Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58754
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 1
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

Abstract

ערוצי פוטנציאלי קולטן ארעי (TRPCs) תת TRP הקנוני הם ערוצים הקטיון nonselective לשחק תפקיד חיוני הומאוסטזיס סידן, ערך סידן במיוחד המופעלים על החנות, אשר חיוני לשמירה על תפקוד תקין של שלפוחית סינפטית שחרור, תאיים איתות המסלולים. בהתאם לכך, ערוצי TRPC היו מעורבים במגוון רחב של מחלות האדם כולל מחלות לב וכלי דם כגון היפרטרופיה, הפרעות ניווניות כגון מחלת פרקינסון, הפרעות רגשיות ונוירולוגיות כגון אטקסיה spinocerebellar. לכן, ערוצי TRPC מייצגים יעד פוטנציאליים תרופתי למחלות אנושיות. עם זאת, המנגנון המולקולרי של gating בערוצים אלה עדיין אינם ברורים. הקושי בהשגת כמויות גדולות של חלבונים מטוהרים, הומוגני ויציב כבר גורם מגביל במחקרים נחישות מבנה, במיוחד עבור ממברנה יונקים חלבונים כגון תעלות היונים TRPC. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי בקנה מידה גדול של יון בתרבית של ערוץ קרום חלבונים באמצעות מערכת העברת הגן ששונה baculovirus ולטיהור חלבונים אלה על-ידי זיקה ו כרומטוגרפיה גודל-הדרה. בהמשך נציג פרוטוקול כדי לאסוף יחיד-חלקיקים הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ תמונות של חלבון מטוהרים וכדי להשתמש בתמונות אלה כדי לקבוע את מבנה החלבון. מכשור לקביעת קשיות ומבנה היא שיטה עוצמה להבנת המנגנונים של gating ותפקוד בתוך תעלות יונים.

Introduction

סידן מעורב תהליכים תאיים ביותר כולל איתות אשדים, בקרת שעתוק, שחרור נוירוטרנסמיטר והורמון מולקולה סינתזה1,2,3. קיום cytosolic סידן חינם homeostatic חיוני הבריאות והתפקוד של תאים. אחד המנגנונים העיקריים של הומאוסטזיס סידן תאיים הוא סידן המופעלים באמצעות החנות כניסה (SOCE), תהליך שבו דלדול של הסידן מאוחסנים הגורמים המפעילים (ER) רשתית תוך-פלזמית פתיחת תעלות היונים על קרום פלזמה כדי להקל חידוש מלאי של מיון סידן, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש עוד איתות4,5,6. קולטן ארעי פוטנציאליים ערוצים (TRPCs), אשר ערוצי סידן-חדיר השייכים superfamily TRP, זוהו כמשתתף העיקריים ב- SOCE-7,-8,-9 .

בין חברי שבע ממשפחת TRPC, TRPC3, TRPC6 ו- TRPC7 ליצור קבוצת homologue, והם ייחודי ביכולת להיות מופעל על ידי השומנים שליח משני diacylglycerol (DAG), תוצר השפלה של השומנים איתות phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 מתבטאת מאוד שריר חלק, האזורים במוח, אסטרוציטומה של המוח, שבו היא משחקת תפקידים חיוניים ב סידן איתות להשפיע12,עצבית ו נוירוג'נסיס13. תפקוד לקוי של TRPC3 נקשר במערכת העצבים המרכזית, מחלות לב וכלי דם, סרטן מסוימים כגון אדנוקרצינומה השחלות14,15,16. לכן, TRPC3 טומן בחובו הבטחה כמטרה תרופות לטיפול במחלות אלה. הפיתוח של תרופות ממוקדות במיוחד על TRPC3 היה מוגבל בשל חוסר ההבנה של מנגנונים הפעלה המולקולרי שלה, כולל השומנים איגוד אתרי17,18. אנחנו מדווחים על המבנה האטומי ברזולוציה הראשון של הערוץ TRPC3 האנושית (hTRPC3) ואתרי שלה מחייב ליפיד שתי במצב סגור, לספק תובנות חשובות אלה מנגנונים19.

גורם מפתח לקביעת המבנה של חלבון ממברנה ברזולוציה גבוהה הוא לקבל חלבון באיכות גבוהה. ההקרנה המתאימים של ביטוי וטיהור התנאים הדרושים לקבל חלבון איכותי יכול להיות מאמץ זמן רב ויקרות. כאן אנו מציגים פרוטוקול המתארת בפירוט כיצד אנו מזהים את תנאים אופטימליים כדי להפוך את הביטוי טיהור של hTRPC3, אשר התנהגה בצורה עלובה ההקרנה הראשונית שלנו. אנו מציגים מספר נקודות מפתח כיצד לפתור בעיות ולמטב את ההתנהגות חלבון, אשר בסיס יציב שלנו הקפאה-האלקטרון מיקרוסקופ (הקפאה-EM) מחקרים. אנו משתמשים baculoviral שונה של יצירת וקטור (pEG), שפותחה על ידי Gouaux ועמיתיו, אשר ממוטב עבור הקרנה מבחני והפקת יעיל baculovirus תאים בתרבית של20. שיטה זו ביטוי מתאים ביטוי מהירה וחסכונית של חלבונים קרום התא יונקים. אנו משלבים את השימוש הזה וקטור עם זריחה-זיהוי גודל-הדרה מבוססי וואקום (FSEC) prescreening שיטת21. שיטה זו משתמשת תג חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) דבוקה הבונה של עניין ומשפר ויזואליזציה של החלבון היעד בדגימות solubilized קטן, כל תא. זה מאפשר להקרנה של חלבון יציבות בנוכחות חומרי ניקוי שונים, תוספים, עם מוטציות thermostabilizing, והוא מאפשר השימוש של מספר קטן של תאים תקנים ארעי בקנה מידה קטן. בדרך זו, מספר רב של מצבים יכולים להיות במהירות מוקרן לפני שעבר הוא לטיהור חלבון בקנה מידה גדול. בעקבות הביטוי, סינון, טיהור, אנו מציגים פרוטוקול קבלת ועיבוד תמונות מהקפאה-EM כדי להפיק את נחישות דה נובו מבנית של החלבון. אנו מאמינים כי הגישות המתוארות כאן ישמש פרוטוקול להכליל ללימודי מבנית של קולטנים ערוץ TRP וחלבונים אחרים ממברנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שינוי של תאים המוסמכת DH10α כדי לייצר Bacmid דנ א

  1. לסנתז את הגן עניין, subclone אותו לתוך גרסה מותאמת של וקטור פג המכיל טווין דלקת-תג, תג His8 וכן GFP עם אתר המחשוף תרומבין בקו ה N טרמינוס (pFastBacI)20.
  2. להפוך תאים המוסמכת על-ידי הוספת 5 ננוגרם של פלסמיד המכיל גנים הרצוי ב- pFastBacI כדי μL 50 של DH10α בתאים mL 1.5 צינור, תקופת דגירה של 10 דקות על קרח. חום לזעזע את התאים עבור 45 s-42 ° C. להוסיף הצינור μL 200 מרק סופר אופטימלית בינונית מדכא. שבולם קטבולי (SOC), תקופת דגירה של 4-8 h ב- 37 מעלות צלזיוס תפקודי לב / נשימה-225 סל ד.
  3. צלחת 5 μL של תאים על צלחת אגר bacmid ליברות (kanamycin μg/mL 50, 7 גנטמיצין μg/mL, אגר טטרציקלין, μg/mL 100 Bluo-גל ו 40 μg/mL איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], μg/מ"ל).
  4. דגירה את הצלחת. בשביל h 48-37 מעלות צלזיוס.
    הערה: המושבות כתמים של Bluo-גל מחוון זה הם עדיין לבטא lacZ (וקטור ההכנסה לא מוצלח), המאפשר בחירה של המושבות (בהצלחה טרנספורמציה) לבן.
  5. בחר בקפידה המושבה לבן מבודד, הימנעות מכל המושבות לבן נמצאים בקשר עם מושבות כחול ולאחר לגדל תאים לילה ב 6 מ של בינוני bacmid ליברות (kanamycin μg/mL 50, 7 גנטמיצין μg/mL, טטרציקלין μg/מ"ל) ב- 37 מעלות צלזיוס תפקודי לב / נשימה-225 סל ד.

2. חיידקי הכנה עבור בידוד של דנ א Bacmid

  1. כדי לבודד דנ א bacmid, ספין למטה Escherichia coli תאים עבור 10 דקות ב 2880 x g.
  2. להשליך תגובת שיקוע ואת resuspend בגדר ב 200 µL של התא פתרון resuspension של miniprep קיט (ראה טבלה של חומרים) על ידי pipetting. ודא שבגדר מלא, למשל מושהה. אז, העברת התליה תא לתוך צינורות 1.5 mL.
  3. להוסיף 200 µL של הפתרון פירוק התא miniprep ואת תערובת על-ידי היפוך הצינור כמה פעמים. תקופת דגירה של עד 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי lyse התאים. להוסיף 200 µL של פתרון ניטרול miniprep ואת תערובת על-ידי היפוך צינור כמה פעמים להפסיק את תגובת פירוק.
  4. ספין למטה למשך 10 דקות ב x 21,130 g ומפרידה שולחני. לאסוף 600 μL של תגובת שיקוע צינור 2 מ"ל. הוסף תמיסת כוהל של פנול: כלורופורם: isoamyl μL 600 (ראה טבלה של חומרים) מערבבים ביסודיות כדי לחלץ את ה-DNA של שאר המוצרים פירוק התא.
    התראה: תמיסת כוהל פנול: כלורופורם: isoamyl הוא רעיל באמצעות אינהלציה, במגע עם העור, ואם בלע. זה יכול לגרום כוויות כימיות, עשוי להיות מסרטנים. ללבוש כפפות, חלוק מעבדה מכופתרות. לעבוד בשכונה fume. השלך פסולת מסוכנת זו כראוי.
  5. לסובב את הצינור 10 דקות ב x 21130 g ומפרידה שולחני. לשני שלבים נפרדים נוזלי יהיה גלוי. להעביר בזהירות μL 300 מימית השלב העליון צינור. הוסף 600 μL של 100% אתנול לשטוף את ה-DNA. היפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב.
    הערה: תעשה לא מערבולת, זה ניתן להטות bacmid DNA.
  6. צינורות מגניב על-ידי הצבתם במקפיא-20 ° C עבור 10 דקות ספין למטה למשך 10 דקות ב x 21,130 g ומפרידה שולחני. למחוק את תגובת שיקוע ולשמר בגדר ה-DNA.
  7. להוסיף 1 מ"ל אתנול 70% לשטוף את גלולה. היפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב. ספין 10 דקות ב x 21,130 g ומפרידה מלמעלה בטבלה. למחוק את תגובת שיקוע ולאפשר בגדר לאוויר יבש במשך כ 5 דקות או עד שאין הוא גלוי בצינור בגדר DNA הופך שקוף.
  8. Resuspend בגדר יבש ב- 50 µL של סטרילי, נטולת DNase, יונים מים. מודדים את ריכוז הדנ א.
    הערה: אין להקפיא bacmid DNA. לאחסן ב 4 ° C עבור ועד מספר ימים.

3. תרביות תאים בתאי חרקים Sf9 עם Bacmid כדי לייצר P1 Baculovirus

  1. זרע 0.9 x 106 תאים/טוב Sf9 ב 2 מ של המדיום המתאים (ראה טבלה של חומרים) בכל טוב של צלחת תרביות רקמה 6-. טוב. דגירה תאים ב 27 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לקדם את הקובץ המצורף לצלחת.
    התראה: תרביות תאים הן חומרים מסוכנים פוטנציאליים. עבודה מאושרות למינארי באמצעות טכניקות aseptic וסמנו הנחיות מוסדיים וממשלתיים המומלצת ביגוד מגן, סילוק נכון של פסולת לפני ביצוע ניסויים.
  2. לאחר מצורף, להוסיף µL 8 של תרביות תאים ריאגנט (ראה טבלה של חומרים) כדי µL 100 של מדיה עבור כל טוב של 6 טוב צלחת להיות transfected בשפופרת סטרילי. להוסיף μg 6 של bacmid ה-DNA µL 100 של מדיום בשפופרת סטרילי נפרד. דגירה 5 דקות RT. לשלב השני פתרונות, תקופת דגירה של 45 min ב- RT.
  3. החלף את המדיום בבארות 6 2 מיליליטר בינוני טריים. להוסיף את התערובת מהשלב הקודם לכל אחד טוב dropwise (200 µL לכל טוב). רוק בעדינות את הצלחת כדי להבטיח ערבוב של הפתרון תרביות תאים לתוך האמצעי.
    הערה: אל מערבולת או לנער את הצלחת מכיוון שהדבר יגרום תאים לנתק.
  4. דגירה תאים עבור 5 d (120 h) בחממה humidified 27 ° C. בדיקת קרינה פלואורסצנטית GFP לפני הקציר כדי לאמת שאת הוירוס מיוצר ואחוז גדול של תאים; אם האחוז נמוך, ולהאריך את זמן הדגירה כנדרש (ראה איור 1C).
  5. לאסוף את הווירוס P1 המכילים supernatant (בערך 2 מ"ל מכל קידוח). לסנן את המדיום המכיל וירוס P1 לתוך צינורות 2-mL באמצעות מזרק 3 מ ל וקטן-0.2 µm מסנן. להוסיף סרום שור עוברית סטרילי (FBS) ריכוז סופי של 1%.
    הערה: את המניה של P1 וירוס צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C, להיות מוגן מפני אור.

4. זיהום של Sf9 תאים חרקים עם P1 Baculovirus לייצר P2 Baculovirus

  1. להכין 200 מ ל (או לנפח הרצוי) של תאים Sf9-ריכוז של 0.8 - 0.9 x 106 תאים למ"ל בינוני המתאים (ראה טבלה של חומרים) בבקבוקון תרבות Erlenmeyer בתחתית שטוח בגודל הרצוי.
    הערה: עבור השעיה תרבות, האחסון בשימוש לא יעלה על 40% מהקיבולת המרבית של הבקבוק.
  2. להוסיף יחס 1:2500 (וי/v) של מניות וירוס P1 3.5 לתרבות התליה תא Sf9. תקופת דגירה של הזמן של הביטוי אופטימלית וירוס (בדרך כלל 48-120 ח בהתאם הבונה חלבון) ב 27 ° C ב שייקר מסלולית-115 סל ד.
    הערה: הביטוי יחסי וירוס יכול להיקבע על-ידי הצגת את פלורסצנטיות GFP של הנגיף במדגם של התרבות.
  3. Centrifuge התליה תא למשך 40 דקות ב 11,520 x g ולאסוף את הוירוס P2 המכיל supernatant. לסנן את תגובת שיקוע באמצעות חד פעמיות-0.2 µm מסננים. להוסיף FBS ריכוז סופי של 0.5%.
    הערה: את המניה של P2 וירוס צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C, להיות מוגן מפני אור.
  4. להשיג עם כייל נוגדנים לוירוס P2 באמצעות תאים Sf9easy או מונה וירוס.

5. זיהום של HEK293 בתרבית של תאים עם P2 Baculovirus ביטוי חלבונים בקנה מידה גדול

  1. להכין נפח רצוי של HEK293 בתרבית של תאים ההשעיה תרבות (4-6 L מומלץ להכנה של רשתות קפואים) ריכוז של 3.5-3.8 x 106 תאים למ"ל במדיום הביטוי (ראה טבלה של חומרים) בתוספת 1% (v / v) סטרילי FBS ב Erlenmeyer התחתונה התמלאה תרבות מבחנות בגודל הרצוי.
    הערה: לתרבות ההשעיה, המשמש אמצעי האחסון לא יעלה על 40% מהנפח הכולל של הבקבוק.
  2. הוסף 8% (v/v) של P2 וירוס פתרון מניות מהשלב 4.3 התרבות התליה תא HEK293. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר מסלולית-135 סל ד.
  3. להוסיף butyrate נתרן 10 מ מ 12-18 שעות לאחר הפגיעה. תקופת דגירה של הזמן של ביטוי חלבון אופטימלי (בדרך כלל 36-72 h) ב- 30 ° C.
  4. קציר תאים על-ידי צריך שתוציאו בשביל 20 דקות ב 2,880 x g. רחץ תאים על-ידי resuspending בתוך כ 100 מ ל באגירה טריס תמיסת מלח (TBS) לליטר של תאים שנקטפו. צנטריפוגה שוב למשך 20 דקות ב 2,880 x g ולאסוף בגדר התא.
    הערה: הפרוטוקול עשוי להיות עצר כאן. תא כדורי יכול להיות snap-קפוא חנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס עד טיהור.
    התראה: חנקן נוזלי עלול לגרום כוויות הקפאה או פציעה. הוא עלול לגרום כוויות קור. זה אולי את מקומו של החמצן וגורמות מחנק מהירה. ללבוש כפפות בידוד קר ומגן הפנים.
  5. לאסוף יבול קטן 1 מ"ל בנקודות זמן שונות, solubilize עבור 2 h ב 4 ° C עם נדנדה או ערבוב בנוכחות דטרגנטים שונים ו/או תוספים. דוגמאות קטנות אלה כל-תא solubilized יכול להיות מובהר על ידי ultracentrifugation ב × 235,000 g 10 דקות ב 4 ° C ולהריץ כמדגם 30 μL על עמודה גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות) (ראה טבלה של חומרים) כדי לקבוע את הזמן הטוב ביותר עבור ביטוי ולאחר את התנאים הטובים ביותר solubilization.
    הערה: במקרה של hTRPC3, הקרנת הסרט הזה כלול מאגרים שונים עם ערכי pH מ 4.0-9.5 ו ריכוזי מלח 50-500 מ מ; יצירות יוניים שונים (כגון MgCl2 או NaCl); דטרגנטים שונים בערכי ריכוז (CMC) מיצלה קריטי של 0.1 - 20 מ מ; הפחתת תוספים כגון dithiothreitol, tris(2-carboxyethyl) פוספין ו β-mercaptoethanol; ו הסידן chelating ethylenediaminetetraacetic תוסף חומצה (EDTA).

6. טיהור של חלבון hTRPC3 מ בגדר תא קפוא

  1. הפשרת בגדר במאגר המכיל 20 מ מ טריס (pH 8.0), 500 מ מ NaCl, 1 מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF), 0.8 μM aprotinin, 2 leupeptin μg/mL, 2 מ מ pepstatin A, וקצרו digitonin 1%, באמצעות 100 מ של מאגר לליטר של תאים. ברגע הקרת, ודא ההומוגניות של הפתרון על-ידי pipetting או ערבוב. מאפשרים solubilize עבור 2 h-4 מעלות צלזיוס ב גביע שקוע בתוך קרח עם בר מערבבים מסתובבים.
  2. להסיר את שאריות תאים על ידי ultracentrifugation ב × 235,000 g עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. לאמת כמות החלבון על ידי הפעלת מדגם 30 μL על עמודת שניה (ראה טבלה של חומרים) על ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) ותנסו לדמיין את חלבון המטרה, פלט אות ה-GFP.
  3. דגירה החלבון solubilized (supernatant) עם קובלט שרף אהדה עבור h 1-2-4 מעלות צלזיוס. ודא חלבון מחייב שרף על-ידי הפעלת מדגם μL 30 על עמודת שניה.
    הערה: אם אירעה חלבון מחייב, המטרה חלבון מתויג GFP יישמרו בעמודה, לא נמצא בקובץ הזרימה דרך. לכן, אין קליטה GFP יהיה נוכח במיקום המתאים לגודל חלבון המטרה כאשר הזרימה דרך תופעל ב- HPLC.
  4. לשטוף את השרף עם 10 כרכים עמודה של מאגר (20 מ מ טריס, pH 8.0, 500 מ מ NaCl, 15 מ מ imidazole ו 0.1% digitonin). בדוק אם אובדן חלבון על-ידי הפעלת מדגם μL 30 על עמודת שניה.
    הערה: אם אירעה אובדן חלבון מן העמודה, המטרה חלבון מתויג GFP יימצא במאגר שטיפת שחלפה על פני העמודה. לכן, אות ה-GFP יהיה נוכח במיקום המתאים לגודל חלבון המטרה כאשר המאגר שטיפת תופעל ב- hplc, קורס. אם אירעה אובדן חלבון, הריכוז imidazole של המאגר שטיפת ייתכן שתצטרך תפחת, כדי למנוע שיבוש שלו מחייב תג עמודת זיקה.
  5. Elute את hTRPC3 שרף מכורך עם מאגר (20 מ מ טריס, pH 8.0, 500 מ מ NaCl, 250 מ מ imidazole ו 0.1% digitonin). להוסיף תרומבין 20:1 יחס טוחנת (כדי לבקע את תג ה-GFP), להוסיף 10 מ מ EDTA (סוכן המייצב של hTRPC3) מדגם eluted, תקופת דגירה של h 3-4 מעלות צלזיוס. בדוק כי חלבון יש כבר eluted על ידי הפעלת μL 90 בטחונות מדגם מדולל על עמודת שניה ואימות הנוכחות של אות ה-GFP במיקום המתאים לגודל חלבון המטרה.
    הערה: בשלב זה, טריפטופן האיתות חלבון הכולל • תנאי ניתן גם להציג. רק חלבון מטוהרים זיקה היעד יישאר • תנאי את, את ה-GFP, טריפטופן אותות יהיה ליד זהה בפרופיל. אם החלבון היעד לא ראיתי כמות גדולה ב • תנאי אך לא אבד זרימה דרך או לשטוף, החלבון יש ככל הנראה נותרו מאוגד לעמודה, יכול להיות eluted באמצעות ריכוז גבוה יותר של imidazole במאגר.
  6. לרכז את eluate כדי 500 μL או פחות במסנן צנטריפוגלי 15 mL 100K צינור (ראה טבלה של חומרים) על ידי ספינינג ב 2,880 x g ב 4 ° C במרווחים של 5 דקות. Resuspend החלבון על ידי pipetting הפתרון מעלה ומטה בין מהדורות כדי להימנע overconcentrating.
    הערה: זמן צנטריפוגה עשויים להתקצר האחסון מתקרב האחסון הסופי הרצוי.
  7. לטעון את התרכז על גבי עמודת שניה במאגר (20 מ מ טריס, pH 8.0, 500 מ מ NaCl, EDTA 1 מ"מ ו 0.1% digitonin). הפעל.
  8. לשלב שברים שיא המכיל את tetramer TRPC3 ללא פגע, כמו על ידי אות ספיגת UV, ולרכז שוב כדי ריכוז סופי לפחות 5 מ"ג/מ"ל.

7. ההקרנה של חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שלילית-כתם

  1. הפעל את המכונה זוהר-פריקה. הגדר התוכנית עבור מתרוקנת רשת מצופה פחמן באמצעות ארגון וחמצן לריצה ס' 30 את תוכנית כדי להפוך את הפחמן-הציפוי על רשתות 400-רשת נחושת הידרופילית לפני תוספת של הפתרון חלבון.
  2. הגדרת μL 40 חמש טיפות של מים סטריליים, μL 40 שתי טיפות של 1% uranyl formate פתרון (מעבדה סרט, נייר שעווה או משטח דומה, ראה טבלה של חומרים). . קח את הרשת מהשלב 7.1 ו להוסיף 2.5 μL של חלבון לטעום 5 מ"ג/מ"ל (50-200 μM) אל הצד האפל ולתת לו לשבת במשך 1 דקה.
  3. לאחר 1 דקות, לייבש את רשת נייר סינון. . אל תיגע נייר הסינון ישירות אל פני השטח רשת; במקום זאת, תביא את העיתון על הקצה של ה-droplet נוזלי ולאפשר נימיות למשוך את הנוזל מן הרשת לתוך נייר הסינון.
  4. טבלו את הרשת הראשון בטיפת מים. יבש עם נייר סינון וחזור עם טיפות המים שנותרו, הטיפה הראשונה של uranyl formate. לאפשר הירידה השנייה uranyl לשבת formate עבור 1 דקות, ואז לייבש עם נייר סינון. לאפשר הרשת כדי מלא אוויר יבש (בערך 1 דקות) לפני אחסון.
    הערה: ייתכן פרוטוקול מכתימים זה לא תהיה אידיאלית עבור כל שילובי אבקת חלבון. ריכוזים שונים של uranyl formate כתם, באורכים שונים של זמן חשיפה הכתם צריך להיבדק אם השלבים שלעיל אינם מספקים כתם עם קונטרסט טוב.
  5. תמונה של הרשתות-מיקרוסקופ אלקטרוני (ראה טבלה של חומרים) כדי לבדוק את איכות חלקיק של חלבון. להבטיח כי micrographs להראות חלקיקים רבים כי הם הומוגנית המראה הכללי והפצה, הצג קונטרסט טוב ולאחר תואם לגודל החזוי של החלבון היעד.
  6. צור ראשוני, סיווגים (2D) ברזולוציה נמוכה, מימדי באמצעות micrographs 50-100 (ראה עיבוד נתונים – שלב 10) כדי לבדוק את החלקיקים מייצגים תצוגות שונות של מבנה עקבי יחיד.
    הערה: Micrographs ושיעורי ראשוני 2D באיכות מספיק, כפי שתואר לעיל, הן סימן חזק כי הפרוטוקול מוטבה מספיק לטיהור חלבון. הכנה והקרנת רשתות הקפאה-EM היא מוצדקת בשלב זה.

8. הכנת הדוגמא EM

  1. זוהר-פריקה רשת זהב פחמן חור (ראה טבלה של חומרים) כפי שמתואר בשלב 7.1.
  2. החל μL 2.5 המדגם חלבון מרוכז hTRPC3 (5 מ"ג/מ"ל) על גבי הרשת. כתם ברשת עבור 1.5 s באמצעות אבן חשופה כוח של 1 וזמן המתנה של 5 s ב 100% לחות ו- 4 ° C, ואז מזנקת הרשת אל אתאן נוזל מקורר על ידי חנקן נוזלי, בעזרת מכונה ויטריפיקציה.
    הערה: לחות, טמפרטורה, כתם-כוח, חשופה, וזמן רגע המפורטים כאן שימשו הלימודים מחברי hTRPC319. עליהם להיות שונה כדי לייצר קרח בזגוגית מיטביים אחרים חלבונים וחומרי ניקוי.
  3. מסך קפוא רשתות תנאים אופטימליים קרח באמצעות מיקרוסקופ הקפאה-EM (ראה טבלה של חומרים) באופן ידני תצוגת אזורים של קרח עבה (רשת ריבועים המופיעים קטן וכהה), דק קרח (ריבועים רשת המופיעים גדול יותר ובהיר יותר), בינוני קרח .
    הערה: קרח עבה מחזיקה יותר חלקיקים, לעיתים קרובות בזמן דק מניב לעתים קרובות ניגודיות טובה יותר ורזולוציה. הקרנת תמונות כדי לקבוע אשר קרח ידני שימוש תנאים תוצאות במספר רב של חלקיקים monodispersed עם קונטרסט טוב והרזולוציה. ברגע תנאים טובים מאומתים, להעביר אוסף תמונות במיקרוסקופ הקפאה-EM kV 300.

9. איסוף נתונים EM

  1. באמצעות תוכנית רכישה אוטומטית, להקליט אוספי תמונות במצב סופר סופר רזולוציה עם גודל פיקסל נשברתי של 1.074 Å במיקרוסקופ אלקטרוני המופעל 300 kV עם ההגדלה הנומינלי של 130,000 X לכוון גלאי אלקטרונים.
  2. מינון-fractionate כל תמונה למסגרות 40 עם זמן החשיפה הכולל של 8 s, עם 0.2 s לכל מסגרת שיעור במינון של 6.76 e− Å−2 s− 1 (ערכים defocus בשכבות הנומינלי מגוונות מ 1.0 ל 2.5 μm בניסוי של המחברים).

10. עיבוד נתונים EM

  1. ליישם תנועה תיקון של מסוכם סרט ערימות22 ולהעריך defocus בשכבות ערכים23 שימוש בתוכנת עיבוד נתונים (ראה טבלה של חומרים)24.
  2. לאסוף חלקיקי micrographs. להשתמש אלה בחרה חלקיקים כדי לבנות של סיווג 2D ללא הפניה הראשונית באמצעות תוכנה24. בחר מחלקה 2D אידיאלי הממוצע להשתמש כתבניות עבור איסוף חלקיקים אוטומטיות עבור ערכת הנתונים כולה.
  3. באופן ידני לבדוק את טיב החלקיקים נבחר אוטומטית והסרה של חלקיקים רע. השתמש במספר סבבים של סיווג 2D לנקות את חלקיקי שנאספו.
  4. ליצור מודל ראשוני של25. 2D נושא שבחרו חלקיקים סיווג תלת מימדי (3D) (כ-5 כיתות) באמצעות סימטריה C1 ומסנן נמוך לעבור שחזור ראשוני של 60 Å בתור מודל התייחסות. לקבוע אילו שיעורים יש תכונות ברזולוציה גבוהה ולשלב חלקיקים בתוך מחלקה כזו.
  5. להוסיף ולמקד חלקיקים באמצעות עידון מקומי עם סימטריה C4 (במקרה hTRPC3) חלה והגדר מגבלה ברזולוציה גבוהה של חלקיקים ליישור 4.5 Å26.

11. דגם בניין

  1. לבנות מודל (ראה טבלה של חומרים עבור התוכנה ששימשה). עבור hTRPC3, להשתמש בתחום transmembrane (TMD) של melastatin פוטנציאלי קולטן ארעי 4 (TRPM4) מבנה החלבון בנק מידע (PDB) 5wp6 כמו מדריך27. השתמש שאריות מגושם, חיזוי מבנה שניוני להנחות דה נובו הבניין.
  2. נושא הדגם הראשוני עידון מרחב אמיתי עם מבנה שניוני ריסון28. באופן ידני לבחון את המודל מעודן, remodify כנדרש (ראה טבלה של חומרים עבור התוכנה ששימשה).
  3. החל פורייה מעטפת קורלציה (FSC) עקומות כדי לחשב את ההפרש בין המודל הסופי במפה EM עבור אימות של מבנה מעודן. להעריך את גיאומטריות הדגמים אטומית (ראה טבלה של חומרים עבור התוכנה ששימשה)29,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סקירה סכמטי של הפרוטוקול עבור הביטוי ולטיהור hTRPC3 מוצג איור 1A. תמונה של hTRPC3 bacmid לצלחת עם מושבות לבן אידיאלי, הדומה זה שנבחר עבור טיהור DNA bacmid, מוצג איור 1B. . מצאנו שאת 48 שעות הוא אידיאלי עבור Bluo-גל ברור מכתים תוך שמירה על הנוכחות של מושבות המבודד. שיא הייצור של P2 וירוס עבור hTRPC3, כמו על ידי קרינה פלואורסצנטית GFP, נראתה לאחר 4 d של דלקת בתאי חרקים Sf9 (איור 1C).

P2 baulovirus היה נקצרו מהתקשורת, בתוספת 1% FBS, ומשמש להדביק השעיה של תאים בתרבית של HEK293. נתרן butyrate נוספה כדי הנגועים תאים 12-18 h לאחר הווירוס כדי להגביר את ביטוי חלבון20. התאים היו אז מודגרות עבור h 36 נוספים 30 ° C. התאים היו קוצרים, נתון מסיסות הקרנת יציבות על ידי FSEC (איור 2 א)21. התאים היו solubilized באמצעות שבעה דטרגנטים שונים עם CMC ערכים של 0.01 - 20 מ מ- ריכוז דטרגנט כ 10 פעמים את הערך CMC. לאחר כל תא solubilization, ההריסות פירוק התא הוסר על-ידי ultracentrifugation, תגובת שיקוע המכיל חלבון solubilized היה טעון על עמודת שניה ויפעלו ב- hplc, קורס ב- n-dodecyl-β-D-maltopyranoside/cholesteryl hemisuccinate (DDM/CHS) מאגר המכיל חומרי ניקוי כדי להשוות בין מסיסות מוחלטת והמיקום נפח שיא של hTRPC3 בתנאים שונים ביחס פקד TRPM4 (איור 2B). בחרנו להשתמש DDM/CHS כמו המאגר המצטבר הראשונית כי הדגימות solubilized ב דטרגנטים שונים בגלל DDM/CHS הוא הנפוץ ביותר בשימוש דטרגנט כאשר פותרים את המבנים של חלבוני ממברנה. כל solubilized-חומרי ניקוי TRPC3 דגימות שיא הראה עמדות שונות-על 11.9 mL, אשר ככל הנראה הוא גדול מדי, כי הצורה tetrameric של hTRPC3 יש משקל מולקולרי קטן יותר מאשר החיובי לשלוט TRPM4 האנושית (איור 2A ו- איור 2B).

בכל זאת, כי היה שם אין מבנה של כל קולטן ערוץ TRPC כדי להשוות את התוצאות שלנו כדי וכיוון המשקל המולקולרי גדול עלול להיגרם על ידי הארכיטקטורה של TRPC3 או גורמים אחרים, אנחנו ביצעו הוא לטיהור בקנה מידה קטן של hTRPC3 באמצעות 25 מ ל תאים באמצעות DDM/CHS לאורך כל הניסוי כמו DDM/CHS נתן המסיסות הטוב ביותר של hTRPC3. לפרופיל שניה של hTRPC3 הראתה לשיא monodisperse אבל היה עדיין במצב שיא המייצג של משקל מולקולרי גבוה יותר מאשר TRPM4 (נתונים לא מוצג). בדקנו את החלבון של השבר שיא של שניה פרופיל על ידי EM שלילית-כתם, בגלל זה היא שיטה מהירה של וידוא איכות חלבון. ודורש כמות מאוד קטנה של חלבון. ב micrograph, חלקיקים נצפו עם שני תחומים transmembrane נוכח אותו החלקיק. נראה כי שני חלקיקים hTRPC3 dimerized באופן עפות דרך האינטראקציה בין שני תחומים cytosolic (איור תלת-ממד). לאחר מכן כללנו את הפחתת ריאגנט dithiothreitol (DTT) במאגר טיהור לטיהור בקנה מידה קטן השני, בתקווה לשבש את dimerization של hTRPC3. אכן, השנייה לשיא עם משקל מולקולרי נמוך הופיע על ידי שניה fractionation. עם זאת, החלקיקים נראה קטן מדי כדי להיות tetramer ללא פגע והראו אין תכונות של קרום חלבונים כגון תחום transmembrane. התברר כי DDM/CHS איננה חומר ניקוי מתאים לטיהור hTRPC3, נותן המסיסות הטוב ביותר עבור hTRPC3.

הבא, אנו ניסינו digitonin דטרגנט, מתון יותר, כדי solubilize hTRPC3, לעומת זה החלבון solubilized ב DDM/CHS. כאן השתמשנו שני מאגרים פועל שונים המכילים DDM/CHS ו- digitonin, בהתאמה. זה היה חשוב בהתחשב בכך הנוזל במאגר פועל לעיתים קרובות תורמת חלבונים יציבות ואת החלבון ממברנה שעלולים להיות יציבה בעת שינוי של דטרגנטים מ- solubilization ל- FSEC. החלבון להפעיל מאגר המכיל digitonin הראה משמרת השיא מבטיח לקראת משקל מולקולרי נמוך יותר כאשר solubilized DDM/CHS או digitonin. החלבון solubilized על ידי ויפעלו ב- digitonin הניבו הפסגה הגבוהה ביותר במצב סביר ביחס המיקום של הפקד חיובי, TRPM4 האנושית (איור 3 א). ואז עברנו הלאה על ידי ביצוע טיהור בקנה מידה קטן באמצעות 25 מ של תאים. למרות מרובים, פסגות רחבה נצפו על ידי שניה (איור 3B), החלבון הראו תכונות של ערוץ יחיד hTRPC3 tetrameric סיווג 2D על ידי EM שלילית-כתם (איור 3C ו- 3D איור). נסיים ש-digitonin הזה הוא דטרגנט אידיאלי לטיהור hTRPC3.

קנה המידה את הביטוי של hTRPC3 ואנו שבוצעה הוא לטיהור בינוני בקנה מידה באמצעות 400 מ של תאים ב- digitonin. בעשותם כך, קיווינו לקבל את החלבון מספיק עבור כמה רשתות הקפוא מבלי לבזבז בינונית, דטרגנט לפני הבנו את התנאים הסופי לטיהור hTRPC3 בקנה מידה גדול. זה קורה לעיתים קרובות כי קרום חלבונים מראים חוסר יציבות כאשר מרוכז מאוד עבור הכנת רשתות קפוא. חלבון מטוהרים ומרוכז לא רק זז לכיוון משקל מולקולרי גבוה יותר FSEC, אבל הראה גם רקע רועש ברשתות הקפאה-EM עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני מצויד עם מצלמת EMCCD. למרות שהיינו מסוגלים להבחין יחיד, ללא פגע רצפטורים tetrameric, hTRPC3 טהור ב- digitonin לא היה אידיאלי ללימודי הקפאה ברזולוציה גבוהה-EM.

כדי לשפר את יציבות החלבון, הוקרנו מספר רב של מצבים המתוארים פרוטוקול שלב 5. אנחנו בחרנו תוספים מסך מבוסס פיזיולוגית אופייה של hTRPC3; למשל., EDTA נבחר משום hTRPC3 הוא חדיר כדי סידן הסרת הסידן עשויה לייצב את החלבון. של כל הדגימות שנבדקו על-ידי FSEC םילעופה מאגר המכיל digitonin, 10 מ מ EDTA הראה השפעה מדהימה על ייצוב hTRPC3 במצב תקין שיא tetrameric (איור 4A). זה משמעותי גם הגדילה את מספר החלקיקים micrograph הקפאה-EM וירידה הרעש ברקע, כמוצג באיור5.

לאחר שזוהו תנאים אידיאליים ביטוי וטיהור, ביצענו ביטוי בקנה מידה גדול (2 ליטר) של hTRPC3. התאים המכילים hTRPC3 היו קוצרים, ואז solubilized. מובהר ultracentrifuge lysate היה נתון טיהור מתכת-זיקה עמודה על-ידי איגוד אצווה עם שרף קובלט ואחריו טיהור בעמודה הכבידה. שימור של חלבון solubilized בתוך העמודה של • תנאי של חלבון מטוהרים זיקה מהעמודה אומתה על ידי FPLC (איור 4B). מצאנו כי עבור hTRPC3, ריכוז imidazole 15 מ מ במאגר שטיפת מספיקות להסרת חלבונים מזהמים עם איגוד לא ספציפית שרף והיה 250 מ מ imidazole במאגר • תנאי מספיק כדי elute את רוב solubilized hTRPC3 החלבון קשור השרף. כל הדגימות שנבדקו על ידי FSEC, החלבון eluted הגיע לשיא monodisperse חד, במיקום הנכון. שיא. כמו מהותי גמישות בין התג GFP החלבון hTRPC3 עלולה להפוך את היישור של חלקיקי חלבונים במהלך עיבוד מאתגרת יותר, תמונה, כי אתר המחשוף תרומבין ממוקם בין ה-GFP hTRPC3, בדקנו כמות קטנה של מטוהרים חלבון-המחשוף שונים זמני באמצעות תרומבין פרוטאז. נתון כי החלבון eluted מודגרות עם תרומבין ב- 1:20 יחס טוחנת הראה המחשוף מלאה והיציבות סביר לאחר 2 h ב 4 ° C, אנחנו שהבקיע את ה-GFP מן כל חלבון מטוהרים משתמש באותם התנאים ונבדק על-ידי HPLC כדי לאשר כי GFP כבר c ompletely הסיר (איור 4C). החלבון היתה מטוהרת עוד יותר על-ידי S, שוב, ניתן לאבחן את המחשוף של GFP מאת משמרת עמדה שיא לקראת משקל מולקולרי קטן יותר (איור 4D). מדגם unconcentrated קטן מן השבר שיא הראשי שימש כדי להפוך את רשתות עבור EM שלילית-כתם. לאחר מכן, כל שברים המכיל את hTRPC3 tetrameric היו בשילוב, reconcentrated כדי ריכוז הסופי של 5 מ"ג/מ"ל, אשר שימש להכנת רשתות עבור הדמיה הקפאה-EM. כפי שצפינו בה את החלק הזה של החלבון עדיין בהדרגה נע לעבר מולקולרית משקל גדול יותר, אנו נאספים רק שברים בתחום הנורמלי מולקולרית, הקפיאו את הרשתות מיד לאחר טיהור חלבון. אנחנו בדרך כלל להשלים את הרצף של ניסויים של טיהור של חלבון כדי הכנת רשתות קפוא בתוך יום אחד.

מדגם 2.5 μL של חלבון מטוהרים hTRPC3 (ריכוז 5 מ"ג/מ"ל) הוחלה על גבי רשת משוחררים-זוהר פחמן חור. מכונת ויטריפיקציה השתמשו כדי להכין את הרשת, 1.5 s סופג הזמן מתחת 100% לחות ואחריו לצלול לתוך אתאן נוזל מקורר על ידי חנקן נוזלי. שלב זה מקפיא את הדגימה לתוך הקרח בזגוגית עבור הדמיה. תמונות נלקחו בשבי-130,000 X הגדלה נומינלית ע י מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה פעלו 300 kV. אוספי תמונות נרשמו ברזולוציה סופר-סופר מצב עם גודל פיקסל נשברתי של 1.074 ערך נומינלי defocus בשכבות Å ו- a ועד 2.5 μm באמצעות גלאי אלקטרונים ישירה 1.0 ו אוטומטי רכישת התוכנה. כל תמונה היה fractionated במינון 40 מסגרות עם זמן החשיפה הכולל של 8 s (0.2 s לכל מסגרת) ושיעור במינון של 6.76 e− Å−2 s−1. מיקרוסקופ נציג מבסיס הנתונים מוצג באיור5.

תיקון תנועה והשערוך defocus בשכבות הערכים של המחסן סרט מסוכם בוצעה. כ-200 micrographs וכתוצאה מכך שימשו כמקור איסוף חלקיקים ידנית, ללא התייחסות 2D הסיווג הראשוני31. תשעה נציג מחלקת 2D ממוצעים של סיווג ראשוני זה היו שנבחרו, שמשמשים כתבניות עבור איסוף חלקיקים אוטומטיות עבור ערכת הנתונים כולה. סימון ידני של חלקיקים autopicked בוצע כדי להסיר חלקיקים ברור רע, ואז שלושה סבבי סיווג 2D הוחלו למקד את הבחירה של חלקיקים autopicked (איור 5). החלקיקים 2D-class שנבחרו היו מסווגים חמשת המעמדות תלת-ממד באמצעות נמוך-pass-מסנן של 60 Å כמודל הפניה הראשונית. של אלה חמשת המעמדות, היחידה להציג תכונות ברזולוציה גבוהה (איור 5). חלקיקים מהסמינר הזה היו נתונים נוספים עידון מקומי עם מגבלה ברזולוציה גבוהה של 4.5 Å והחלת C4 סימטריה (איור 5)32. המודל מעודן באופן ידני וצילומי remodified. המבנה מעודן אומתה על ידי חישוב של עקומות FSC כדי לקבוע את ההבדל בין המודל הסופי לבין EM מפה ועל ידי הערכת גיאומטריות מודלים אטומי33.

המודל הראשוני הבנייה בוצעה באמצעות המחשבים TMD של המבנה TRPM4 (PDB 5wp6) כמו מדריך34. דה נובו בניית המודל של hTRPC3 בעיקר מונחית על ידי משקעים מגושם, חיזוי מבנה שניוני, עם helices α רבים במבנה להקל מאוד הקופה הקצאה. ב הראשונית דה נובו-נבנה מודל, הסדר, אורך, והמיקום של תכונות מבניות המשני, ומשקעים מגושם הם בהסכם קרוב עם התחזית. במהלך עידון, הרזולוציה, נערך מגבלה נמוכה יותר מאשר הרזולוציה המשוער את השיקום הסופי. FSC תלת מימדי שימש כדי למדוד את מקדם מנורמל קרוס-המתאם בין שתי מפות 3D שנוצר באופן עצמאי (כל באמצעות חצי של ערכת הנתונים) מעל צדפים המתאימים במרחב פורייה (כפונקציה של תדירות מרחבית). אנחנו מועסקים מסכה רכה של 4.3 Å מן השחזור של 4.3 נוספים Å רך קוסינוס קצוות ביחד עם מסנן נמוך לעבור 10, אז בשימוש תקן הזהב FSC 0.143 הסף הקיצוץ. זה שימש לדיווח ההחלטה הסופית.

Figure 1
איור 1: ביטוי וטיהור של hTRPC3 באמצעות מערכת BacMam. (א) הליך סכמטית hTRPC3 ביטוי וטיהור. (B) Bacmid הבחירה המושבה בצלחת מחוון כחול-לבן. לבחור מבודדים לבן המושבה (חץ שחור), לא מושבה לבנה עם המושבה כחול מוטבע או מושבה לבנה עם מושבה כחול (חצים אדומים). (ג) GFP זריחה של P2 baculovirus ב Sf9 תאים תחת 20 X הגדלה. קרינה פלואורסצנטית צריך להיות נוכח על קרום התא ו/או את הפנים של רוב התאים וירוס חזק מוארים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הקרנת יציבות של hTRPC3 מאת FSEC. (א) דטרגנט הקרנת הסרט hTRPC3. HTRPC3 היה שלם-תא solubilized במגוון של חומרי ניקוי עם ריכוז קריטי מיצלה של 0.01 - 20 מ מ, הופעל DDM/CHS-המכיל מאגר. למרות DDM/CHS מראה המסיסות הגבוהה של hTRPC3, הפסגה מופיע במיקום הלא נכון, גדול מדי כדי להיות hTRPC3 tetrameric (כחול מעקב). (B) שליטה TRPM4, עם tetrameric מולקולרית משקל של 540 kDa, solubilized ומנוהל ב DDM/CHS, היה אמצעי • תנאי של-12.9 mL, בעוד TRPC3, עם tetrameric מולקולרית משקל של-400 kDa, solubilized ולהפעיל ב- DDM/CHS, היה אמצעי • תנאי של 11.9 מ. עם משקל מולקולרי קטן יותר, יהיה צפוי hTRPC3 יש אמצעי • תנאי מעט גדול יותר TRPM4, לא מעט קטן יותר, רומז כי לא ייתכן DDM/CHS דטרגנט אידיאלי עבור hTRPC3 solubilization וטיהור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: דטרגנט מאגר הקרנת hTRPC3 מאת FSEC. (א) מסיסות ויציבות המבחן של hTRPC3 באמצעות digitonin. Digitonin נבחנה הן solubilization והן בניהול מאגר. שימו לב המיקום שיא של חלבון hTRPC3 solubilized ב digitonin נע לעבר נפח • תנאי גדול יותר בהשוואה החלבון solubilized ב DDM/CHS (מעקב צהוב לעומת כחול ואדום עקבות). רק השילוב באמצעות digitonin במאגרי solubilization וריצה מראה בגודל הנכון של hTRPC3 על ידי FSEC (מעקב צהוב, כוכבית). בדומה התוצאות FSEC של hTRPC3 solubilized תאים שלמים, המיקום שיא של hTRPC3 זיקה חלבון מטוהרים ב- digitonin (זכר אדום, 14 מ"ל) נע לעבר נפח • תנאי גדול יותר בהשוואה בזיקה חלבון מטוהרים ב- DDM/CHS (כחול (B) מעקב אחר, 12 mL) כפי שהיא נמדדת שניה-fractionation. (ג) שלילית-כתם EM שימש כדי לוודא את איכות חלבון מטוהרים לפני איסוף נתונים הקפאה-EM. הכתם אידיאלי צריך להציג חלקיקים (עיגולים אדומים) באופן שלילי צבעונית (הופעה לבן), ומוקף טבעת דטרגנט (הופעה שחור). נציג micrograph אידיאלי שבו חלקיקים אלה הם בשפע, monodispersed, נוכח אוריינטציות מרובים מוצג. (ד) איכותיים מנתונים EM שלילית-כתם צריך לספק מחלקות 2D עם ארכיטקטורה כללי ברור ועקבי ואת צריכה להקיף אוריינטציות מרובים של החלבון, עם ממוצעים הכיל וממורכז בתוך המסיכה (עיגול שחור). מחלקות 2D מ שלילית-כתם EM micrographs של hTRPC3 solubilized ב חלקיקים נוכח DDM/CHS הנראים dimerization ראש בראש של מונומרים hTRPC3. לעומת זאת, קשה (אבל ברור ועקבי) בסך הכל בלוט tetrameric מבנה דמוי בולטת בכיתות 2D מ שלילית-כתם EM micrographs של hTRPC3 solubilized ב digitonin. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: טיהור של hTRPC3. יציבות (א) בדיקה של hTRPC3 בנוכחות EDTA. hTRPC3 היה solubilized ב digitonin ב נוכחות (trace אדום) או היעדרות (כחול trace) 10 מ מ EDTA. לשעבר הגיע לשיא יחיד, צר יותר במיקום חלבון tetramer (זכר אדום, כוכבית), המציין כי EDTA התייצב hTRPC3 קונפורמציה tetrameric שלה. קרינה פלואורסצנטית (B) GFP לאותת FSEC hTRPC3 solubilized ב digitonin ולהפעיל במאגר digitonin. הפסגה tetramer הוא ציין בחומר solubilized לפני טיהור מתכת-זיקה עמודה (מעקב כחול, כוכבית). העדר זה שיא של השבר זרימה דרך מציין איגוד מלאה של החלבון hTRPC3 בעמודה זיקה (trace אדום). לאחר • מאת imidazole תנאי, השברים של הפסגה • תנאי שנבדקו על-ידי FSEC (trace ירוק). כל השברים מציג ללא פגע tetramer שיא נאספו לטיהור עוד יותר. (ג) במבחן ה-GFP המחשוף של hTRPC3 באמצעות תרומבין. זמן עיכול נבדקה באמצעות כמות קטנה של חלבון ב 4 ° C, שלמות התרגום של עיכול נבדקה על-ידי FSEC. כל המחלקה, הפסגה בצד השמאל תואם לפסגת tetramer hTRPC3 (כוכבית), הפסגה מימין היא הפסגה GFP חינם. כמו אורך העיכול מוגברת, היחס בין חלבון tetrameric לשחרר GFP ירד, המציין כי היה להיות ביקע GFP מן החלבון. העיכול 2 h מראה של פצילות מלאה של GFP. פרופיל (D) שניה של hTRPC3 לפני או לאחר עיכול תרומבין ב digitonin המכיל הפעלת מאגר עם 10 מ מ EDTA נוסף. כצפוי, המיקום שיא נע לעבר האחסון • תנאי קטנים יותר לאחר עיכול תרומבין (trace אדום). הפסגה המרכזית (כוכבית) מייצג את hTRPC3 tetrameric. השברים בין הקווים האדומים נאספו לניסויים הקפאה-EM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: סכימטי של איסוף נתונים הקפאה-EM ועיבוד עבור hTRPC3. האוסף של הסרט 3,660, ערימות מטוהרים hTRPC3 נעשה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני עם גלאי אלקטרונים ישירה. תיקון תנועה, בחירה ידנית הוחלו וכתוצאה מכך 3,580 micrographs. חלקיקים autopicked, נתון סיווג 2D. מחלקות 2D היו זיקוק נוסף לפי סיווג תלת-ממד. רק אחד מתוך חמישה שיעורים תלת-ממד להציג תכונות ברזולוציה גבוהה. מחלקה זו נבחרה עבור עידון 3D ועידון המקומי Frealign, וכתוצאה מכך מבנה עבור hTRPC3-3.3 רזולוציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

קביעת מבנה של חלבונים על ידי הקפאה-EM יש מהפכה בתחום ביולוגיה מבנית בשנים האחרונות, בזכות הפיתוח של מצלמות חדשות ואלגוריתמים המזרזת באופן משמעותי את קביעת מבנה של חלבונים שאינם ברצון crystalize, במיוחד קרום חלבונים. למרות כל התפתחויות אחרונות טכניקת הקפאה-EM, הכנת מספקות איכות וכמות מטוהרים חלבונים כדי להקל על הדמיה לעיתים קרובות באיכות גבוהה נשאר גוזלת זמן יקר, מאתגר. היכולת לבטא במהירות ואת המסך גנים מרובים בונה תחת מגוון תנאים טיהור, כמתואר לעיל, הפרוטוקול משפר את היעילות של תהליך זה בכך שהוא מאפשר ייצור מהירה וחסכונית באיכות גבוהה חלבון מטוהרים לשימוש במחקרים הקפאה-EM.

בעוד השיטה המתוארת כאן מספק דרך לטהר את כמויות גדולות של קרום יונקים חלבונים בעלות פחות מאשר על ידי תרביות תאים ישירה במהירות רבה יותר מאשר על ידי הדור של קו תא stably transfected, יש שלבים רבים, שכל אחד מהם חייב להיות מותאם כדי לספק תשואה חלבון באיכות גבוהה. בתוך טכניקות הביוכימי השתמשו כדי לייצר ולטהר hTRPC3, ישנם מספר שלבים קריטיים, מחסומים. קריטי המחסום הראשון הוא הייצור של bacmid ה-DNA. כפי שמתואר בתוצאות, הבחירה האידיאלית המושבה היא הצעד הראשון בדור של וירוס איכות עבור ביטוי חלבון. בנוסף, אם הריכוז של ה-DNA bacmid מטוהרים מהמושבה שנבחר μg פחות מ- 1/μL, הווירוס וכתוצאה מכך לא תהיה מספיק עבור ביטוי חלבון חזקים. המחסום הקריטי השני הוא הייצור של baculovirus P1 ו- P2. כייל נוגדנים וירוס להיות מוערך על-ידי קרינה פלואורסצנטית GFP, כפי שמוצג באיור 1C או ניתן למדוד כפי שתואר על ידי קולמן. ואח 35. בנוסף כייל ויראלי, קורס זמן של זיהום זמן צריך להתבצע עבור כל מבנה חדש לקבוע את הזמן האופטימלי של זיהום לביטוי מקסימלי חלבון. עמדה ביקורתית שלוש הוא מסיסות הקרנת יציבות באיור 2. חומרי ניקוי עם CMC גבוהה, כגון DDM, עשוי לספק מסיסות גבוהה, אך הם אינם אידיאליים עבור הקפאה-EM הדמיה כי הם עלולים לגרום שפע של מזהם הקזאין. חומר ניקוי מתון יותר, כגון digitonin, יכול לספק מספיק מסיסות תוך שמירה על יציבות החלבון. ההקרנה של תוספים, כגון EDTA במקרה של hTRPC3, חשוב עבור גילוי מצב טיהור זה מתבטא חלבונים שלמים ולא הומוגנית, כנראה על-ידי הסרת הסידן hTRPC3, אשר הוא חדיר כדי סידן. קריטי מחסום ארבע הוא את האימות של חלבון ספציפי ויעיל לכידת במהלך הטיהור עמודת זיקה את ההתבוננות שיא חלבון אידיאלי במהלך שניה-fractionation (איור 4). הימנעות של ההכללה של זיהום חלקיקי חלבונים תוך שמירה על כל החלבון יעד חיוני להשגת תשואה מספיק גבוה של חלבון לדימות הקפאה-EM. שינוי זמן אצווה-האיגוד לבין יחס של שרף לחלבון solubilized יכולים לסייע בשיפור השמירה חלבון לפי העמודה שרף. האיכות הכוללת של הפסגה שניה-fractionation הוא מניסיוננו הסימן הכי טוב, לפני הדמיה, של איכות חלבון מטוהרים חלקיקים. נמוך או לשיא רחב במהלך שניה-fractionation מציין בעיות אפשריות של חלקיקי חלבונים מעט מדי לכל תמונה או הנוכחות של חלבון מזהמים מוצרי צבירה/השפלה, בהתאמה. בנוסף, שינויים התג זיקה הבונה עצמה הוכיחה נחוץ במקרים מסוימים כדי להבטיח מספיק מחייב זיקה-תג. המחסום האחרון לפני אוסף של ערכות נתונים הקפאה-EM הוא האימות של חלבון באיכות החלקיק על ידי EM שלילית-כתם. אמנם לא הכרחי, אנו מוצאים כי זה מספק הזדמנות מצוינת בעיות איכות חלבון ספוט ונכון לפני השקעה בתהליך ואת עלות-אינטנסיבית של איסוף נתונים על ידי הקפאה-EM.

שיטה חלופית אחת של ייצור חלבון ללימודי מבניים הקפאה-EM הוא הטיהור ישירה של חלבון ממקור רקמה מקורית. שיטה זו לעיתים קרובות נתקל בבעיות עם חלבון תשואה, זה חלופה מצוינת עבור חלבונים שאינם נמצאים בשפע מאוד בתאים או שקיימים כחלק ממתחם חלבון רב גדול, אשר יכול להיות קשה כדי לייצר באמצעות ביטוי רקומביננטי מערכת36. עם זאת, חלבונים יחיד באה לידי ביטוי בכמות בינונית או נמוכה בתנאים הפיזיולוגיות, מערכת טיהור וביטוי המובאת כאן היא יעילה, שיטה יחסית נמוכים, לתפוקה גבוהה לייצור מטוהרים חלבון ממברנלי יונקים ללימודי מבניים הקפאה-EM. שיטה אחת יכול להשלים בחום זה המובאת כאן היא בנייתו מחדש של חלבון מטוהרים לתוך nanodiscs השומנים לפני הקפאה-EM נתונים אוסף37. לפי שיטה זו, החלבונים הם המוטבעת לתוך דיסק קטן של שכבה ליפידית, כנראה מספק של microenvironment כמו מקורי לעומת הקזאין דטרגנט, למרות שאין שום ראיה כה המבנים מומס דטרגנט, nanodisc הם 39,שונים38,40. גישה אחרת היא לחלץ את החלבון ישירות באמצעות פולימרים amphipathic כמו styrene maleic אנהידריד (SMA), אשר שימש בהצלחה לקביעת ממברנה חלבון מבני41,42.

גישות אלה המתוארים בכתב יד זה הוכיחו דע ברצון במעבדה שלנו מציע מגוון רחב של חלבונים ממברנה יונקים אחרים מעבר תעלות יונים. לכן, אנו מאמינים שפרוטוקול זה יהיה כלי רב ערך ב הבדיקות פונקציונלי מבניים העומדים בבסיס תכנון תרופות יישוב גבוהה-ירידה לפרטים. זה יהיה שימושי במיוחד מחלות ניווניות מחלות לב וכלי דם, סרטן, יון אילו ערוצים הם סמים קשה אך בעלי פוטנציאל מטרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים ג'י זאו, אקס מנג לתמיכה באיסוף נתונים ב דוד ואן אנדל מתקדם הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ Suite. אנו מעריכים את הקבוצה VARI מחשוב עם ביצועים גבוהים עבור תמיכה חישובית. אנחנו נותנים את הכרת התודה שלנו כדי ש קלמנטה, דמי ד, ג' Floramo, הואנג י', י' קים, מולר ג, רוט נולד ב ו צ Ruan עבור הערות השתפרה מאוד כתב היד הזה. אנו מודים Nadziejka ד על העריכה תמיכה כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי VARI פנימי מימון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent - to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Tags

ביוכימיה גיליון 143 תעלת יונים חלבון ממברנלי טיהור חלבונים מבנה נחישות הקפאה-מיקרוסקופ הקפאה-EM baculovirus
הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun,… More

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter