Summary
Denne undersøgelse fokuserer på en in vitro- model af sår healing (scratch assay) som en mekanisme til at bestemme hvordan miljøforurenende såsom arsenik indflydelse cellulære migration. Resultaterne viser, at denne in vitro assay giver hurtige og tidlige indikationer af ændringer til cellulære migration inden i vivo eksperimenter.
Abstract
Forstå de fysiologiske mekanismer for sårheling har været genstand for igangværende forskning i mange år. Denne forskning direkte giver sig udslag i ændringer i kliniske standarder bruges til behandling af sår og mindske sygelighed og dødelighed for patienter. Sårheling er en kompleks proces, der kræver strategisk celle og væv interaktion og funktion. En af de mange kritisk vigtige funktioner i sårheling er individuelle og kollektive cellulære migration. Efter skade migrere forskellige celler fra blodet, omgivende bindevæv og epitel væv hurtigt til webstedet sår ved hjælp af kemiske og/eller fysiske stimuli. Denne migration reaktion kan i vid udstrækning diktere resultater og succes af en helbredende såret. Forstå dette bestemt cellefunktion er vigtigt for Translationel medicin, der kan føre til forbedret sårheling resultater. Her, beskriver vi en protokol, der bruges til bedre at forstå cellulære migration, som den vedrører sårheling, og hvordan ændringer i det cellulære miljø i væsentlig grad kan ændre denne proces. I dette eksempel undersøgelse, blev dermal fibroblaster dyrket i medierne suppleret med føtal bovint serum (FBS) som éncellelag kulturer i vævskultur flasker. Celler var aseptisk overføres til vævskultur behandlet 12-godt plader og vokset til 100% sammenløb. Ved ankomsten til sammenløbet, blev cellerne i éncellelag lodret ridset, ved hjælp af en p200 afpipetteres tip. Arsen fortyndet i kultur medier suppleret med FBS blev føjet til individuelle brønde på miljømæssigt relevante doser spænder 0,1-10 M. billeder blev taget til fange hver 4 timer (h) over en 24-timers periode ved hjælp af en omvendt lysmikroskop at observere cellulære migration (sår lukning). Billeder var individuelt analyseret ved hjælp af billede analyse software, og procent sår lukning blev beregnet. Resultaterne viser, at arsen bremser sårheling. Denne teknik giver en hurtig og billig første skærmbillede for evaluering af virkningerne af forurenende stoffer på sårheling.
Introduction
Sårheling består af en kompleks serie af overlappende trin, der involverer forskellige celletyper, signaling molekyler og ekstracellulære matrix komponenter1. Sammen, arbejder disse komponenter i fællesskab for at opnå sår opløsning eller reparation, der i sidste ende fører til dannelsen af et beskyttende fibrotisk ar afhængigt af graden af traumer1. For at fange de enkelte processer og funktioner af sår er healing i et eksperiment vanskeligt; enkelte trin inden for sårheling proces skal identificeres og testet separat. Blandt de mange trin i sårheling, processen af cellulære migration har været betragtet som kritisk når de evaluerer helbredende priser2. Cellulære migration kan iagttages i alle faser af sårheling og nødvendiggør yderligere forståelse af, hvordan ændringer i celle migration kan indvirkning sår lukning. For eksempel, er cellulære migration set i både tidlige og sene fase betændelse, med blod koagulation og trombocyttal aggregering på såret site3. Disse begivenheder forhindre overdreven blodtab ved at danne en midlertidig blokering for at fylde såret områder væv3. Blodplader i omløb vil syntetiserer og udskiller vasoaktive mediatorer sammen med kemotaktisk faktorer, som tilsammen signal for inflammatoriske leukocyt migration (hvide blodlegemer) til de sårede væv til reparation4. Re epithelialization opstår inden for timer efter vævsskade og indebærer dækker webstedet sår gennem aktivitet og migration af epitel keratinocytter at forhindre yderligere forurening eller invasion af fremmede partikler til sår site2. Disse eksempler fange kun nogle få af de mange celle migration funktioner forbundet med sårheling.
Scratch analysen er beskrevet og anvendes til bedre at forstå celle migration og sine mange roller i sårheling5,6. Denne analyse anses forsimplede, giver høj overførselshastighed og muliggør investigator at indsamle repræsentative celle migration data. Migration assays har vist at visse forbindelser kan fremskynde eller bremse hastigheden af cellulære migration6. Desuden giver disse assay resultater translationel fysiologisk oplysninger, der kan bruges til at formulere mål behandlinger, dosering koncentrationer og gener af interesse inden i vivo eksperimenter. Analysen kræver grundlæggende celle kultur teknikker og forsyninger, en cellelinje af valg og imaging-teknologi til at fange bevægelse over tid eller bevægelse i svar på behandlinger.
Analysen kan være let manipuleres eller skræddersyet til behovene af investigator. Men der er fire grundlæggende spørgsmål at overveje før eksperimenter. Hvilke generelle eller specifikke spørgsmål (r) er den forsøger at besvare en eller flere delforsøgsledere? Dette gælder for de fleste hypoteser drevet forskning; Det er imidlertid afgørende for denne analyse fordi det vil afgøre mange af parametrene, der skulle præcist og helt besvare spørgsmål (r). Hvad celle linje eller cellelinjer (hvis der findes flere) bør bruges til at repræsentere den fysiologisk system ved at blive undersøgt? For eksempel, i en kutant sår healing undersøgelse, en dermal fibroblast5,6,7, stamcelle8, eller epidermale keratinocytter9 kan anses for at repræsentere cellepopulationer, der normalt findes i overflod i huden væv10. Alternativt, neutrofiler, makrofager eller andre inflammatoriske celler kunne evalueres i dette system til at repræsentere celle migration af andre komponenter af sårheling inden for hud væv10. Desuden, vil at identificere de specifikke cellelinie evalueres bidrage til at identificere, hvilke reagenser er optimal at bruge til at fremme celle metaboliske aktivitet. Hvordan bliver celle migration sporet/afbildet? Der er en række teknikker, der anvendes til at observere celle migration inden for en plade eller kolbe. For eksempel, giver farvning eller fluorescently tagging celler og bruger fluorescens eller Konfokal imaging til at spore celler en stærk kontrast, som giver mulighed for investigator for klart at definere cellulære vs. ikke-cellulære placeringer og cellulær bevægelse11 . En anden almindelig teknik, beskrevet i denne undersøgelse, er anvendelsen af omvendte lysmikroskopi med fase kontrast6,7. Dette alternativ til celle farvestoffer og fluorescens tillader brugeren at leve spor celler uden at uhelbredeligt fix celler før imaging og giver også mulighed for at fange billeder af den samme individuelle brønde indeholdende sårede encellelag af celler på tværs af tiden point. Foranstaltninger, hvad udfaldet vil blive brugt til analyse? Ved hjælp af billeder indsamlet under hele undersøgelsen, data kan fremskaffes ændringer til cellulære migration satser kan forstås. I vores laboratorium, mikroskopiske billeder taget på den inverterede lysmikroskop er uploadet til billede analyse software og procent sår lukning og summerede arealet under kurven (AUC) beregnes.
Vi vil fremhæve den konkrete anvendelse af denne analyse at belyse ændringerne dermal fibroblast migration i et kendt miljø forurenende, arsen. Arsen er et naturligt forekommende halvmetal fundet i jordskorpen. Forskellige steder er blevet fundet med forhøjede niveauer af arsen, der udgør en risiko for personer, der bor i nærheden af disse steder. Som et resultat, har mad og vand kilder vist sig at have øget niveauer af arsen kontaminering, hvilket øger sandsynligheden for enkeltpersoner til at blive udsat for arsen. Miljømæssige arsen eksponering har vist sig at have langsigtede sundhedsmæssige konsekvenser befolkningsgrupper ovenfor eller endda under den nuværende USA Environmental Protection Agency (USEPA) Max forurenende niveau (MCL) 10 ppb (10 µg/L)12, 13. selv om u.s. EPA har sat denne MCL og anses for det sikkert for drikkevand grænser, arsenik koncentrationer, der overskrider denne grænse er ikke ualmindelige i vandkilder på verdensplan. I det sydvestlige USA, har talrige grundvand, godt vand og springs dokumenteret for at indeholde vedrørende niveauer af arsen14. For eksempel, indeholder Montezuma godt i Verde Valley, AZ, 210 µg/L arsen15. Grundvand omkring floden Verde, AZ indeholder 16 µg/L af arsen i gennemsnit med peak værdier at nå 1,3 mg/L15,16. Navnlig overstiger arsenik koncentrationer i mange brønde i Verde floden vand skur 50 µg/L15,16. Med denne viden, miljømæssigt relevante arsen koncentrationer blev udvalgt der spænder fra under MCL på 0,1 µM (7,5 ppb), at ovennævnte MCL på 10 µM (750 ppb) i aktuelt undersøgelse14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
De oplysninger, der indsamles fra disse eksperimenter vil blive brugt som en tidlig indikator for potentielle ændringer af cellulære migration priser i en i vivo sår forurenet med arsen. Bagefter, signalering molekyler kan vælges baseret på deres rolle for fremme af sårheling og cellulære migration, og fremtidige kvantitative polymerase kæde reaktion (qPCR) baseret gen expression eksperimenter kan oprettes efter afslutningen af aktuelt undersøgelser. Hvis migration satser i denne analyse ændrer i overværelse af arsen, specifikt gen mål involveret i cellulære migration kan være mål for skadelige virkninger af arsen, og kan således være mekanismen af forstyrrelser.
Protocol
1. forberedelse af en biosikkerhed II kabinet (BSC)
Bemærk: De i denne protokol beskrevne metoder bør gennemføres med personlige værnemidler, mens du bruger god laboratorie praksis for at opnå aseptisk teknik.
- Løft BSC beskyttende glas til arbejdshøjde og tænde laminar flow fans.
- Bruge 70% isopropanol vandig opløsning til at udføre en sanitet tørre i arbejdsområdet. Tørre BSC fra bagvæggen og sidevægge og arbejde ned til bundpladen.
- Aftør alle materialer, der vil blive brugt i analysen med 70% alkohol (isopropanol eller EtOH) og læg dem inde i BSC.
2. human Dermal fibroblaster såning i en kolbe på T75
- Få hætteglas med den ønskede befrugtede cellelinje (neonatal human dermal fibroblaster [hDFn], i celle koncentration af 500.000 celler/hætteglas og passage p3-p5).
- Placere et hætteglas med celler i en 1,0 cm dybt vandbad ved 37 ° C at tillade optøning. Tø hætteglas, indtil ca. 70% af celle løsning er flydende. Tør ned hætteglas med 70% alkohol og placere hætteglas i hætteglas rack inde BSC.
Bemærk: Sikre, at vand ikke kommer i kontakt med tråde eller hætten af hætteglasset at forebygge potentielle kontamineres under celle såning. Forhindre komplet optøning af celler i vand bad som udeblivelse kan medføre utilsigtede celledød.
- Placere et hætteglas med celler i en 1,0 cm dybt vandbad ved 37 ° C at tillade optøning. Tø hætteglas, indtil ca. 70% af celle løsning er flydende. Tør ned hætteglas med 70% alkohol og placere hætteglas i hætteglas rack inde BSC.
- Trække ud 10 mL af medier suppleret med 10% føtal bovint Serum (FBS). Bruge en automatisk pipette og 10 mL pipette tip til suges ind T75 vævskultur kolbe. Tillad medier til fuldt mætte base af kolben af blidt vuggende kolben frem og tilbage.
- Åben hætteglas med celle lager og aspirat løsning fra hætteglasset, at være opmærksomme på pipettering hastighed, som cellemembraner vil være sårbare fra kryopræservering.
- Overfør celler til et T75 væv kolbe med medier. Skubbe optøede celle i væv kolbe, igen at være opmærksomme på pipettering hastighed.
Bemærk: Såning tæthed af celler i væv kolbe er tilnærmet for at være 6.600 celler/cm2. Såning tæthed kan ændres for at tilgodese de bruger og ønskede timing af eksperimenter. - Udmåle 1 mL af medier fra T75 væv kolbe og overføre volumen tilbage ind i hætteglasset. Overføre diskenheden fra hætteglasset tilbage i T75 kolbe.
Bemærk: Udfører dette trin hjælper maksimere celle udbytte fra hætteglasset. - Stramme vævskultur kolbe cap og forsigtigt rock til at sprede ensartet celler i suspension på tværs af hele overfladen. Check for jævn fordeling af celler ved hjælp af en omvendt mikroskop.
- Label kolbe med celletype, dato, initialer, afstamning og formål (f.eks., hDFn, 07/11/2018, NDC, Passage 4, arsen ridse Assay). Placer vævskultur kolbe i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5,0% CO2 i 72 timer.
Bemærk: Vækstmediet bør være ændrede 12-24 timer efter indledende seeding for at fjerne spormængder af dimethylsulfoxid (DMSO) cryopreservative, og derefter ændres hver 48 timer efter, at sikre celler er korrekt ernæret. Perioden inkubation og vækst vil afhænge af det beregnede antal celler til bunden analysen. HDFn celler fordobling tid er typisk 16-24 timer under normale betingelser. Dog fordobling sats kan ændre elevation, pH, temperatur, fugtighed, mellemstor type, osv., og skal der tages hensyn til ved planlægningen af eksperimenter.
3. celle, optælling og subkultur i 12-godt væv kultur plade
- Hente T75 vævskultur kolben fra inkubator. Observere overholdt celler ved hjælp af en omvendt mikroskop på 10 X objektive forstørrelse (100 X samlede forstørrelse) og bestemme den omtrentlige celle sammenløb.
- Skan størstedelen af vævskultur kolben, når observere sammenløbet at sikre den mest repræsentative procentdel er tilnærmet. Evaluere enkelte celle morfologi for eventuelle afvigelser eller for bakterielle og/eller svampe forurening.
- Samle den automatisk pipette med 10 mL pipette spids. Bruge pipette til Opsug den fuld volumen af medier fra T75 og overførsel løsningen til en spildbakken. Forhindre afpipetteres tip kontakter vedhængende celleoverfladen. Kassér pipette tip i en biohazard bin.
- Samle den automatisk pipette med 5 mL pipette spids. Opsug 5 mL af en afbalanceret saltopløsning, dispensere i kolben, og forsigtigt rock kolben for at skylle overskydende medier, døde celler og affaldsprodukt.
- Drage volumen af T75 og dispensere til spildbakken. Kassér pipette tip i biohazard bin.
- Samle den automatisk pipette med en 5 mL pipette adapter. Opsug 2 mL trypsin fra lager, dispensere i kolben, og forsigtigt rock kolben for at sprede enzymet over de overholdt celler. Sikre fuld mætning af vedhængende overfladen. Kolben væv i rugemaskinen i 2-3 minutter (min).
Bemærk: Den maksimale enzym-substrat reaktion bør ikke overstige 10 min. - Observere væv kolben under en inverteret mikroskop på en 10 X mål linse forstørrelse (100 X samlede forstørrelse). Anvende blide vibrationer for at lette celle detachement.
- Tørre T75 kolben med 70% alkohol og sted inde i BSC.
- Samle den automatisk pipette med 5 mL pipette spids. Opsug 5 mL af medier fra lager og tilføje T75 væv kolben til enzym-substrat reaktionen standses. Medier: trypsin forholdet skal være 3:1. Med pipette overfoeres op og ned i bunden af kolben 2 - 3 gange at skylle og sikre, at reaktionen er stoppet. Opsug den komplette volumen væske fra kolben og overførsel til en steril 15 mL konisk slange.
- Fyld en anden 15 mL konisk slange med en identisk volumen af medier.
- Placere begge 15 mL konisk rør i en antipodale position til en anden. Anvende 200 g af centrifugalkraften i 5 min ved 25° C ved at angive udstyrs kører parametre.
- Tørre 15 mL konisk slange med pelleted celler med 70% alkohol og placere inde i BSC.
- Bruge den automatiske pipette med 5 mL tilknytning til afpipetteres off medier, efterlod ca 250 µL af væske og celle pellet. Opmærksomme på placeringen af afpipetteres tip, som cellen pellet bør forblive uforstyrret. Dispensere volumen samlet i en spildbakken og kassér tip i en biohazard bin.
- Brug et microcentrifuge tube rack til at køre i bunden af den koniske rør på tværs af hætteglasset slots, at skabe en hurtig vibration, for at forstyrre og genopslæmmes celle pellet (undertiden kaldet "rack rivning").
Bemærk: Undgå at bruge en vortex-mixer til at udføre dette trin. Tyngdekraften styrker lavet af vortex blandere overstiger celle g-force tærskler og kan forårsage lysing. Når udført korrekt, vises den nye celle løsning som en uklar blanding med ingen resterende pellet. Diligence udfører dette trin vil ofte oprette en enkelt cellesuspension, fører til øget nøjagtighed, når tælle celler. - Tilsættes 2 mL af medier til celle bestand eller ophvirvling. Med pipette overfoeres celler forsigtigt ned langs siden af røret 20 gange til at opløse alle klumper. Optage cellen total suspension volumen og afsat kort.
- Med pipette overfoeres 20 µL af Trypan blå lager (0,4%) ind i en tom godt af en 96-brønd plade med en steril pipette.
- Bland stock celle løsning for at skabe en ensartet cellesuspension før overførsel. Bruge en steril pipette tip til at fjerne 20 µL af celle stock (undgå at røre ved tube vægge). Tilføje til de 20 µL af Trypan blå opløsning i 96-brønd plade.
- Med pipette overfoeres forsigtigt at blande indholdet. Med pipette overfoeres 10 µL af blandingen mellem coverslip og den tælle kammer på hemocytometer.
- Iagttage cellerne og gitteret under en 10 X mål. Observere ni store pladser inden for synsfeltet. Tælle celler kun i midten og 4 hjørne firkanter (5 pladser i alt).
Bemærk: Kig efter en ensartet fordeling af celler på tværs af hele nettet for at sikre en præcis optælling. - Tally alle celler (gennemsigtig og blå) i de 5 identificerede pladser i gitteret. Separat, stemmer kun de nonviable (blå) celler i de samme 5 pladser.
- Beregne levedygtige celle tæller ved hjælp af:
hvor x = levedygtige celletal, en = samlede celler, b = ikke-levedygtige celler - Beregne levedygtige celle tæthed ved hjælp af:
hvor x = levedygtige celle tæthed og y = total sum af levedygtige celler. - Beregne samlede levedygtige celler:
hvor x = samlede levedygtige celler, y = levedygtige celle massefylde, f = celle suspension volumen (mL). - Beregne % cellernes levedygtighed:
hvor x = procent cellernes levedygtighed, y = levedygtige celler tælles på nettet, f = total celler tælles på nettet.
- Markere en vandret linje på tværs i bunden af den 12-godt plade til at tjene som referencepunkter under imaging.
- Bruge levedygtige celle tæthed (beregnet i punkt 3.3.7) til at beregne mængden af medier til at fortynde celle lager i for såning en 12-godt vævskultur plade.
Bemærk: Den optimale celle såning tæthed for hDFn celler er 5.000 celler/cm2. - Fortynd celle materiel til 19.000 celler/mL ved hjælp af medier og frø hver brønd med 1 mL af celle lager. Bland celle lager med jævne mellemrum at sikre selv celle såning på tværs af alle 12 brønde.
- Label hver plade med celletype, slægt, bruger initialer og formålet. Sted plader i inkubator sat til 37 ° C og 5,0% CO2. Tillad celler til at vokse, indtil 100% sammenløbet opnås til scratch assay.
- Bruge levedygtige celle tæthed (beregnet i punkt 3.3.7) til at beregne mængden af medier til at fortynde celle lager i for såning en 12-godt vævskultur plade.
4. arsenik (As) stamopløsninger og beregninger
- Fortynd natrium arsenite (Nielsen2) direkte ind i celle kultur medier med 10% FBS i orden koncentrationer på 10, 1,0, 0,1 og 0,01 µM som.
- For dette, gøre en indledende 1 mM materiel som løsning ved at fortynde 3,9 mg natrium arsenite til 30 mL af medier. Seriefremstillede fortyndes 1 mM bestanden for de resterende som løsninger.
| 1000 µM som lager Beregninger | Arsen arbejder Stock koncentrationer | M1V1= M2V2 | Volumen af tidligere arsen løsning | Volumen af medier | Samlede volumen af arsen arbejder lager |
| Nielsen2 molekylvægt: 129.9 g/mol | 10 µM som | (x mL) (1.000 µM) = (30 mL)(10 µM) x = 0,3 mL | 0,3 mL = 300 µL 1 mm som løsning | 29,7 mL medier | 30 |
| .03 L x.001 mol/L x 130 g/mol = 3,9 mg arsen | 1,0 µM som | (x mL) (10 µM) = (30 mL)(1 µM) x = 3 mL | 3 mL af 10 µM løsning | 27 mL af medier | 30 |
| Fortynd 3,9 mg natrium arsenite til 30 mL medier | 0,1 µM som | (x mL) (1 µM) = (30 mL)(0.1 µM) x = 3 mL | 3 mL af 1 µM som | 27 mL af medier | 30 |
| 0,01 µM som | (x mL) (0,1 µM) = (30 mL)(0.01 µM) x = 3 mL | 3 mL af 0,1 µM som | 27 mL af medier | 30 |
Tabel 1. Arsen bestande og serielle fortyndinger. Denne tabel forklarer beregningerne bruges til at oprette As stamopløsninger og arbejder stamopløsninger til behandlingsgrupper.
5. Skrab Assay teknik og arsen forurening
- Opnå en 12-godt plade med celler fra rugemaskinen. Se celler på en 10 X objektive forstørrelse (100 X samlede forstørrelse). Bestemme celle sammenløbet i hver brønd.
Bemærk: Hver enkelte godt skal nå 100% sammenløbet forud for ridser. Dette kritiske trin sikrer konsistens i analysen og hjælper med at standardisere assay protokoller på tværs af eksperimenter. Hvis nogen wells ikke har nået 100% sammenløb, tillade celler til inkuberes i yderligere tid indtil alle brønde har nået 100% sammenløb. Yderligere vækst tid i brønde, der allerede har nået 100% sammenløbet vil ikke blive påvirket. Konfluerende celler vil typisk blive vækst anholdt og forbliver som en éncellelag kultur, samtidig med at sub sammenflydende wells at nå 100% sammenløb. - Samle en automatisk pipette med 10 mL pipette spids. Opsug vækst medier ud af alle brønde. Bortskaf volumen i flydende affald og pipette spidsen i den biologiske bin.
- Samle en p200 pipette med en 1-200 µL sterilt spids. I hver brønd, producere en skramme "mock sår" af svæveflyvning spidsen på tværs af cellens overflade fra en 12-klokken til klokken 6 placering.
Bemærk: Tre faktorer, der vil i høj grad påvirke konsistens er hastighed, tryk og spids vinkel. Bunden skal udføres hurtigt, med et konstant pres, mens at være opmærksomme på spids vinkel opholder sig vinkelret på bunden af pladen. Skrabe for langsomt vil forårsage skæve linjer, overtryk kan permanent score celle vedhængende overflader og en spids vinkel mindre end 90° vil indsnævre de scratch bredde. Nogen af disse almindelige fejltagelser kan resultere i ændrede migration priser og mønstre. - Ryd væk overskydende snavs og celle klumper af skylning med 1 mL af afbalanceret saltopløsning pr. brønd. Rock plade side-til-side at lette vask. Fjerne den afbalanceret saltopløsning fra brønde og bortskaffes i en spildbakken. Smid 5 mL pipette tip i biologiske bin.
- Samle en p200 pipette med en 1-200 µL sterilt spids. I hver brønd, producere en skramme "mock sår" af svæveflyvning spidsen på tværs af cellens overflade fra en 12-klokken til klokken 6 placering.
Figur 1: skematisk fremstilling af scratch analysen. Alt arbejde er gjort inden for en aseptisk felt for at mindske risikoen for kontamination. Celler er seedet til en ønskede tæthed i vævskultur flasker og dyrkes i en inkubator, indstillet til menneskets fysiologiske betingelser (5% CO2, 37 ° C). Ved ankomsten til en ønskede sammenløb, kulturperler celler aseptisk sub ind 12-godt vævskultur plader på en ønskede seeding tæthed. Celler er vokset til 100% sammenløbet i hvert hul i den 12-godt plade og ridset ved hjælp af en steril pipette tip. Denne "scratch" skaber en in vitro- mock sår (angivet ved dobbelt ledes pil), hvor celler naturligt vandrer for at lukke det åbne område. Hver godt kan være entydigt aircondition og cellulære migration satser kan observeres og kvantificeres som svar på forskellige behandling betingelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Bruge en p1000 pipette med en 1.000 µL tip til afpipetteres 1.000 µL fra arsen bestande i brønde, der er tildelt tilfældigt med en behandling gruppe. Brug en ny afpipetteres tip til hver brønd til at undgå krydskontaminering. Registrere tidspunktet Hvornår behandlinger er tilføjet. Sted 12-godt plader i en inkubator, indstillet på 37 ° C og 5,0% CO2.
6. billedbehandling
- Fange billeder af hver godt 10 X objektive forstørrelse hver 4 h over en 24-timers periode (0, 4, 8, 12, 16, 20 og 24 timer). Henvise til den tidligere streg på bunden af pladen til at afbilde den samme beliggenhed langs bunden i hver brønd på senere tidspunkter.
Bemærk: Det er bydende nødvendigt, at de samme steder er fotograferet på hvert tidspunkt, giver mulighed for nøjagtig billedanalyse og opnå repræsentative data.
7. billedanalyse
- Upload billeder taget på den inverterede lysmikroskop til en computer og gemme som et JPEG-billede med en detaljeret filnavn.
- Åbn ImageJ.
- Uploade et billede af en objektsmikrometeret med kendte afstande til software til at konvertere pixels til millimeter (mm), når du tager billedet målinger ved at trække og slippe filen i vinduet software.
Bemærk: Mikrometer bør har linjer, der afgrænser et kendt 1 mm længde og billedet skal tages på samme forstørrelse bruges til at fange billeder af celler. Eksempelvis i dette studie billeder blev taget på 100 X samlede forstørrelse, blev således billedet af objektsmikrometeret taget på 100 X samlede forstørrelse.- Klik på indstillingerne lige, segmentereteller Frihånd linjer .
- Tegn en linje af kendt distance på mikrometer billedet ved hjælp af aksemærker med en længde, der er tilknyttet hver tick marks. At tegne en lige streg: musen, hold, trække markøren til ønskede placering og derefter give slip på musen.
- Vælg analyser og derefter vælge Sat skala.
- Angiv Kendt afstand til den kendte længde af streg i forrige trin.
- Angivet enhed af længde til mm.
- Check den globale boks.
- Vælg OK for at afslutte menuen.
- Lukke ud af scenen mikrometer billede.
- Uploade en ridse assay billede i ImageJ ved at trække og slippe billedfiler til vinduet.
- Tegne en lige streg i bredden af scratch (fra venstre forkant til højre forkant).
- Tryk på bogstavet M på tastaturet for at optage måling af den lige linje. En lille resultatvinduet vil umiddelbart fremstår efter at skrive bogstavet M. Dette er, hvor bredde-måling vil være.
- Gentag trin 7,4 i alt 10 gange for at få 10 målinger langs bunden.
Bemærk: Det er vigtigt at generere de mest repræsentative breddeværdier ned hele længden af bunden. Sørg for at space ud 10 bredde målinger lige så langs bunden fra top til bund. - Oprette en ridse assay regnearksfil til at kopiere og indsætte målingerne.
- Kopier og Indsæt 10 bredde målinger fra resultatvinduet i relevante kolonne i et regnearksfil (tabel 2).
Bemærk: Når målingerne er kopieret fra vinduet resultater og klistret ind i regnearket, der vil være uvedkommende kolonner af værdier; disse værdier skal slettes, bevares kun de 10 bredde målinger.
- Kopier og Indsæt 10 bredde målinger fra resultatvinduet i relevante kolonne i et regnearksfil (tabel 2).
| 10 tilfældige bredde målinger | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1 | |||||||
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | |||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | |||||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
| 10 | |||||||
| Gennemsnit af 10 målinger |
Tabel 2. Rå bredde målinger tabel format. Denne tabel viser den organisatoriske struktur for de rå målinger opnået.
- Gentag ovenstående trin for resten af scratch assay billeder.
- Beregne gennemsnittet af de 10 målinger for hvert tidspunkt (0-24 h) til hver brønd.
- Bestemme procent lukning beregninger ved hjælp af værdier fra trin 7,8.
- Oprette en tabel i bunden af regnearket med titlen "bredde måling gennemsnit" (tabel 3).
- Kopiere og indsætte rækken Gennemsnit af 10 målinger beregnet i trin 7,8 i tabellen "bredde måling gennemsnit".
- Oprette en anden tabel ved siden af tabellen Bredde måling gennemsnit . Titel dette tabel Procent sår lukning (tabel 4).
Bemærk: Værdien i kolonnen 0 h for hver brønd bør være 0, fordi bunden er 0% lukkede ved den indledende 0 h foto for alle brønde. - Navigere hen til den næste kolonne over (4 h).
- Beregn den procentvise lukning for 4, 8, 12, 16, 20 og 24 h tid point:
hvor x = procent lukning, jeg = indledende bunden bredde (0 h bredde), f = final scratch bredde (4, 8, 12, 16, 20 eller 24 h bredde).
| Godt bredde gennemsnit | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3a | |||||||
| 4a | |||||||
| 1b | |||||||
| 2b | |||||||
| 3b | |||||||
| 4b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tabel 3. Bredde målinger gennemsnit tabelformat. Denne tabel viser den organisatoriske struktur for de bredde måling gennemsnit beregnet ved hjælp af rå bredde målinger i tabel 2.
| Godt | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | 0 | ||||||
| 2a | 0 | ||||||
| 3a | 0 | ||||||
| 4a | 0 | ||||||
| 1b | 0 | ||||||
| 2b | 0 | ||||||
| 3b | 0 | ||||||
| 4b | 0 | ||||||
| 1c | 0 | ||||||
| 2c | 0 | ||||||
| 3c | 0 | ||||||
| 4c | 0 |
Tabel 4. Procent sår lukning tabelformat. Denne tabel viser den organisatoriske struktur procent sår lukning værdier beregnet ved hjælp af bredde-måling gennemsnit i tabel 3.
- Oprette en anden tabel ved siden af tabellen Procent sår lukning . Titel dette tabel AUC (tabel 5).
- Beregne 0-4 h arealet under kurven (AUC) værdi i 0-4 h kolonne for hver brønd:
hvor x = 0-4 h AUC værdi, et = % lukning værdi til 0 h, b = % lukning værdi for 4 h, h = tid mellem de to foranstaltninger (4 h i denne undersøgelse). - Beregn 4-8 h arealet under kurven (AUC) værdien i kolonnen 4-8 h for hver brønd:
Hvor x = 4-8 h AUC værdi, et = % lukning værdi for 4 h, b = % lukning værdi for 8 h, h = tid mellem de to foranstaltninger (4 h i denne undersøgelse).
Bemærk: Én AUC værdi skal beregnes for hvert 4 h tidsinterval for 24 h perioden til hver brønd. - Opsummere alle AUC-værdierne fra 0-24 h (beregnet i trin 7.10.1-7.10.2) for at få en summerede AUC værdi til hver brønd. Sikre disse værdier gemmes korrekt til statistiske analyser.
- Beregne 0-4 h arealet under kurven (AUC) værdi i 0-4 h kolonne for hver brønd:
| Godt | 0-4 h | 4-8 h | 8-12 h | 12-16 h | 16-20 h | 20-24 h | Summeres AUC |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3a | |||||||
| 4a | |||||||
| 1b | |||||||
| 2b | |||||||
| 3b | |||||||
| 4b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tabel 5. AUC tabelformat. Denne tabel viser den organisatoriske struktur for AUC-værdierne beregnes ved hjælp af procent sår lukning værdier i tabel 4.
8. statistisk analyse
- Bestemme den statistiske analysemetode, der passer bedst til både eksperimentelle design og summerede AUC værdier opnået under analysen.
Representative Results
Stikprøvestørrelserne (n) for alle behandlingsgrupper blev n = 28. Celler var med held kulturperler følgende aseptisk teknik og lab protokoller (figur 1). Ensartet ridser blev observeret på tværs af alle behandlingsgrupper med den gennemsnitlige scratch bredde måling 0,8 mm 0,4 mm (figur 2). Kontrolgruppen havde en gennemsnitlig summeres arealet under kurven værdien af 1,355.83; 0,01 µM som behandlingsgrupper havde en gennemsnitlig opsummerede arealet under kurven værdien af 1,366.21; 0,1 µM som behandlingsgrupper havde en gennemsnitlig opsummerede arealet under kurven værdien af 1,326.24, 1,0 µM som behandling gruppe havde gennemsnitligt opsummerede arealet under kurven værdien af 1,295.10; og endelig den 10 µM som behandling gruppe havde en gennemsnitlig summeres arealet under kurven værdien af 535.12, som var statistisk lavere sammenlignet med alle andre grupper (p < 0,05) (figur 3). R-program for statistisk analyse blev brugt til at køre en en-vejs ANOVA med en Tukey post hoc justering til at bestemme statistiske forskelle blandt behandlingsgrupper (p < 0,05).
Figur 2: repræsentative bunden assay billeder over en periode på 20 h. Billeder A-D repræsenterer cellulære migration af kontrol celler; billeder E-H repræsenterer cellulære migration af celler forurenet med 1,0 µM som; billeder I-L repræsenterer cellulære migration af celler forurenet med 10 µM som. Fra disse billeder er det klart at cellulære migration er bremset i overværelse af arsen. Kontrol billeder viser en helt "helbredt" bunden efter 20 timer, mens de andre to som behandling grupper ikke var "helbredt". De 10 µM som behandling hæmmet fuldstændig lukning helt efter 24 h. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: arsen bremser cellulære migration i scratch analysen. Billeder blev taget til fange i en 24-timers periode at observere ændringer i cellulære migration satser i overværelse af varierende koncentrationer af arsen. RAW billeder blev analyseret ved hjælp af en automatiseret software (f.eks.i MATLAB), som i første omgang målt sår bredde, derefter beregnet procent lukning og endelig arealet under kurven (AUC). Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien. De 10 µM som behandling gruppe statistisk bremset cellulære migration af human dermal fibroblaster neonatal (hDFn), vist ved en statistisk lavere AUC værdi, i forhold til alle andre behandlingsgrupper ved hjælp af en en-vejs ANOVA med en Tukey post hoc justering (p < 0,05). Statistiske forskelle repræsenteres af bogstaverne "A" og "B", som blev opnået gennem brug af metoden kompakt brev Display tilgængelige i R-program. Behandlinger, der ikke deler en fælles brev er statistisk signifikant fra hinanden (p < 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Anvendelsen af denne analyse giver en høj overførselshastighed og rettidig evaluering af cellulære migration og kan direkte oversættes til komplekse fysiologiske systemer5,6,7. Af denne grund, den foreslåede bænk-top model tunet og praktiseres for at vurdere virkningerne af forskellige terapeutiske agenter og miljømæssige toksiner på sårheling6. Koncentrationerne af arsen bruges i den aktuelle undersøgelse blev anset for miljømæssigt relevante gennem omfattende litteratursøgning af kendte eksponeringsniveauer, og fra retrospektiv gennemgang af forskellige data baser14,15, 16,17,18,19,20,21. Brug af denne in vitro- scratch analyse vist, at eksponering for en arsen koncentration inden for høje, men miljømæssigt relevante udvalg, forsinket sår lukning (cellulære migration).
Denne bænk top model blev også ansat til at isolere og studere en enkelt cellelinje (fibroblast) for yderligere at forstå, hvordan fibroblast migration bidrager til sår healing resultater. Derudover er det svært at studere funktionerne i en enkelt cellelinje i komplekse i vivo systemer med mange andre celler og væv til stede, der kan forstyrre analysen. Analysen omfatter desuden et middel til at nå semi-kvantitative procent sår lukning data, der kan bruges til at målrette specifikke cellulære mekanismer gennem hvilke forbindelser kan påvirke sårheling. For eksempel, celler, der bruges i scratch analysen kan indsamles og opbevares i en ønskede reagens og bruges i genekspression (signal mRNA) eller protein udtryk-undersøgelser,22. Disse oplysninger kan være nyttige til investigator hvis de søger at forstå hvad signaler eller proteiner kan i vid udstrækning bidrage til ændringer i cellulære migration i overværelse af varierende behandlinger (f.eks arsen)22.
Menneskelige neonatal dermal fibroblaster blev udvalgt til dette arbejde er baseret på deres fremtrædende rolle i sårheling. Dog protokollens scratch assay er blevet gennemført ved hjælp af forskellige celletyper og for en række forskningsformål. For eksempel er scratch analysen blevet vedtaget i inden for onkologi for at studere migration hæmning af kemoterapi narkotika23; for skeletmuskulatur celle migration, spredning og diffusion24; at studere effekten af planteekstrakter på cellulære migration25; og forstå hvordan keratinocytter migration og spredning bidrager til sår healing9. Derudover evalueres en tidligere papir af Pinto et al. virkningerne af uran (U) og trombocyttal-rich plasma (PRP) på hDFn migration ved hjælp af scratch assay6. Formålet med dette arbejde var at forstå omfang som dette assay kunne teste effekten af agent menes at langsom cellulære migration (U), såvel som agent menes at fremskynde cellulære migration (PRP). Som det kan ses i den ovennævnte arbejde og forskning af andre efterforskere, anvendelse af scratch analysen har stort potentiale for brug i forskellige eksperimentelle modeller26. Trods den detalje gives inden for metoderne, skal variansen forventes mellem efterforskere og eksperimenter. Cellulære migration priser vil sandsynligvis svinge baseret på cellelinie i brug, ud over de krævede mikronæringsstoffer behov for unikke celletyper. Mange af de vigtige bemærkninger til støtte i celle udbytte og levedygtighed er angivet som noter i hele denne protokol. Det anbefales imidlertid kraftigt, at efterforskere Følg producentens anbefalinger for optimale vækstbetingelser, og at bruge denne metode som supplerende undervisning for generelle celle kultur arbejde.
Selv om scratch analysen er ekstremt alsidige for undersøgelse af cellulære aktivitet; uforudsete bias kan opstå i måleteknikker. For eksempel, når du bruger ImageJ manuelt spore celle migration fronter, kan variation findes blandt brugere, som kan begrænse nøjagtigheden og indsamling af repræsentative data. Det skal også bemærkes, at migration fronter bør læses blinde til behandling at minimere bruger bias. Desuden, manuelt identificering migration fronter kan resultere i fejlberegning af gennemsnitlige afstand på grund af pseudopod dannelse, som celler og deres evne til at nå ud til form fokale sammenvoksninger, som kan være visuelt vildledende. På lignende måde, brug af fluorescerende "celle tracker" farvestoffer på cellens overflade eller nukleare proteiner til at opdage migration kan utilsigtet fastsætte cellerne medførende unøjagtigheder ved måling af cellulære migration over tid. Det anbefales, at passende positive og/eller negative kontroller være indskrevet i eksperimentet at helt æsler effekten af behandling på cellelinjer. Praksis af denne analyse skal være afsluttet i anerkendelse af dens begrænsninger. Denne analyse kan ikke garantere at cellulære migration resultater fra in vitro forsøg direkte vil oversætte til i vivo resultater. Sår healing og cellulære migration i et komplekst levende system indebærer en lang række celletyper og molekylære signaler; hver har potentiale til at påvirke healing svar.
I Resumé, har scratch analysen vist sig for at give høj overførselshastighed screening af cellulære migration i svar til skiftende miljøer6,25. Vi udnyttede specifikt denne protokol for at med held registrerer ændringer i cellulære migration som følge af arsen eksponering på forskellige miljømæssigt relevante doser. Disse data har givet begrundelse for at bruge bunden analysen til yderligere undersøgelse og vurdere den mekanistiske veje af cellulære migration i denne analyse og hvordan disse veje er ændret af arsen eksponering.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute on mindretal sundhed og sundhed forskelle af National Institutes of Health under Award nummer U54MD012388. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
| Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
| Water Bath | Precision | Model 182 | |
| Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
| CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
| Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
| Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
| Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
| p200 Pipette | Gilson | ||
| p20 Pipette | Gilson | ||
| Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
| T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
| 15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
| 50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
| 5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Tissue Marker | Securline | 92167 | |
| Wipes | Kintech | 34155 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
| Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
| Bleach | Great Value | 220-04 | |
| 96-well | Falcon | 353915 | |
| Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
| Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
| Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
| 12-well plate | Corning | 3598 | |
| Waste Beaker | n/a | n/a | |
| 1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
| Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
| Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
| Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
| Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |
References
- Diegelmann, R., Evans, M. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing. Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).
- Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. Novel insights into wound healing sequence of events. Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).
- Michelson, A. Platelets. , 3rd edition, Waltham, Massachusetts. (2013).
- Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations. American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).
- Liang, C., Park, A., Guan, J. In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. , 329-333 (2007).
- Pinto, B., et al. A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied. In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).
- Pinto, B., et al. Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model. Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).
- Roubelakis, M., et al. Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).
- Shibata, S., et al. Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway. Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).
- Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. Cellular aspects of wound healing. Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).
- Gentry, P. R., Clewell, H. J. III, Greene, T. B., et al. The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).
- Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media. International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).
- Robertson, F. N. Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States. Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).
- Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA. Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).
- Uhlman, K. Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics. , The University of Arizona. Tucson, AZ. Arizona Cooperative Extension, AZ 1453 (2008).
- Agusa, T., et al. Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam. Science of the Total Environment. , 488-489, 562-569 (2014).
- Ayotte, J. D., et al. Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States. Science of the Total Environment. , (2014).
- Dummer, T. J., et al. Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada. Science of the Total Environment. , (2014).
- Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations. Water Research. 48, 156-169 (2014).
- Beamer, P. I., et al. Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).
- Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).
- Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. Optimization of cell motility evaluation in scratch assay. Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).
- Harishkumar, M., et al. Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract. BioMed Research International. 13, Article ID 963457, 8 pages (2013).
- Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay? Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).
