Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse van Shear Flow-geïnduceerde migratie van RattenUitrustingen Marginal Zone B cellen In Vitro

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58759
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry and Cell Biology, OVGU University of Magdeburg

Summary

Marginaal zone B cellen (MZBs) reageren op de kracht van shear stroom door heroriëntering op hun migratiepad van de stroom. Dit protocol laat zien hoe om te registreren en analyseren van het migratie met behulp van een fluidics eenheid, pomp, Microscoop imaging systeem en vrije software.

Abstract

Marginaal zone B cellen (MZBs) zijn een bevolking van B-cellen die zich bevinden in de muis milt marginale zones die follikels omhullen. Om de follikels te halen, moet MZBs migreren van de shear kracht van de bloedstroom. Wij presenteren hier een methode voor het analyseren van deze stroom-geïnduceerde MZB migratie in vitro. Ten eerste, MZBs zijn geïsoleerd van de milt van de muis. Ten tweede, MZBs zijn verrekend op integrine liganden in flow kamer dia's blootgesteld als u wilt schuintrekken stroom en beeld onder een Microscoop tijdens de migratie. Ten derde, beelden van de migratie MZBs worden verwerkt met behulp van de automatische cel van MTrack2 plugin voor ImageJ bijhouden, en de resulterende cel tracks worden gekwantificeerd aan de hand van de Ibidi chemotaxis tool. De migratiegegevens onthullen hoe snel de cellen verplaatst, hoe vaak ze richting wijzigen of de shear stroom vector is van invloed op de richting van hun migratie en welke integrine liganden zijn betrokken. Hoewel we MZBs gebruiken, kan de methode gemakkelijk worden aangepast voor het analyseren van de migratie van eventuele leukocyte die op de kracht van shear stroom reageert.

Introduction

Immune cellen zijn de meest motile cellen in het menselijk lichaam en vaak moeten vechten met schuintrekken kracht van de stroom van bloed en lymfe. Er zijn echter relatief weinig studies over schuintrekken kracht-geïnduceerde migratie van leukocyten1,2,3,4,5. Wij presenteren hier een betrouwbare en kwantitatieve protocol om te analyseren van de reactie van een immuun cel op stroom in vitro. Uitvoeren van de test vereist geen fabricage van onderdelen, en alle apparatuur en verbruiksartikelen zijn commercieel verkrijgbaar. Het protocol, met inbegrip van cel zuivering en migratie analyse, kan worden uitgevoerd in een enkele dag. Ten slotte, hoewel we beschrijven de migratie van marginale zone B cellen (MZBs), het protocol kan aangepast worden voor het analyseren van migratie tegen stroom van andere soorten immuuncellen. Daarom is het haalbaar is om met deze test kunt u systematisch analyseren een breed scala van leukocyten met een uitgebreid panel van voorwaarden.

MZBs zijn een bevolking van B-cellen, die in de muis, alleen in de milt en de shuttle gevonden worden tussen het interieur van de follikels en de marginale zones6,7,8,9. De marginale zone is een laag van immune cellen ongeveer 5-10 cellen dik. De cellaag omhult de follikel en bestaat voornamelijk uit MZBs en macrofagen maar ook invariant natuurlijke killer T (iNKT) cellen, dendritische cellen (DC's) en neutrofielen, o.a.10. De cellen in de marginale zone worden blootgesteld aan unidirectionele bloedstroom afkomstig van milt slagaders die uitkomen in een marginale sinus rondom de follikel. Het bloed stroomt uit gaten in de marginale sinus via de marginale zone en vervolgens verzameld in veneuze sinussen in het rood vruchtvlees en teruggezet naar de omloop11. De vrije stroom van bloed wast over de MZBs en hen blootstelt aan antigenen in het bloed vervoerd. De MZBs voeren het antigeen in de follikel door automatisch pendelen tussen de marginale zone en binnenkant van de follikel, die niet is blootgesteld aan bloed. Dus, als MZBs shuttle naar de follikel, moeten ze migreren van de shear kracht van de bloed stroom12 (figuur 1A).

In dit protocol, beschrijven we het kwantitatief bepalen hoe immuun cellen zoals MZBs reageren op geen stroom of de hoge stroom in vitro, om te laten zien hoe ze zijn geprogrammeerd om te migreren van in vivo. MZBs zijn in de eerste stap gezuiverd van de milt van een muis met behulp van magnetische kralen gekoppeld aan antilichamen van commercieel beschikbare kits. De vers geïsoleerde MZBs zijn ingevoerd in het putje van een stroom kamer dia, toegestaan om af te wikkelen naar integrine liganden en blootgesteld aan de stroom van migratie buffer met behulp van een pompsysteem (figuur 2A). De cellen zijn beeld met behulp van een systeem van tijd-tijdspanne videomicroscopie. De beelden worden vervolgens verwerkt voor de analyse met een gratis ImageJ plugin, MTrack213,14, automatisch bijhouden van de cellen. Tracks kunnen vervolgens worden gekwantificeerd met de gratis Ibidi Chemotaxis gereedschap15 verschillende parameters zoals snelheid, rechtheid en migratie index bepalen. Deze waarden kunnen worden gebruikt om te bepalen van de gevolgen van migratie remmers, cel stimulatoren chemokines en andere migratie-op het gebied van chemische stoffen voor de migratie van de shear-flow geïnduceerde om te begrijpen van de krachten die immuun cel beweging in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten waarbij dieren worden gebruikt zijn eerder overeenkomstig goedgekeurd door de Landesverwaltungsamt Halle (Saksen-Anhalt), Duitsland, alle richtsnoeren van de medische faculteit van de Universiteit van de OVGU van Maagdenburg.

1. MZB cel zuivering

  1. Isoleren van leukocyten.
    1. Offeren een 8 tot 16 weken oude muis en verwijderen van de milt16. Distantiëren van de milt in 5 mL ijskoud cel buffer [-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 0,5% vetzuur-vrije bovien serumalbumine (BSA)], door met behulp van de dissociator van een weefsel of zachtjes stampen de milt door middel van een 70 µm cel zeef maaswijdte in een put op een plaat van 6-well met de zuiger van een injectiespuit 5 mL.
    2. De cellen in de cel buffer Breng in een conische tube van 15 mL. Extra cellen verzamelen door toevoeging van een andere 5 mL van de ijskoude cel buffer naar de weefsel dissociator buis of de nylon gaas in de put. Breng de extra 5 mL van de cel buffer plus cellen de conische buis. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT, 20 ° C) en verwijder het supernatant.
  2. Uitvoeren van lysis van de rode bloedcellen.
    1. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL rode bloedcellen (RBC) lysis-buffermengsel (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA) thats voorverwarmde RT. toevoegen een extra 1,5 mL lysis-buffermengsel van RBC en wervelen om te mengen. Incubeer bij RT (20 ° C) voor een totaal van 2 min, met inbegrip van de benodigde tijd voor resuspendeer de pellet.
    2. 7,5 mL ijskoud cel buffer aan de celsuspensie om te stoppen met de lysis toevoegen. Centrifugeer bij 300 x g - en 4 ° C gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
    3. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL van de cel buffer en voeg een extra 9 mL van de cel buffer. Pipetteer de 10 mL celsuspensie door een 30 µm pre scheiding filter in een nieuwe conische tube van 15 mL verwijderen cel puin.
    4. Centrifugeer cellen bij 300 x g - en 4 ° C gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van de cel buffer. Houden cellen koud in alle volgende stappen van de procedure tot incubatie in de flow kamer dia's.
  3. Zuiveren van MZBs.
    1. 50 µL van biotine-coupled antistoffen uit een commercieel beschikbare kit tegen alle ongewenste cellen, met inbegrip van CD43 (bij niet-B-cellen), CD4 (op T-cellen), CD93 (bij onrijpe B-cellen) en Ter119 (op erytrocyten), toevoegen aan de celsuspensie in een conische buis. Schud of flick de tube zachtjes te mengen, maar niet niet vortex de cellen. Leg de conische buis op een bedje van ijs in een hoek van bijna-flat en rock bij 25 omwentelingen per minuut gedurende 15 minuten.
    2. Magnetische kralen gekoppeld aan anti-Biotine antilichamen in een totaal volume van 100 µL aan de celsuspensie toevoegen. Blijven rock van de celsuspensie 25 rpm op het ijs gedurende 20 minuten wassen de cellen door toevoeging van 5 mL van de cel buffer, bij 300 x g centrifugeren en 4 ° C gedurende 10 minuten, en het supernatant te verwijderen. Resuspendeer de cellen in 1 mL van de cel buffer.
    3. Het afbreken van de celsuspensie van de magnetische-kraal-gekoppelde cellen door behoud van hen op een magnetische kolom. Discard label cellen (alle cellen van de niet-B en onvolwassen B-cellen). Het verzamelen van de niet-geëtiketteerden cellen (volwassen B-cellen) in een conische tube van 15 mL die al vooraf gecoat met een korte toepassing van 5 mL van de cel buffer, om te voorkomen dat niet-specifieke hechting door MZBs.
    4. Wassen van de celsuspensie met 5 mL van de cel buffer. Centrifugeer bij 300 x g - en 4 ° C gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 90 µL van de cel buffer en voeg 10 µL van anti-CD23-coupled parels. Rock celsuspensie zachtjes op het ijs gedurende 20 minuten bij 25 omwentelingen per minuut.
    5. Wassen van de celsuspensie met 5 mL van de cel buffer. Centrifugeer bij 300 x g - en 4 ° C gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 1 mL van de cel buffer.
    6. Het afbreken van de celsuspensie van de magnetische-kraal-gekoppelde cellen door behoud van hen op een magnetische kolom. Gooi de gelabelde cellen (folliculaire B-cellen). Het verzamelen van de niet-geëtiketteerden cellen (MZBs), in een conische buis van 15 mL, die vooraf heeft zijn bedekt met een korte toepassing van 5 mL van de cel buffer. Verwijder 50 µL van de cellen voor het tellen en controleren van zuiverheid.
  4. Vlek de gesorteerde MZBs om te controleren op de zuiverheid.
    1. 10% volume (5 µL) van Fc blok toevoegen aan 10.000 cellen in 50 µL en Incubeer bij 4 ° C gedurende 5 min. Voeg 50 µL van met 0,3 µL van B220-FITC van de cel buffer (0,15 µg), CD21-PE (0.06 µg), en CD23-APC (0.06 µg) in een totaal volume van 105 µL (elke antilichaam verdund-1:350) , of een andere combinatie van fluorophores voor onderscheid te maken tussen de folliculaire B-cellen en MZBs. vlek de cellen bij 4 ° C in het donker gedurende 15 minuten.
    2. Wassen van de gekleurde cellen een keer met 1 mL van de cel buffer. Centrifugeer bij 300 x g- en 4 ° C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer in 300 µL van de cel buffer en het verwerven van de monsters met behulp van een cytometer van de stroom en standaardmethoden. Poort op levende lymfocyten en vervolgens op B220+ cellen, en tot slot op CD23lage CD21hoge cellen (figuur 1B).
      Opmerking: De procedure levert meestal 500.000 MZBs per milt van de muis van een C57B/6.
  5. Voorbereiden MZBs voor de migratie van de stroom.
    1. Wash gezuiverd MZBs eens in 1-2 mL koude migratie buffer [Hanks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) met kationen, 10 mM Hepes, 0,2% vetzuur-vrije BSA] om ervoor te zorgen dat de migratie catie-bevattende buffer niet wordt verdund door residuele catie-vrije PBS buffer. Centrifugeer bij 300 x g - en 4 ° C gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer MZBs in koude migratie buffer tot een concentratie van 50.000 MZBs per 30 µL (gelijk aan het bedrag dat is geladen in een put van een stroom kamer dia).
      Opmerking: De vers geïsoleerde MZBs moeten zo spoedig mogelijk worden gebruikt. Nochtans, zijn zij nog in staat migreren voor maximaal 8 uur of langer na de aanvang van het experiment voor zo lang als ze worden gehouden op het ijs. Optimale temperaturen moeten worden getest voor andere celtypes. Bijvoorbeeld, is het mogelijk beter om te houden van gekweekte T-cellen bij 37 ° C tot de start van de migratie.

2. stroom Experiment

  1. Dia's met integrine ligand jas.
    1. Op de dag vóór het experiment, ontdooien een aliquoot gedeelte van ICAM-1 (400 µg/mL). ICAM-1 met een factor van 1:80 in PBS te bereiken een eindconcentratie van 5 µg/mL verdund. Voeg 30 µL van ICAM-1 naar een kamer op een dia stroom voor elke film van de migratie vereist. Incubeer dia in een vochtige kamer bij 4 ° C's nachts.
      Opmerking: Elke dia bevat 6 kamers en maximaal 8 films in één sessie kan eenvoudig opgenomen worden.
  2. Het blokkeren van de gecoate putten.
    1. Op de dag van het experiment, was de zaal door toevoeging van 100 µL van PBS aan één putje en intrekking van de 100 µL van de andere put van de kamer. Voeg 100 µL van blokkeerbuffer (2% vetzuur-vrije BSA in PBS) aan een kamer en de dia in een vochtige ruimte bij RT voor 1,5 h uit te broeden.
    2. Wassen van de kamer door 100 µL van PBS toe te voegen aan één putje, het ontnemen van de andere goed, dan toe te voegen 100 µL van migratie buffer naar de kamer. De dia's opslaan in een vochtige ruimte bij RT tot het experiment.
  3. De fluidics-eenheid voor te bereiden.
    1. Sluit in een vloeistof pomp, hechten de fluidics-eenheid, en zet de pomp-software. Wassen van de buis een keer met 5-10 mL voor migratie buffer, dan toevoegen van 11,7 milliliters migratie buffer even aan beide reservoirs en verwijder de luchtbellen.
    2. Klem de buis ongeveer 10 cm vanaf de verbindingslijn stuk. Plaats de fluidic eenheid in de verwarmde incubatie-zaal op de Microscoop.
    3. De keuze van de dia "µ-dia VI 0.4" en de slang "wit" in de software ingestelde. Stel de gewenste schuifspanning (bijvoorbeeld 4 dyn cm-2). Stel de tijd van imaging naar 30 min.
    4. De kalibratiefactor van de buis door het bepalen van de stroomsnelheid door de buis in mL/min. maatregel de tijd die nodig is voor 2 mL van de buffer vloeien voort uit een reservoir van de andere te delen door 2 instellen Maak ten minste 4 metingen voor nauwkeurigheid. Gebruik de werkelijke stroomsnelheid te stellen de gewenste debiet en shear stress door het invoeren van de waarden in de software van de pomp.
  4. De imaging systeem voor te bereiden.
    1. Vooraf warm de Microscoop incubatie kamer, fluidics unit en migratie buffer aliquots tot 37 ° C (figuur 2B). Test de fluidic pomp door ervoor te zorgen dat de buffer van de migratie in de reservoirs heen en weer loopt en dat er geen lucht bubbels in het systeem.
  5. De cellen op de dia laden.
    1. Reinig de onderkant van de dia met een weefsel van ethanol-getemperd. Voeg 30 µL van de celsuspensie in één putje van de kamer en 30 µL terugtrekken uit de andere put. Incubeer de dia met een dekking op om te voorkomen dat de verdamping bij 37 ° C gedurende 30 minuten om de cellen te koppelen.
    2. Langzaam de voorverwarmde migratie buffer toevoegen aan elk putje van de stroom kamer dia totdat een positieve meniscus uit de put ontspringt en verwijder eventuele luchtbellen met het uiteinde van de pipet.
  6. De dia aan de fluidics-eenheid koppelen.
    1. Klem de dia naar de Microscoop fase. De ongemarkeerde kant van de fluidic buis uit de connector stuk verwijderen en opvullen van het einde met migratie buffer tot een positieve meniscus zonder luchtbellen uit het einde rijst.
    2. Het einde van de buis over Flip en plaatst u deze in het hoogste goed van de kamer van de stroom, dweilen up gemorste buffer met een tissue. Terwijl de slang geklemd, herhaalt u de procedure voor het gemarkeerde einde van de buis.
  7. Het imago van de cellen.
    1. De imaging systeem overschakelen naar "Live" om de focus op de cellen. Een gezichtsveld in het midden van de dia selecteren De focus de cellen zo iets verbeteren de zwarte rand van de cel en produceren een wit interieur, die vervolgens thresholded aan een ronde zwarte cel vorm op een witte achtergrond voor gebruik met een geautomatiseerd tracking-programma worden kan.
    2. Start het grafische programma van de reeks en record 1 beeld elke 5 s voor 30 min met behulp van de 10 x droge doelstelling. Verwijder de klem van de buizen en zet de pomp aan, dan niet-aanhanger cellen afwassen zal en Adherente cellen beginnen zullen te migreren. Afbeelding voor 30 min of langer met behulp van een 10 x doelstelling of hoger, zoals gewenst. Label en opslaan van de film.
  8. Loskoppelen van de fluidic eenheid van de dia.
    1. Aan het einde van het imaging-programma, reset de pomp voor het volgende experiment: opnieuw aansluit de klem op de slang, de slang uit de dia verwijderen, opnieuw aansluit de verbindingslijn stuk, openen de klem en gebruiken de handmatige bediening van de pomp om te duwen van verschillende mL buffer van één reserv oir naar de andere te verwijderen van de luchtbellen. Opnieuw aansluit de klem en leg de geklemd buis in het werkgebied van de Microscoop voor de volgende film.
      Opmerking: Het protocol kan voor onbepaalde tijd hier worden gepauzeerd. Als met behulp van een inhibitor of modifier van cel migratie, afhankelijk van het werkingsmechanisme, toevoegen naar de celsuspensie voordat het zich vestigen in de zaal van de migratie of naar de buffer van de migratie in de fluidic eenheid.

3. migratie Track analyse

Opmerking: Cellen kunnen worden getraceerd automatisch met behulp van de MTrack2 plugin of met de hand met behulp van de handleiding volgen plugin17. Automatische tracking werkt goed met MZBs omdat deze cellen voornamelijk ronde zijn en op deze manier tijdens de migratie blijven, waardoor u gemakkelijk drempel het imago van de cellen op zwarte objecten op een witte achtergrond. Automatisch bijhouden is moeilijker als andere celtypes worden gebruikt, zoals gekweekt, geactiveerd CD8 + T cellen, omdat deze cellen strekken zich uit tijdens de migratie en worden enigszins transparant, waardoor het moeilijk is om te definiëren van de randen. In dit geval kunnen ofwel (1) de cellen worden gekleurd met een intra vitale fluorescerende kleurstof te produceren beelden dat thresholded zwarte objecten op een witte achtergrond, of (2) andere programma's worden kunnen te schetsen van de cellen, zoals de segmentatie en/of rand detectie van afbeeldingen kunnen weergeven gebruikt. Handmatige tracking is een handige optie bij de productie van een contrastrijk beeld van cel contouren is niet mogelijk.

  1. Het uitvoeren van handmatige bijhouden van het gebruik van de plugin.
    1. Installeer de plugin "Handleiding Tracking" in ImageJ en open de film in ImageJ. Kies "toevoegen nieuwe track" onder het menu "Handmatige Tracking". Klik op het midden van een cel als de film voorschotten automatisch frame-voor-frame. Wanneer de cel is geselecteerd in elk frame, selecteer "toevoegen nieuwe track" om te beginnen na een nieuwe cel.
    2. Nadat de nummers zijn opgenomen, kopieert u de uitvoerresultaten in een werkblad gegevens. De indeling voor decimale weergave voor alle werkbladcellen wijzigen naar nul plaatsen achter de komma. Sla het bestand als een txt-bestand "tab stop-gescheiden" voor latere analyse.
      Opmerking: Meestal worden 50-100 cellen bijgehouden, waarin ongeveer 1 h om voor een 20 min film van circa 240 frames te voltooien.
  2. Automatisch bijhouden van het gebruik van de MTrack2 plugin uitvoeren Download en installeer de plugin kt MTrack2 volgens de instructies in het bestand (Zie aanvullende codering-bestand).
    1. Drempel de beelden uit de cel migratie film. Open de afbeeldingsstapel in ImageJ. Proces de beelden in ImageJ converteren van de video van kleur te hoog contrast afbeeldingen tonen de cellen als zwarte objecten op een witte achtergrond (figuur 3A).
      1. Tweemaal de afbeeldingen verscherpen, Ontvlekken van de beelden en de beelden omzetten in 8 bits. Selecteer de "Image | sub menu aanpassen helderheid/contrast"en zet de schuifregelaar contrast op maximaal contrast, dan de cellen zullen verschijnen als witte objecten op een zwarte achtergrond. Selecteer de "Image | drempel aanpassen"submenu om ervoor te zorgen dat de cellen worden weergegeven als zwarte objecten op een witte achtergrond.
    2. Uitvoeren van de automatisch cel bijhouden plugin "MTrack2 kt" (Zie Aanvullende codering bestand). De volgende parameters instellen op het optiesscherm.
      1. Stel de minimale op 1 pixel grootte van de deeltjes en Deeltjesgrootte maximaal op 30 pixels voor MZBs.
      2. Voor snelheid (maximale afstand tussen 2 deeltjes op opeenvolgende frames van de film), als de celdichtheid op de dia hoog is, deze waarde laag ingesteld om te voorkomen dat de track "jump" van de ene cel naar de andere. Voor MZBs, stelt u deze waarde op 10 pixels te vangen uitschieters, hoewel MZBs in het algemeen niet meer dan 2 pixels op opeenvolgende frames die 5 zijn s uit elkaar.
      3. Voor het minimale aantal frames die een deeltje aanwezig zijn om te worden bijgehouden moet, stel deze waarde in op het aantal frames in de film voor MZBs (bijvoorbeeld, 240) voor een 20 min film met 12 frames/min. Echter, als de cellen snel genoeg om te vertrekken het gezichtsveld vóór het einde van beeldvorming zijn, stel het minimale aantal frames op minder dan de duur van de film. Bijvoorbeeld met snel voortbewegende T cellen, stelt u het minimumaantal op het equivalent van 5-10 min voor imaging.
        Opmerking: Neem een macro op deze stappen (drempelmethode en MTrack2-kt) automatiseren van dit deel van de procedure en tijd besparen (Zie Aanvullende codering bestand). Met behulp van de macro automatisch bijhouden van een film in ImageJ duurt minder dan een minuut.
    3. De uitvoerresultaten van kopiëren in een werkblad gegevens. De indeling voor decimale weergave voor alle werkbladcellen wijzigen naar nul plaatsen achter de komma. Voeg een lege rij aan de bovenkant van de tracks van de cel in het werkblad en de "D" kolom verwijderen. Sla het bestand als een txt-bestand "tab stop-gescheiden" voor latere analyse in het hulpprogramma voor Ibidi Chemotaxis.
      Opmerking: De plugin van MTrack2 uitgangen de tracks van de cel in rijen van 75 parallelle kolommen. Voor de analyse van de Ibidi chemotaxis tool, is de cel nummers moeten in één kolom. Als u wilt converteren de output, de MTrack2 plugin was aangepast zodat het ofwel de uitgang in de oorspronkelijke indeling of als één kolom (figuur 3B) (Zie Aanvullende codering bestand "MTrack2 kt", die is geschreven in Java). Kopieer het Java-bestand naar de map ImageJ plugins. In ImageJ, selecteert u "Plugins > compileren en uitvoeren". Herstart ImageJ, en de gewijzigde versie van MTrack2 moet worden weergegeven in het Plugins menu.
  3. Als u wilt analyseren cel nummers met het hulpprogramma Ibidi Chemotaxis, download de Ibidi Chemotaxis en Migration Tool v2.0 ("stand alone") en open het programma.
    1. Selecteer "Gegevens importeren", en navigeer naar de .txt bestanden voor de track van de cel. Meerdere bestanden kunnen tegelijk worden geselecteerd. Geïmporteerde bestanden weergegeven in het deelvenster "Datasets" in het rood. Selecteer alle van hen en voer de juiste waarden in het "Initialisatie" menu hieronder om de volgende instellingen toe te passen.
    2. Geef het exacte aantal of een bereik van het aantal segmenten (het aantal frames in de film).
    3. In het menu kalibreren (X / Y kalibratie), geef de grootte van een pixel. Deze informatie vinden in het eigenschappenbestand van de film. Voor MZBs, werd de doelstelling van een 10 x gebruikt, geven een pixelgrootte van 1.14 µm. In "menu kalibreren | Time interval", geef de lengte van de tijd tussen frames in de film.
    4. De instellingen toe te passen. Selecteer "Gegevens uitzetten" te bekijken van de track percelen en bevestigen dat de bestanden van de track wordt geopend. Vanaf dit punt zijn vele opties beschikbaar, die worden beschreven in de documentatie voor het programma, met inbegrip van de markering van de tracks met verschillende kleuren op basis van verschillende eigenschappen en weergeven van de afzonderlijke of gemiddelde waarden voor snelheid, doorsturen migratie index, directheid en meer (figuur 3B).
      Opmerking: De MZBs nemen ongeveer 10 min te detecteren en te reageren op de stroom, vermoedelijk door polariserende hun integrine complexen op het punt van de stroom-vooruit van de cel. Een grafiek van migratie index na verloop van tijd zal het tonen van een aanvankelijke daling onder nul, overeenkomt met de eerste paar minuten dat de cel is blootgesteld aan de stromen, gevolgd door een geleidelijke stijging omhoog totdat de indexwaarden doorsturen migratie positief zijn. Zo kan het zijn optimale uit te sluiten van deze eerste minuten in de definitieve berekeningen, tenzij dit proces van belang is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We gebruikt het protocol om te vergelijken van de migratie van MZBs op ICAM-1-coated dia's zonder stroom (0 dyn/cm2) hierboven beschreven en blootgesteld als u wilt schuintrekken flow (4 dyn/cm2). Cellen werden automatisch bijgehouden met MTrack2, en de resulterende track bestanden werden bedekt op de cel migratie films van geen stroom (0 dyn/cm2) en (4 dyn/cm2) om te laten zien van de verdeling en de vorm van de tracks (figuur 4A). Cel nummers werden vervolgens ingevoerd in de Ibidi Chemotaxis tool (ICT) voor het genereren van track percelen van elke film (figuur 4B). De gemiddelde migratie index (genaamd "FMIy" in de ICT), de snelheid, de rechtheid (genoemd "directheid" in de ICT), en de lineaire afstand ("Euclidische afstand" in de ICT genoemd) van cel tracks van 4 films elk voor beide voorwaarden werden berekend in de Chemotaxis hulpmiddel met behulp van de opdracht "gemeten waarden". Deze gemiddelde waarden zijn voor het genereren van grafieken en het berekenen van statistische significantie (figuur 4C) vervolgens naar GraphPad prisma gekopieerd.

Figure 1
Figuur 1: MZB pendelen. (A) Model van MZB pendelen tussen de marginale zone en de follikel in de milt. MZBs nodig dat internalisering van S1PR1, een receptor voor S1P en functionele CXCR5, een receptor voor de CXCL13 chemokine, voer de follikel. Bovendien, om te bereiken de follikel, moet MZBs migreren tegen de kracht van de bloedstroom, die afkomstig zijn van poriën in de marginale sinus dat de follikel omhult. Als een MZB hechting aan ICAM-1, de ligand voor LFA-1 integrine, verliest het geduwd in het rode vruchtvlees door de kracht van de stroom, waar grotere hoeveelheden VCAM-1, de ligand voor VLA-4, migratie niet zou steunen. (B) stroom cytometry gating strategie om te testen op zuiverheid van gesorteerd op MZBs met antilichamen tegen B220, CD23 en CD21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: opstelling van het fluidics systeem, pomp, Microscoop en incubatie kamer. (A) afbeelding van de pompsysteem (Ibidi18) bestaande uit een pomp met aangesloten fluidics eenheid en laptop waarop de software draait de besturing van de pomp. Hogere vergroting beeld: de stroom kamer dia met 6 kamers van de stroom, de eerste van die is aangesloten op de slang van de fluidics eenheid. (B) typische setup voor het meten van de migratie van de in vitro van MZBs tegen stroom. Een microscoop voorzien van een verwarming-cupje (zwarte doos) met de fluidics-eenheid verbonden aan een pomp (blauwe vierkant object naar rechtsonder van de Microscoop) buiten de Microscoop. Hogere vergroting beeld: de eenheid van de fluidics binnen de Microscoop verwarming van de kamer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: kwantificering van imaging gegevens. (A) representatieve beelden van een frame uit een film van migrerende MZBs voor (links) en na (rechts) drempelmethode de afbeelding om de cellen converteren naar zwarte objecten op een witte achtergrond. Schaal bars in beide afbeeldingen van lage en hoge vergroting = 100 µm. (B) linker paneel: foto van de uitvoer van de typische resultaten van de MTrack2 (één kolom output) plugin. Rechter paneel: afbeelding van het hulpprogramma Ibidi Chemotaxis en migratie 2.0 na inbreng van MTrack2 resultaten tonen een track plot van het migreren van MZBs en een "gemeten waarden" venster tonen de gemiddelden van parameters zoals snelheid, migratie index en directheid (weergeven groene vakken), onder anderen. Kalibratie-instellingen die worden weergegeven zijn de pixelresolutie van 1.14 µm per pixel en een tijdsinterval van 5 s (0.083 min) per frame van de film. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: voorbeeld van de resultaten met behulp van het protocol voor het meten van MZB pendelen. (A) vertegenwoordiger stills van migratie MZBs met een overlay van tracks van de ImageJ plugin "MTrack2 kt". Opmerking: de track kleuren werden willekeurig vastgesteld door de "Handleiding Tracking" plugin voor ImageJ. Schaal bars in zowel lage als hoge vergroting inzetstukken = 100 µm. (B) vertegenwoordiger track percelen van migratie MZBs van het hulpprogramma Ibidi Chemotaxis en migratie 2.0. Rode lijnen en zwarte lijnen vertegenwoordigen cel tracks die onder of boven de horizontale as, respectievelijk te beëindigen. In (A) en (B): verliet MZBs migreren met geen stroom (0 dyn/cm2); recht, MZBs migreren naar een 4 dyn/cm2 stroom. (C) migratie index (FMIy), snelheid, rechtheid (directheid) en afstand voor MZBs migreren zonder stroom (0 dyn/cm2) of flow (4 dyn/cm2) (n = 4 muizen in 4 aparte experimenten). Foutbalken = gemiddelde ± SD; Van de student t -test, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende bestand 1: MTrack2_kt.java. Klik hier om dit bestand te downloaden.  

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier beschrijven we een methode voor het analyseren van de migratie van de cellen die ontdekken de kracht van shear stroom en reageren door een wijziging van hun migratie. Een analyse van de MZBs bleek dat MZBs migreren spontaan op ICAM-1 en in aanwezigheid van de stroom, zal migreren van de stroom. In onze eerdere werk toonden we dat MZBs niet van de stroom op VCAM-1 migreren, maar in plaats daarvan vaste in plaats blijven. De lymfkliertest milt marginale zone bevat voornamelijk ICAM-1, terwijl het rode vruchtvlees zowel ICAM-1 en VCAM-1 bevat. Deze gegevens kunnen worden afgeleid dat de MZBs van de stroom terwijl in de marginale zone maar niet in het rode vruchtvlees zou migreren. De analyse werd gevalideerd in vivo MZBs met gebrekkige hechting die werden door de kracht van de stroom12mislocalized aan de milt rode pulp. Om deze redenen vormen MZBs een goede positieve controle voor het testen van de stroomsysteem van de migratie beschreven hier, zelfs als het systeem wordt gebruikt voor het bestuderen van een andere celtype.

De meest kritische aspect van de procedure is het waarborgen van consistentie in cel handling op de dia. Omdat de meetbare aspecten van cel migratie, is afhankelijk van de mate waarin de cellen zich aan de dia houden, zou een daling van cellulaire hechting bemoeilijken reproduceerbare resultaten. Verminderde cellulaire hechting zou kunnen voortvloeien uit inconsistentie in verschillende oorzaken, waaronder de temperaturen van de migratie-buffer of het verwarmde incubatie-vak (koude vermindert hechting), niveaus van kationen in de celsuspensie (caties beïnvloeden integrine bindende), Schuif behandeling (te tikken of buigen van de dia kon verjagen cellen), en de celdichtheid (botsingen tussen cellen in het gedrang migratie parameters). Andere gevoelige punten tijdens de procedure omvatten niet de buffer in de dia putjes met teveel kracht voorafgaand aan de buis te koppelen (als dit zou kunnen cel adhesie verminderen) en bijhouden van de tijd die nodig is voor protocol stappen consistent in elk experiment (pipetteren cel beslechting tijd in het gedrang hechting). Kortom, moet elke mogelijke invloed op cel adhesie herhalingen voor de productie van betrouwbare cel migratiegegevens consistent worden gehouden.

Deze methode is eenvoudig te installeren omdat het commercieel verkrijgbare apparatuur gebruikt en leveringen en geen van de stappen geavanceerde instructie vereisen. P.a. van MZB, evenals andere celtypes zoals gekweekte CD8+ T cellen, de dia's met verschillende integrine liganden coating is voldoende om het observeren van de migratie van de stroom. Bestuderen van stroom-geïnduceerde migratie reactie op verschillende integrine liganden leidt tot directe identificatie van de actieve integrins op het celoppervlak, eventueel onthullende mechanismen die relevant zijn voor in vivo functies als met MZB migratie van de stroom op ICAM-1 maar niet VCAM-1. Het is echter ook mogelijk een endothelial cellaag toevoegen aan de informatiestroom kamers. Een voorbeeld van immuun cel migratie, die wordt beïnvloed door schuintrekken stroom is T-cel extravasation via endothelial lagen3. Deze procedure werd gebruikt voor de activering van T-cel adhesie via integrins, selectinen, en chemokines en dat model lymfocyt migratie via de bloed - hersenbarrière te ontrafelen. De enige beperking naar de cellen die kunnen worden geanalyseerd met deze methode is dat zij moeten kunnen voelen de kracht van stroom als een directionele signaal.

Hoewel de hier geschetste methode wordt gebruikt voor het karakteriseren van cellulaire gedrag zoals snelheid en draaien, kan het ook worden uitgebreid tot de analyse van de moleculaire aspecten van migratie. Moleculaire complexen relevante stroom-geïnduceerde migratie, met inbegrip van integrins zoals LFA-1 en hun cytoskeletal adapters, zou worden gevestigd binnen 200 nM van het oppervlak van de dia, vatbaar voor visualisatie met TIRF microscopie. Deze toevoeging aan de methode zou ideaal zijn voor de studie van cellen uit muizen met mutaties in integrine - of cytoskelet-gerelateerde eiwitten. Zoals vele immune cellen in verschillende stadia van hun ontwikkeling door middel van bloed of lymfe stromen migreren, kan de in vitro migratie beschreven worden gebruikt voor het systematisch testen van allerlei gekweekte of primaire leukocyten voor reactie op stroom en onthullen hoe de cellen zijn geprogrammeerd om te migreren in een in vivo immuunrespons. Tot slot, biedt de hier beschreven test een betrouwbare en eenvoudige methode voor het analyseren van de stroom-geïnduceerde migratie van MZBs die kan worden uitgebreid tot andere celtypes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door subsidies van de "Deutsche Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 aan K.-D.F.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
  3. Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
  4. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
  5. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  6. Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
  7. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
  8. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
  9. Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
  10. Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
  11. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
  12. Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
  13. ImageJ. MTrack2. , Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018).
  14. MTrack2. , Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018).
  15. ibidi. Chemotaxis and Migration Tool. , Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018).
  16. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , Chapter 1 (Unit 1.9) (2001).
  17. ImageJ. Manual Tracking. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018).
  18. ibidi. ibidi Pump System. , Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. (2018).

Tags

Immunologie en infecties probleem 141 B-cellen marginale zone migratie schuintrekken stroom integrins adhesie intercellulaire adhesie molecuul-1 (ICAM-1) vasculaire cel adhesie molecuul-1 (VCAM-1)
Analyse van Shear Flow-geïnduceerde migratie van RattenUitrustingen Marginal Zone B cellen In Vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M.,… More

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. D. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter