeler

Summary

Här beskriver vi ett detaljerade protokoll som beskriver en ny fluorescerande färgning teknik för totalprotein upptäckt i polyakrylamidgeler. Protokollet använder tredjeparts en silver ion-specifika fluorescens turn-on sond, som upptäcker Ag⁺-proteinkomplex, och eliminerar vissa begränsningar av traditionella kromogen silver fläckar.

Abstract

Silverfärgning är en kolorimetrisk teknik som ofta används för att visualisera protein band i polyakrylamidgeler efter sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE). Klassisk silver fläckar har vissa nackdelar, såsom hög bakgrund färgning, dålig protein återvinning, låg reproducerbarhet, ett smalt linjära dynamiska omfång för kvantifiering och begränsad kompatibilitet med masspektrometri (MS). Nu, med hjälp av en fluorogenic Ag⁺ sond, TPE-4TA, vi utvecklat en fluorescerande silver färgning metod för totalprotein visualisering i polyakrylamidgeler. Denna nya fläck undviker det besvärande silver minskning steget i traditionella silver fläckar. Dessutom visar fluorescerande silver fläcken bra reproducerbarhet, känslighet och linjär kvantifiering i protein upptäckt, vilket gör det till en användbar och praktisk protein gel fläck.

Introduction

Många färgning metoder har varit användas för att visualisera proteiner efter gelelektrofores, till exempel använder kolorimetriska färgämnen som Coomassie Brilliant Blue, silver fläcken, fluorescens, eller radioaktiv märkning^{1,2, 3 , 4}. silverfärgning anses vara en av de mest känsliga teknikerna för protein upptäckt som kräver enkel och billig reagenser. Det kan delas in i två stora familjer: ammoniak silver fläcken och silvernitrat fläcken^5,6. I alkaliska ammoniak silver metoden, silver-diamine anläggningen produceras med ammoniak och natriumhydroxid och reduceras till metalliskt silver under utveckling med en sura formaldehydlösning. Fläcken rymmer effektivt för grundläggande proteiner men visar en komprometterad prestanda för sura och neutrala proteiner och är dessutom begränsad till klassiskt glycin och taurin elektroforetiska system. I jämförelse, silvernitrat fläckar utnyttja hög bio-frändskapet av silverjoner till protein, främst de sulfhydryl carboxyl grupper från sida kedjorna och tenderar att färga sura proteiner effektivare⁷. Efter silverjoner bindande, en utveckla lösningen (vanligtvis gjorda av en metall karbonat lösning innehållande formaldehyd och natrium tiosulfat) används för att reducera silverjoner till metalliskt silver korn, som bygger upp en brun till mörkt färg att visualisera den protein band.

Silverfärgning har varit känt för sin mångsidighet och hög känslighet sedan dess utveckling i 1970-talet⁸, är metoden ofta betraktas som knepigt. Silver-färgning metoder har tid-begränsat steg och visar låg reproducerbarhet. Eftersom färgen på silver fläcken inte är oftast enhetlig och beroende av det steget-minskning som är svårt att styra, silver fläcken är inte en kvantitativ metod och, således, rekommenderas inte för gel jämförelse studie och protein kvantifiering⁹. Metoder optimerad i känslighet kan utnyttja aldehyder som också kan ge en mer enhetlig färgning¹⁰. Detta är dock på bekostnad av ytterligare nedströms analys på grund av tvärbindning av proteiner av aldehyder. Snabb protokoll mestadels kombinera eller förkorta steg för att minska tid, att kompromissa med reproducerbarhet och likformighet av fläcken⁵. Som ett resultat finns det många silver färgning varianter inom protein gel färgning, var optimerad för att passa vissa krav. till exempel, enkelhet, känslighet eller peptid återvinningsgraden för efterföljande analys. Dessa attribut kan också ha en inverkan på varandra, och uppfyller alla krav i ett protokoll kan vara svårt.

I detta arbete introducerar vi nya fluorescerande silver färgning protein detektionsmetod i polyakrylamidgel. Den här metoden använder vi en fluorogenic sond för silverjoner, TPE-4TA (figur 1), att visualisera silver-impregnerade proteiner¹¹. TPE-4TA är designad av principen om sammanläggning-inducerad utsläpp (AIE). Det är icke-emissive när upplöst i vattenlösning, men är mycket emissive i närvaro av silverjoner. Genom att ersätta kromogen utvecklingen i traditionella silver fläckar med en fluorogenic utveckla steg, kan metoden fluorescerande silver robust färgningen av totala proteiner med reducerad bakgrund.

Fluorescerande silver fläcken visade en bra linjär dynamik för protein kvantifiering, jämförbar med utbredda SYPRO Ruby fläcken och inte kan uppnås med traditionella silver fläckar. Gelen kan avbildas på vanliga gel dokumentationssystem med UV-lampa (excitation våglängd: 302/365 nm kanal; utsläpp: ~ 490-530 nm) på många biologiska laboratorier.

Protocol

1. beredning av Gel Obs: Demonstrationen följer ett standardprotokoll för att förbereda gelen för färgning kort efter SDS-PAGE12. I korthet följande steg beskriva beredning av proverna och gel elektrofores. Utföra SDS-PAGE med 4% – 12% Bis-Tris protein gels (1 mm, 15-brunn) med hjälp av en mini gel tank fylld med 2-(N -morpholino) ethanesulfonic syra (MES) buffert. Späd ut proverna med en blandning av destillerat vatten, litium dode…

Representative Results

De protein band färgas av fluorescerande silver fläcken uppvisar en intensiv grön fluorescens under en 365 nm UV-lampa. Alla 14 protein band (10-200 kDa), var från toppen till botten, klart synliga, korrelera väl med de 14 röd-färgade som färgas av SYPRO Ruby färgämne (figur 2)10. När det gäller kvantitativa protein upptäckt, gelerna var fotograferad av en gel so…

Discussion

Presenteras här är en roman fluorescerande silver färgning metod för proteiner i polyakrylamidgeler. Denna strategi integrerar konventionella silver fläckar och fluorescerande fläckar. Färgning bedrifter selektiva bindningen av silverjoner till proteiner som i andra silver fläckar men sysselsätter mycket känsliga fluorogenic silver probe TPE-4TA att lysa upp silver bundna proteinerna. Eftersom fluorogenic sonden TPE-4TA kan känna silverjoner i en ganska låg koncentration i na…

Materials

LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007	Reagent
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well	Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	Precast gel
Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Fisher Scientific	NP0004	Reagent
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher Scientific	NP0002	Reagent
Mini Gel Tank	Thermo Fisher Scientific	A25977	Equipment
300W Power Supply (230 VAC)	Thermo Fisher Scientific	PS0301	Equipment
Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Sample
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	31630-25G-R	Reagent
Ethanol	Bragg and co.	42520J	Reagent
Acetic acid	J.T. Baker	103201A	Reagent
Milli-Q Synthesis A10	Merk	–	Provides 18.2 MΩ.cm water
gel documentation system (c600 model)	Azure biosystems	–	Equipment