Environment

इन विट्रो खरोंच परख त्वचा सेल प्रवास पर आर्सेनिक के प्रभाव का प्रदर्शन करने के लिए

Published: February 23, 2019 doi: 10.3791/58838

Bronson I. Pinto^1,4, Nathan D. Cruz¹, Oscar R. Lujan¹, Catherine R. Propper^1,3, Robert S. Kellar^1,2,4

¹Department of Biological Sciences, Northern Arizona University, ²Department of Mechanical Engineering, Northern Arizona University, ³Department of Chemistry and Biochemistry, Northern Arizona University, ⁴Center for Bioengineering Innovation, Northern Arizona University

Summary

इस अध्ययन में एक घाव भरने के विट्रो मॉडल में केंद्रित (खरोंच परख) कैसे ऐसे आर्सेनिक प्रभाव सेलुलर प्रवास के रूप में पर्यावरण contaminants का निर्धारण करने के लिए एक तंत्र के रूप में । परिणाम प्रदर्शित करता है कि इस विट्रो में परख सेलुलर प्रवास में परिवर्तन के तेजी से और जल्दी संकेत प्रदान करता है vivo प्रयोग में पहले ।

Abstract

घाव भरने के शारीरिक तंत्र को समझना कई वर्षों के लिए चल रहे अनुसंधान का ध्यान केंद्रित किया गया है । यह अनुसंधान सीधे घावों और कम रुग्णता और रोगियों के लिए मृत्यु दर के इलाज के लिए इस्तेमाल नैदानिक मानकों में परिवर्तन में तब्दील हो । घाव भरने एक जटिल प्रक्रिया है कि रणनीतिक सेल और ऊतक बातचीत और समारोह की आवश्यकता है । घाव भरने के कई गंभीर रूप से महत्वपूर्ण कार्यों में से एक व्यक्तिगत और सामूहिक सेलुलर प्रवास है । चोट पर, रक्त से विभिन्न कोशिकाओं, आसपास के संयोजी, और उपकला ऊतकों तेजी से रासायनिक और/या शारीरिक उत्तेजकों के माध्यम से घाव साइट के लिए पलायन । इस प्रवास प्रतिक्रिया काफी हद तक परिणाम और एक चिकित्सा घाव की सफलता हुक्म कर सकते हैं । इस विशिष्ट सेलुलर समारोह को समझना शोधों दवा है कि सुधार घाव भरने के परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के लिए महत्वपूर्ण है. यहां, हम एक बेहतर सेलुलर प्रवास को समझने के लिए इस्तेमाल प्रोटोकॉल का वर्णन के रूप में यह घाव भरने से संबंधित है, और कैसे सेलुलर पर्यावरण में परिवर्तन काफी इस प्रक्रिया को बदल सकते हैं । इस उदाहरण के अध्ययन में, चमड़े की फाइब्रोब्लास्टर्स भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक मीडिया में बड़े हो गए थे (fbs) ऊतक संस्कृति flasks में monolayer संस्कृतियों के रूप में. कोशिकाओं को aseptically ऊतक संस्कृति में स्थानांतरित 12-अच्छी तरह से प्लेटों का इलाज किया और १००% संगम के लिए हो गया । संगम तक पहुँचने पर, मोनोलेयर में कोशिकाएं एक p200 पिपेट टिप का उपयोग करते हुए ऊर्ध्व खरोंच थीं । संस्कृति में पतला आर्सेनिक fbs के साथ पूरक मीडिया को पर्यावरण की दृष्टि से संबंधित खुराक में व्यक्तिगत कुओं को जोड़ा गया 0.1-10 एम । छवियों को हर 4 घंटे (एच) एक 24 एच अवधि में एक औंधा प्रकाश खुर्दबीन का उपयोग करने सेलुलर प्रवास (घाव का पालन पर कब्जा कर लिया गया बंद) । छवियां व्यक्तिगत रूप से छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया, और प्रतिशत घाव बंद गणना की गई थी । परिणाम प्रदर्शित करता है कि आर्सेनिक घाव भरने को धीमा कर देता है । यह तकनीक घाव भरने पर contaminants के प्रभाव के मूल्यांकन के लिए एक तेजी से और सस्ती पहली स्क्रीन प्रदान करता है ।

Introduction

घाव हीलिंग अतिव्यापी कदम है कि विभिंन प्रकार के सेल शामिल की एक जटिल श्रृंखला के होते हैं, अणुओं संकेतन, और extracellular मैट्रिक्स अवयव¹। एक साथ, इन घटकों के संगीत कार्यक्रम में काम करने के लिए घाव संकल्प या मरंमत, जो अंततः एक सुरक्षात्मक फाइब्रोटिक निशान के गठन की ओर जाता है प्राप्त करने के लिए आघात¹की डिग्री पर निर्भर करता है । व्यक्तिगत प्रक्रियाओं और एक प्रयोग में घाव भरने के कार्यों को पकड़ने के लिए मुश्किल है; घाव भरने की प्रक्रिया के भीतर व्यक्तिगत कदम की पहचान की और अलग से परीक्षण करने की आवश्यकता है । घाव भरने के कई चरणों में, सेलुलर माइग्रेशन की प्रक्रिया को महत्वपूर्ण माना गया है जब उपचार दर²का मूल्यांकन किया गया है । सेलुलर प्रवास घाव भरने के सभी चरणों में देखा जा सकता है, और इस प्रकार सेल माइग्रेशन में परिवर्तन घाव बंद को प्रभावित कर सकते हैं के बारे में और समझ आवश्यक है । उदाहरण के लिए, सेलुलर माइग्रेशन दोनों को शुरुआती और देर से चरण सूजन में देखा जाता है, रक्त के जमाव और घाव साइट³पर प्लेटलेट एकत्रीकरण के साथ । इन घटनाओं को एक अस्थाई रुकावट के गठन के लिए घाव³ऊतक से रहित क्षेत्रों को भरने के द्वारा अत्यधिक रक्त की हानि को रोकने के । संचलन में प्लेटलेट्स synthesize और chemotactic कारकों के साथ vasoactive मध्यस्थों छिपाना, जो एक साथ सूजन ल्यूकोसाइट माइग्रेशन के लिए संकेत (सफेद रक्त कोशिकाओं) की मरम्मत के लिए घायल ऊतक के लिए⁴. पुनः उपकला ऊतक चोट के घंटे के भीतर होता है और गतिविधि और उपकला keratinocytes के प्रवास के माध्यम से घाव साइट को कवर करने के लिए आगे संदूषण या विदेशी कणों के आक्रमण को रोकने के लिए घाव साइट²शामिल है । ये उदाहरण घाव भरने के साथ जुड़े कई सेल माइग्रेशन फ़ंक्शंस के केवल कुछ कैप्चर करते हैं ।

खरोंच परख का वर्णन किया गया है और बेहतर सेल माइग्रेशन और घाव हीलिंग⁵^,⁶में अपनी कई भूमिकाओं को समझने के लिए इस्तेमाल किया । इस परख सरलीकृत माना जाता है, उच्च throughput प्रदान करता है, और जांचकर्ता प्रतिनिधि सेल माइग्रेशन डेटा एकत्र करने के लिए सक्षम बनाता है । माइग्रेशन assays ने सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया है कि कुछ यौगिकों में तेजी लाने या सेलुलर माइग्रेशन⁶की दर को धीमा कर सकते हैं । इसके अलावा, इन परख परिणाम शोधों शारीरिक जानकारी है कि लक्ष्य उपचार तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करते हैं, सांद्रता खुराक, और ब्याज के जीन से पहले vivo प्रयोग में । परख बुनियादी सेल संस्कृति तकनीकों और आपूर्ति, पसंद की एक सेल लाइन, और इमेजिंग प्रौद्योगिकी के लिए समय या आंदोलन के उपचार के जवाब में आंदोलन पर कब्जा की आवश्यकता है ।

परख आसानी से हेरफेर या अन्वेषक की जरूरतों के अनुरूप करने के लिए सिलवाया जा सकता है । हालांकि, प्रयोग करने से पहले विचार करने के लिए चार बुनियादी सवाल हैं । क्या सामांय या विशिष्ट प्रश्न है/जांचकर्ता (ओं) को जवाब देने की कोशिश कर रहे हैं? यह सबसे hypotheses संचालित अनुसंधान के लिए सच रखती है; हालांकि, यह इस परख के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सही और पूरी तरह से सवाल (ओं) का जवाब जरूरत मापदंडों के कई निर्धारित करेगा । क्या सेल लाइन या सेल लाइनों (यदि एकाधिक) का अध्ययन किया जा रहा शारीरिक प्रणाली का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए? उदाहरण के लिए, एक त्वचीय घाव चिकित्सा अध्ययन में, एक चमड़े का फ़ाइब्रोब्लास्ट⁵^,⁶^,⁷, स्टेम सेल⁸, या एपिडर्मल केराटिनोसाइट⁹ को सेल की आबादी का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना जा सकता है जो सामान्य रूप से पाए जाते हैं त्वचा के ऊतकों में बहुतायत में¹⁰. वैकल्पिक रूप से, न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज या अन्य भड़काऊ कोशिकाओं को त्वचा के ऊतकों के भीतर घाव भरने के अन्य घटकों के सेल माइग्रेशन का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस प्रणाली में मूल्यांकन किया जा सकता है¹⁰. इसके अतिरिक्त, विशिष्ट सेल लाइन का मूल्यांकन किया जा रहा पहचान करने के लिए जो अभिकर्मकों सेल चयापचय गतिविधि को बढ़ावा देने के लिए उपयोग करने के लिए इष्टतम है मदद मिलेगी । सेल माइग्रेशन को कैसे ट्रैक किया जाएगा/ एक थाली या फ्लास्क के भीतर सेल माइग्रेशन का निरीक्षण करने के लिए उपयोग की जाने वाली कई तकनीकें हैं । उदाहरण के लिए, रंगाई या प्रतिदीप्ति कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए और प्रतिदीप्ति या संनाभि इमेजिंग का उपयोग करने के लिए एक मजबूत विपरीत प्रदान करता है, जो जांचकर्ता स्पष्ट रूप से सेलुलर बनाम गैर सेलुलर स्थानों और सेलुलर आंदोलन को परिभाषित करने की अनुमति देता है¹¹. एक अंय आम तकनीक, इस अध्ययन में वर्णित है, विपरीत चरण⁶^,⁷के साथ उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग है । सेल रंगों और प्रतिदीप्ति के लिए इस विकल्प के लिए उपयोगकर्ता को समाप्त करने की अनुमति देता है बिना ट्रैक कोशिकाओं को जीवित करने के लिए पहले से कोशिकाओं को ठीक करने के लिए इमेजिंग और भी एक ही व्यक्ति की छवियों पर कब्जा करने के लिए अनुमति देता है कुओं के घायल monolayers युक्त समय अंक में कोशिकाओं । विश्लेषण के लिए क्या परिणाम उपायों का उपयोग किया जाएगा? अध्ययन के दौरान इकट्ठे किए गए चित्रों का उपयोग करके डेटा जेनरेट किया जा सकता है जिसमें सेलुलर माइग्रेशन दरों में परिवर्तन को समझा जा सकता है । हमारी प्रयोगशाला में, सूक्ष्म छवियों पर कब्जा कर लिया उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर और प्रतिशत घाव बंद करने और अभिव्यक्त किया क्षेत्र वक्र (auc) के तहत गणना कर रहे हैं करने के लिए अपलोड कर रहे हैं ।

हम इस परख के विशिष्ट उपयोग को उजागर करने के लिए एक ज्ञात पर्यावरण contaminant, आर्सेनिक की उपस्थिति में त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट प्रवास को स्पष्ट करना होगा । आर्सेनिक पृथ्वी की पपड़ी के भीतर पाया जाने वाला एक स्वाभाविक रूप से उत्पन्न होने वाला धातु-रूप है । विभिन्न स्थानों आर्सेनिक के ऊंचा स्तर के साथ पाया गया है, जो व्यक्तियों जो इन स्थानों के पास रहने के लिए एक जोखिम बन गया है. नतीजतन, खाद्य और जल स्रोतों में आर्सेनिक संदूषण का स्तर बढ़ गया है, जो व्यक्तियों के लिए आर्सेनिक के संपर्क में आने की संभावना बढ़ जाती है । पर्यावरण आर्सेनिक एक्सपोजर के ऊपर या यहां तक कि वर्तमान संयुक्त राज्य अमेरिका पर्यावरण संरक्षण एजेंसी (usepa) 10 पीपीबी के मैक्स contaminant स्तर (mcl) के नीचे मानव आबादी में दीर्घकालिक स्वास्थ्य परिणाम है दिखाया गया है (10 μg/ ¹³. हालांकि usepa इस mcl सेट है और इसे पीने की सीमा के लिए सुरक्षित समझा, आर्सेनिक सांद्रता कि इस सीमा से अधिक दुनिया भर में पानी के स्रोतों में असामांय नहीं हैं । पश्चिमी संयुक्त राज्य अमेरिका में, कई भू-जल, अच्छी तरह से पानी, और स्प्रिंग्स आर्सेनिक¹⁴के विषय के स्तर को शामिल करने के लिए प्रलेखित किया गया है । उदाहरण के लिए, verde घाटी में, AZ, montezuma अच्छी तरह से आर्सेनिक¹⁵के २१० μg/ verde नदी के आसपास भूजल, AZ औसत पर आर्सेनिक के 16 μg/l शामिल हैं, पीक मूल्यों तक पहुंचने के साथ १.३ mg/l¹⁵^,¹⁶. विशेष रूप से, verde नदी के पानी में कई कुओं में आर्सेनिक सांद्रता शेड से अधिक ५० μg/ इस ज्ञान के साथ, पर्यावरण की दृष्टि से प्रासंगिक आर्सेनिक सांद्रता का चयन किया गया है कि सीमा से नीचे mcl पर ०.१ μm (७.५ ppb), mcl के ऊपर करने के लिए 10 μm (७५० ppb) वर्तमान अध्ययन में¹⁴^,¹⁵^,¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ _.

इन प्रयोगों से एकत्रित जानकारी को सेलुलर माइग्रेशन दरों में संभावित परिवर्तनों के एक प्रारंभिक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा, जिसमें वीवो घाव में आर्सेनिक के साथ प्रदूषित होता है । इसके बाद, सिग्नलिंग अणुओं को घाव भरने और सेलुलर माइग्रेशन को सुविधाजनक बनाने में उनकी भूमिका के आधार पर चुना जा सकता है, और वर्तमान के पूरा होने पर भविष्य मात्रात्मक पॉलीमलेस चेन रिएक्शन (qpcr) आधारित जीन अभिव्यक्ति प्रयोगों को स्थापित किया जा सकता है अध्ययन. यदि आर्सेनिक की उपस्थिति में इस परख परिवर्तन में माइग्रेशन दरें, सेलुलर प्रवास में शामिल विशिष्ट जीन लक्ष्य आर्सेनिक के हानिकारक प्रभावों के लिए लक्ष्य हो सकता है, और इस प्रकार व्यवधान की व्यवस्था हो सकती है ।

Protocol

1. एक biosafety द्वितीय कैबिनेट की तैयारी (बीएससी)

नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ आयोजित किया जाना चाहिए, जबकि अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं का उपयोग करने के लिए सड़न रोकनेवाला तकनीक को प्राप्त करने.

बीएससी सुरक्षात्मक कांच को संचालन ऊंचाई तक उठाएं और लामिना फ्लो प्रशंसकों को चालू करें ।
1. ७०% isopropanol जलीय विलयन का प्रयोग कर कार्य क्षेत्र का स्वच्छता पोछें । पीछे की दीवार और बाजू की दीवारों से बीएससी पोछें और बेस प्लेट के नीचे काम करें ।
2. सभी सामग्री है कि ७०% शराब के साथ परख में इस्तेमाल किया जाएगा पोंछ (isopropanol या etoh) और उंहें बीएससी के अंदर जगह है ।

2. मानव चमड़े की फाइब्रोब्लास्टर्स एक T75 फ्लास्क में सीडिंग

वांछित cryopreserved सेल लाइन के साथ शीशियों को प्राप्त करें (नवजात मानव अधययन फाइब्रोब्लास्ट [hdfn], सेल एकाग्रता पर ५००,००० कोशिकाओं/शीशी, और पारित होने पर p3-p5) ।
1. एक शीशी में कोशिकाओं के साथ प्लेस १.०-सेमी-गहरे पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस की अनुमति देने के लिए । गल शीशी जब तक सेल समाधान के लगभग ७०% तरल है । बीएससी के अंदर शीशी रैक में ७०% अल्कोहल और प्लेस शीशी के साथ शीशी को पोंछ दें ।
  नोट: यह सुनिश्चित करें कि सेल सीडिंग के दौरान संभावित प्रदूषण को रोकने के लिए पानी के धागे या शीशी के कैप के संपर्क में नहीं आता है । पानी के स्नान में कोशिकाओं की पूरी तरह से रोकने की विफलता के रूप में ऐसा करने के लिए अनजाने सेल मौत का कारण हो सकता है ।
10% भ्रूण गोजातीय सीरम (fbs) के साथ पूरक मीडिया के 10 मिलीलीटर बाहर ड्रा । T75 ऊतक संस्कृति फ्लास्क में महाप्राण के लिए एक स्वचालित पाइपटर और 10 मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग करें । मीडिया को पूरी तरह से फ्लास्क के आधार को धीरे से आगे और पीछे की कुप्पी को हिलाकर रख दें ।
1. सेल स्टॉक और शीशी से महाप्राण समाधान के साथ खुला शीशी, पिपेटिंग गति के प्रति सचेत किया जा रहा है, के रूप में कोशिका झिल्ली cryopreservation से कमजोर हो जाएगा.
2. मीडिया के साथ एक T75 ऊतक फ्लास्क करने के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित. ऊतक फ्लास्क में गल सेल बाहर निकालें, फिर से पीकरण गति के प्रति जागरूक किया जा रहा है ।
  नोट: ऊतक फ्लास्क में कोशिकाओं के घनत्व बोने का अनुमान है ६,६०० कोशिकाओं/ उपयोग घनत्व बोने के उपयोगकर्ता और प्रयोग के वांछित समय को समायोजित करने के लिए बदला जा सकता है ।
3. T75 ऊतक फ्लास्क और हस्तांतरण मात्रा वापस शीशी में से मीडिया के 1 मिलीलीटर बाहर उपाय । शीशी वापस T75 flask में से स्थानांतरण मात्रा ।
  नोट: यह चरण प्रदर्शन शीशी से सेल उपज को अधिकतम करने में मदद करता है ।
4. टिशू कल्चर फ्लास्क कैप को कस लें और धीरे से पूरी सतह पर निलंबन में कोशिकाओं को समान रूप से फैलाने के लिए रॉक करें । एक औंधा सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर कोशिकाओं के भी वितरण के लिए जाँच करें ।
सेल प्रकार, तिथि, प्रथमिक, वंश, और प्रयोजन के साथ लेबल फ्लास्क (जैसे, hdfn, 07/11/2018, एनडीसी, गद्यांश 4, आर्सेनिक खरोंच परख) । जगह ऊतक संस्कृति फ्लास्क ३७ डिग्री सेल्सियस और ५.०% सह₂ के लिए ७२ एच में एक ह्यूमिडिफाइड इनकोबेटर में ।
नोट: विकास माध्यम बदल दिया जाना चाहिए 12-24 ज प्रारंभिक बोने के बाद डाइमेथिल sulfoxide की मात्रा का पता लगाने को दूर करने के लिए (dmso) cryopबचाकर, और उसके बाद हर ४८ एच बदल गया है कि सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को ठीक से पाला जाता है. ऊष्मायन और विकास की अवधि खरोंच परख के लिए आवश्यक कोशिकाओं की गणना की संख्या पर निर्भर करेगा । hdfn कोशिकाओं के लिए दोहरीकरण समय सामांय परिस्थितियों में आम तौर पर 16-24 एच है । हालांकि, दुगनी दर ऊंचाई, पीएच, तापमान, आर्द्रता, मध्यम प्रकार, आदिके कारण बदल सकती है, और प्रयोगों की योजना बनाते समय इसके लिए जिंमेदार होना चाहिए ।

3. सेल 12 में गिनती और उपसंस्कृति-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट

इनकोबेटर से T75 ऊतक संस्कृति फ्लास्क को पुनः प्राप्त करें । 10x उद्देश्य आवर्धन (100x कुल इज़ाफ़ा) में एक औंधा खुर्दबीन का उपयोग कर कोशिकाओं का पालन निरीक्षण और अनुमानित सेल संगम का निर्धारण ।
1. ऊतक संस्कृति फ्लास्क के बहुमत स्कैन जब संगम को सुनिश्चित करने के लिए सबसे प्रतिनिधि प्रतिशत का अनुमान है । किसी भी असामान्यताओं के लिए, या बैक्टीरियल और/या फंगल संदूषण के लिए व्यक्तिगत सेल आकारिकी का मूल्यांकन करें ।
एक 10 मिलीलीटर पिपेट टिप के साथ स्वचालित पाइपटर को इकट्ठा । T75 और हस्तांतरण समाधान से एक अपशिष्ट कंटेनर के लिए मीडिया की पूरी मात्रा महाप्राण करने के लिए pipettor का उपयोग करें । पिपेट टिप को सेल का पालन सतह से संपर्क करने से रोकें । एक biohazard बिन में पिपेट टिप छोड़ें ।
1. एक 5 मिलीलीटर पिपेट टिप के साथ स्वचालित पाइपटर को इकट्ठा । संतुलित नमक समाधान के 5 मिलीलीटर महाप्राण, फ्लास्क में बांटना, और धीरे से अतिरिक्त मीडिया, मृत कोशिकाओं, और अपशिष्ट उत्पाद को कुल्ला करने के लिए फ्लास्क रॉक ।
2. T75 से मात्रा ड्रा और अपशिष्ट कंटेनर में बांटना । biohazard बिन में पिपेट टिप छोड़ें ।
3. एक 5 मिलीलीटर पिपेट एडाप्टर के साथ स्वचालित पाइप्टर को इकट्ठा । महाप्राण स्टॉक से ट्रिप्सिन के 2 मिलीलीटर, फ्लास्क में बांटना, और धीरे से पालन कोशिकाओं पर एंजाइम को फैलाने के लिए फ्लास्क को रॉक करें । आसंन सतह की पूरी संतृप्ति सुनिश्चित करें । 2-3 मिनट (min) के लिए इनकुबेटर में ऊतक फ्लास्क रखें ।
  नोट: अधिकतम एंजाइम-सब्सट्रेट प्रतिक्रिया 10 मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए ।
4. एक 10x उद्देश्य लेंस आवर्धन (100x कुल इज़ाफ़ा) में एक औंधा खुर्दबीन के नीचे ऊतक फ्लास्क का निरीक्षण करें । सेल टुकड़ी की सुविधा के लिए कोमल कंपन लागू करें ।
5. ७०% शराब के साथ T75 कुप्पी पोंछ और बीएससी के अंदर जगह है ।
6. एक 5 मिलीलीटर पिपेट टिप के साथ स्वचालित पाइपटर को इकट्ठा । महाप्राण स्टॉक से मीडिया के 5 मिलीलीटर और एंजाइम-सब्सट्रेट प्रतिक्रिया को रोकने के लिए T75 ऊतक फ्लास्क में जोड़ें । मीडिया: trypsin अनुपात 3:1 होना चाहिए । पिपेट ऊपर और नीचे फ्लास्क के आधार 2-3 बार कुल्ला और यह सुनिश्चित करें कि प्रतिक्रिया बंद कर दिया है । कुप्पी से तरल पदार्थ की पूरी मात्रा को महाप्राण और एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें ।
7. मीडिया की एक समान मात्रा के साथ एक दूसरे 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब भरें ।
8. एक एंटीपोडल स्थिति में दोनों 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों को एक दूसरे पर रखें । उपकरण के चल रहे मापदंडों की स्थापना करके 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए केन्द्रापसारक बल के २०० जी लागू करें ।
9. ७०% शराब और बीएससी के अंदर जगह के साथ pelleted कोशिकाओं के साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पोंछ ।
10. एक 5 मिलीलीटर अनुलग्नक के साथ स्वचालित पिपेट का उपयोग करें मीडिया बंद, तरल पदार्थ और सेल गोली के लगभग २५० μl पीछे छोड़ रहा है । पिपेट टिप के स्थान पर ध्यान देना, के रूप में कोशिका गोली अबाधित रहना चाहिए. एक अपशिष्ट कंटेनर में एकत्र की मात्रा बांटना और एक biohazard बिन में टिप त्यागें ।
11. शीशी स्लॉट भर में शंक्वाकार ट्यूब के नीचे चलाने के लिए एक microcentrifuge ट्यूब रैक का उपयोग करें, एक स्विफ्ट कंपन बनाने, परेशान और फिर से निलंबित सेल गोली (कभी कहा जाता है "रैक raking").
  नोट: इस चरण को करने के लिए एक भंवर मिक्सर का उपयोग करने से बचें । गुरुत्वाकर्षण बलों भंवर मिक्सर द्वारा बनाई गई सेल जी बल थ्रेसहोल्ड से अधिक है और lysing पैदा कर सकता है । जब सही ढंग से पूरा किया, नए सेल समाधान कोई शेष गोली के साथ एक बादल मिश्रण के रूप में दिखाई देगा । परिश्रम इस कदम का प्रदर्शन कर एक एकल सेल निलंबन बनाने, जब कोशिकाओं की गिनती में वृद्धि की सटीकता के लिए अग्रणी होगा ।
12. सेल स्टॉक या resuspension करने के लिए मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें । पिपेट कोशिकाओं को किसी भी clumps को तोड़ने के लिए 20 बार ट्यूब की ओर धीरे नीचे । कुल सेल निलंबन की मात्रा रिकॉर्ड और संक्षेप में अलग सेट ।
पिपेट 20 μl of trypan नीला स्टॉक (०.४%) एक ९६-अच्छी तरह से एक बाँझ पिपेट का उपयोग कर थाली के एक खाली कुआं में ।
1. हस्तांतरण से पहले एक समान सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए स्टॉक सेल समाधान मिलाएं । सेल स्टॉक के 20 μl को हटाने के लिए एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करें (ट्यूब दीवारों को छूने से परहेज) । ९६-अच्छी तरह से थाली में trypan नीले समाधान के 20 μl में जोड़ें ।
2. पिपेट धीरे मिश्रण सामग्री के लिए । पिपेट 10 μl coverslip और hemocytometer पर गिनती चैंबर के बीच मिश्रण का ।
3. एक 10x उद्देश्य के तहत कोशिकाओं और ग्रिड का निरीक्षण करें । देखने के क्षेत्र के भीतर नौ बड़े वर्गों का निरीक्षण करें । केवल केंद्र और 4 कोने वर्गों (कुल 5 चौकों) में कोशिकाओं की गणना ।
  नोट: एक सटीक गिनती सुनिश्चित करने के लिए पूरे ग्रिड भर में कोशिकाओं की एक समान वितरण के लिए देखो.
4. ग्रिड के 5 पहचाने गए वर्गों में सभी कोशिकाओं (पारदर्शी और नीला) मिलान करें । अलग से, एक ही 5 चौकों में केवल nonviable (नीली) कोशिकाओं मिलान ।
5. उपयोग व्यवहार्य सेल गणना की गणना:
  जहां x = व्यवहार्य सेल गिनती, एक = कुल कोशिकाओं, ख = गैर व्यवहार्य कोशिकाओं
6. उपयोग व्यवहार्य सेल घनत्व की गणना:
  जहां x = व्यवहार्य सेल घनत्व और y = व्यवहार्य कोशिकाओं का कुल योग ।
7. कुल व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना:
  जहां x = कुल व्यवहार्य कोशिकाओं, वाई = व्यवहार्य सेल घनत्व, एफ = सेल निलंबन मात्रा (एमएल) ।
8. % सेल व्यवहार्यता की गणना:
  जहां x = प्रतिशत सेल व्यवहार्यता, वाई = व्यवहार्य ग्रिड पर गिना कोशिकाओं, एफ = कुल कोशिकाओं ग्रिड पर गिना ।
इमेजिंग के दौरान संदर्भ चिह्नों के रूप में कार्य करने के लिए 12-well प्लेट के नीचे एक क्षैतिज रेखा चिह्नित करें ।
1. व्यवहार्य सेल घनत्व का उपयोग करें (3.3.7 में गणना) एक 12-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली बोने के लिए में सेल स्टॉक को पतला करने के लिए मीडिया की मात्रा की गणना करने के लिए ।
  ध्यान दें: एचडीएफएन कोशिकाओं के लिए इष्टतम सेल सीडिंग घनत्व ५,००० कोशिकाओं/सेमी²है ।
2. १९,००० कोशिकाओं को पतला सेल स्टॉक/एमएल का उपयोग कर मीडिया और बीज सेल स्टॉक के 1 मिलीलीटर के साथ हर अच्छी तरह से । सभी 12 कुओं भर में भी सेल बोने सुनिश्चित करने के लिए समय के सेल स्टॉक मिक्स ।
3. प्रत्येक प्लेट को सेल प्रकार, वंश, उपयोगकर्ता प्रथमत और उद्देश्य के साथ लेबल करें । ३७ डिग्री सेल्सियस और ५.०% सीओ₂के लिए सेट इनसेबेटर में प्लेट्स प्लेस । कोशिकाओं को बढ़ने की अनुमति जब तक १००% संगम खरोंच परख के लिए प्राप्त की है ।

4. आर्सेनिक (के रूप में) स्टॉक समाधान और गणना

10, १.०, ०.१, और ०.०१ μm के काम की सांद्रता में 10% fbs के साथ सेल संस्कृति मीडिया में सीधे सोडियम आर्सेनाइट (naaso₂) पतला ।
इसके लिए, सोडियम आर्सेनाइट के ३.९ मिलीग्राम को 30 मिलीलीटर मीडिया में पतला करके समाधान के रूप में एक प्रारंभिक 1 मिमी स्टॉक बनाएं । प्रश्नपत्र समाधान के रूप में शेष के लिए 1 मिमी स्टॉक को पतला कर रहा है ।

१००० μm स्टॉक के रूप में परिकलन	आर्सेनिक कार्य स्टॉक सांद्रता	m₁v₁= m₂v₂	पिछले आर्सेनिक समाधान की मात्रा	मीडिया की मात्रा	आर्सेनिक काम कर रहे स्टॉक की कुल मात्रा
नासो₂ आण्विक वजन: १२९.९ g/	10 μm के रूप में	(एक्स एमएल) (१,००० μm) = (30 मिलीलीटर) (10 μm) x = ०.३ मिलीलीटर	समाधान के रूप में 1mm की ०.३ मिलीलीटर = ३०० μl	२९.७ मिलीलीटर मीडिया	30
.03 l x .001 mol/l x १३० g/mol = ३.९ mg of आर्सेनिक	१.० μm के रूप में	(एक्स एमएल) (10 μm) = (30 मिलीलीटर) (1 μm) x = 3 मिलीलीटर	समाधान के रूप में 10 μm की 3 मिलीलीटर	मीडिया के 27 एमएल	30
पतला ३.९ मिलीग्राम सोडियम आर्सेनाइट की 30 मिलीलीटर मीडिया में	०.१ μm के रूप में	(एक्स एमएल) (1 μm) = (30 मिलीलीटर) (0.1 μm) x = 3 मिलीलीटर	1 μm के रूप में 3 मिलीलीटर	मीडिया के 27 एमएल	30
	०.०१ μm के रूप में	(एक्स एमएल) (०.१ μm) = (30 मिलीलीटर) (0.01 μm) x = 3 मिलीलीटर	3 मिलीलीटर के रूप में ०.१ μm	मीडिया के 27 एमएल	30

तालिका 1. आर्सेनिक स्टॉक्स और सीरियल dilutions । यह तालिका उपचार समूहों के लिए स्टॉक समाधान और कार्यशील स्टॉक समाधानों के रूप में बनाने के लिए प्रयुक्त परिकलन समझाती है ।

5. खरोंच परख तकनीक और आर्सेनिक संदूषण

इनकोबेटर से कोशिकाओं के साथ एक 12-अच्छी थाली प्राप्त करें । एक 10x उद्देश्य आवर्धन (100x कुल इज़ाफ़ा) पर कोशिकाओं को देखें । प्रत्येक कुआं के भीतर सेल संगम का निर्धारण करें ।
नोट: प्रत्येक व्यक्ति को अच्छी तरह से १००% संगम तक पहुंचने से पहले scratching चाहिए । यह महत्वपूर्ण कदम परख के भीतर निरंतरता सुनिश्चित करता है और प्रयोगों में परख प्रोटोकॉल मानकीकरण में मदद मिलती है । यदि कोई कुएं १००% संगम पर नहीं पहुंचा है, तो कोशिकाओं को अतिरिक्त समय के लिए सेते करने की अनुमति दें जब तक कि सभी कुओं में १००% संगम नहीं पहुंचे । कुओं में अतिरिक्त वृद्धि का समय जो पहले ही १००% संगम पर पहुंच गया है, प्रभावित नहीं होगा । संगामी कोशिकाओं को आम तौर पर विकास हो जाएगा और गिरफ्तार एक monolayer संस्कृति के रूप में बने रहते हैं, जबकि उप संगामी कुओं १००% संगम तक पहुंचने की अनुमति ।
एक 10 मिलीलीटर पिपेट टिप के साथ एक स्वचालित पाइपटर को इकट्ठा । विकास मीडिया के सभी कुओं से बाहर महाप्राण । तरल अपशिष्ट में मात्रा और biohazards बिन में पिपेट टिप निपटान ।
1. एक 1-200 μl बाँझ टिप के साथ एक p200 pipettor इकट्ठा । एक अच्छी तरह से, एक खरोंच "नकली घाव" सेल सतह भर में टिप ग्लाइडिंग से एक 12-बजे से 6 बजे के लिए स्थान का उत्पादन ।
  नोट: तीन कारकों है कि बहुत स्थिरता को प्रभावित करेगा गति, दबाव, और टिप कोण हैं । खरोंच एक निरंतर दबाव के साथ तेजी से किया जाना चाहिए, जबकि टिप कोण के प्रति सचेत किया जा रहा है थाली के आधार के लम्बवत् रहने. scratching भी धीरे से कुटिल लाइनों का कारण होगा, अतिरिक्त दबाव स्थायी रूप से सेल पालन सतहों स्कोर कर सकते हैं, और एक टिप कोण से कम ९० ° खरोंच चौड़ाई संकीर्ण होगा । इन आम गलतियों में से कोई भी बदल प्रवास दरों और पैटर्न में परिणाम कर सकते हैं ।
2. अच्छी तरह से प्रति संतुलित नमक समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ rinsing द्वारा अतिरिक्त मलबे और सेल clumps दूर साफ़ करें । थाली को साइड-साइड में धोने की सुविधा के लिए रॉक करें । कुओं से संतुलित नमक समाधान निकालें और एक अपशिष्ट कंटेनर में निपटान । biohazards बिन में 5 मिलीलीटर पिपेट टिप का निपटान ।

चित्रा 1: खरोंच परख के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । संदूषण की संभावना को कम करने के लिए सभी काम एक सड़न रोकनेवाला क्षेत्र के भीतर किया जाता है । कोशिकाएं ऊतक संवर्धन में वांछित घनत्व पर बोये जाते हैं और मानव शारीरिक परिस्थितियों (5% सह₂, ३७ डिग्री सेल्सियस) के लिए एक इनकुबेटर में उगाई जाती हैं । एक वांछित संगम तक पहुँचने पर, कोशिकाओं को एक वांछित बोने घनत्व में 12-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों में aseptically उप-संवर्धित कर रहे हैं । कोशिकाओं 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में १००% संगम के लिए बड़े हो रहे हैं और एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग खरोंच । यह "खरोंच" एक में विट्रो नकली घाव बनाता है (डबल सिर का तीर द्वारा चिह्नित), जिसमें कोशिकाओं को स्वाभाविक रूप से खुले क्षेत्र को बंद करने के लिए माइग्रेट. प्रत्येक अच्छी तरह से विशिष्ट वातानुकूलित किया जा सकता है और सेलुलर प्रवास दरों अलग उपचार शर्तों के जवाब में देखा और मात्रा निर्धारित जा सकता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

एक १,००० μl टिप के साथ एक p1000 pipettor का उपयोग करें एक उपचार समूह के साथ बेतरतीब ढंग से सौंपा गया है कि कुओं में आर्सेनिक शेयरों से पिपेट १,००० μl. पार संदूषण को रोकने के लिए एक अच्छी तरह के लिए एक नया पिपेट टिप का प्रयोग करें । जब उपचार जोड़ा जाता है समय रिकॉर्ड । 12-अच्छी तरह से एक मशीन ३७ डिग्री सेल्सियस और ५.०% सह₂पर सेट में प्लेटों प्लेस ।

6. इमेजिंग

एक 24 एच अवधि (0, 4, 8, 12, 16, 20, और 24 एच) से अधिक हर 4 एच में 10x उद्देश्य आवर्धन पर एक अच्छी तरह से कब्जा छवियों । संदर्भ लाइन पहले थाली के तल पर एक अच्छी तरह से बाद के समय अंक में खरोंच के साथ एक ही स्थान छवि के लिए तैयार की ।
नोट: यह जरूरी है कि एक ही स्थान पर हर समय तस्वीर के लिए सटीक छवि विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए और प्रतिनिधि डेटा प्राप्त कर रहे हैं ।

7. छवि विश्लेषण

अपलोड छवियों को एक कंप्यूटर के लिए उल्टे प्रकाश खुर्दबीन पर कब्जा कर लिया और एक विस्तृत फ़ाइल नाम के साथ एक JPEG छवि के रूप में सहेजें ।
ओपन imagej.
सॉफ्टवेयर के लिए ज्ञात दूरी के साथ एक मंच माइक्रोमीटर की एक छवि अपलोड करने के लिए पिक्सेल मिलीमीटर (मिमी) को बदलने के लिए जब खींच और सॉफ्टवेयर विंडो में फ़ाइल छोड़ने के द्वारा छवि माप ले.
नोट: माइक्रोमीटर लाइनों एक ज्ञात 1 मिमी लंबाई demarcating होना चाहिए और छवि कोशिकाओं की छवियों पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया एक ही आवर्धन पर लिया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, इस अध्ययन छवियों में 100x कुल आवर्धन पर ले जाया गया, इस प्रकार मंच माइक्रोमीटर की छवि 100x कुल इज़ाफ़ा पर लिया गया था ।
1. सीधे, खंडित , या मुक्तहस्त रेखाएं विकल्प क्लिक करें ।
2. प्रत्येक टिक मार्क्स से जुड़ी लंबाई वाले टिक-मार्क्स का उपयोग करते हुए माइक्रोमीटर इमेज पर ज्ञात दूरी की रेखा खींचें । एक सीधी रेखा आरेखित करने के लिए: माउस क्लिक करें, होल्ड करें, कर्सर को इच्छित स्थान पर खींचें, फिर माउस के जाने दें ।
3. विश्लेषण करें चुनें और फिर स्केल सेटकरें चुनें.
4. पिछले चरण में खींची गई रेखा की ज्ञात लंबाई से ज्ञात दूरी निर्धारित करें ।
5. मिमीके लिए लंबाई की इकाई सेट करें ।
6. वैश्विक बॉक्स की जाँच करें ।
7. मेनू से बाहर निकलने के लिए ठीक का चयन करें ।
8. मंच माइक्रोमीटर छवि के बाहर बंद करो ।
विंडो में छवि फ़ाइल खींचकर और छोड़ने के द्वारा imagej में एक खरोंच परख छवि अपलोड करें ।
1. स्क्रैच की चौड़ाई में एक सीधी रेखा आरेखित करें (बाएं अग्रणी किनारे से दाएं अग्रणी किनारे तक) ।
2. खींची गई सीधी रेखा की माप को रिकॉर्ड करने के लिए कीबोर्ड पर अक्षर M दबाएं । अक्षर Mलिखने के बाद एक छोटा सा परिणाम विंडो तुरंत दिखाई देगा । यह वह जगह है जहां चौड़ाई माप होगी ।
दोहराएं चरण ७.४ स्क्रैच की लंबाई के साथ 10 माप प्राप्त करने के लिए 10 बार की कुल ।
नोट: यह खरोंच की पूरी लंबाई नीचे सबसे representational चौड़ाई मूल्यों को उत्पंन करने के लिए महत्वपूर्ण है । ऊपर से नीचे तक खरोंच की लंबाई के साथ समान रूप से 10 चौड़ाई माप बाहर अंतरिक्ष के लिए सुनिश्चित करें ।
कॉपी और माप पेस्ट करने के लिए एक खरोंच परख स्प्रेडशीट फ़ाइल बनाएँ ।
1. एक स्प्रेडशीट फ़ाइल (तालिका 2) में उचित कॉलम में परिणाम विंडो से 10 चौड़ाई माप की प्रतिलिपि बनाएं और चिपकाएं ।
  नोट: जब मापन परिणाम विंडो से कॉपी किए जाते हैं और स्प्रेडशीट में चिपकाए जाते हैं, तो मानों के बाहरी स्तंभ होंगे; इन मानों को हटाया जाना चाहिए, केवल 10 चौड़ाई माप के संरक्षण ।

10 यादृच्छिक चौड़ाई मापन	0 ज	4 ज	8 ज	12 ज	16 ज	20 ज	24 ज
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
10 मापन का औसत

तालिका 2. Raw चौड़ाई माप तालिका स्वरूप । इस तालिका से प्राप्त कच्चे माप के लिए संगठनात्मक संरचना को दर्शाता है ।

खरोंच परख छवियों के शेष के लिए ऊपर के कदम दोहराएं ।
प्रत्येक समय बिंदु पर 10 माप के औसत की गणना (0-24 एच) हर अच्छी तरह के लिए.
प्रतिशत बंद परिकलन मान से चरण ७.८ का उपयोग कर निर्धारित करें ।
1. "चौड़ाई मापन औसत" (तालिका 3) शीर्षक वाली स्प्रेडशीट के नीचे एक तालिका बनाएं ।
2. की प्रतिलिपि बनाएं और चिपकाएं 10 माप पंक्ति में ७.८ चरण में परिकलित "चौड़ाई माप औसत" तालिका ।
3. चौड़ाई माप औसत तालिका के आगे कोई अंय तालिका बनाएं । शीर्षक इस तालिका प्रतिशत घाव बंद (तालिका 4) ।
  नोट: स्क्रैच 0% सभी कुओं के लिए प्रारंभिक 0 h फोटो पर बंद कर दिया है, क्योंकि प्रत्येक अच्छी तरह के लिए 0 h स्तंभ में मान 0 होना चाहिए ।
4. (4 ज) पर अगले कॉलम में नेविगेट करें ।
5. 4, 8, 12, 16, 20 और 24 h समय बिंदुओं के लिए प्रतिशत बंद करने की गणना:
  
  कहां, एक्स = प्रतिशत बंद, मैं प्रारंभिक खरोंच चौड़ाई (0 एच चौड़ाई), एफ = अंतिम खरोंच चौड़ाई (4, 8, 12, 16, 20, या 24 एच चौड़ाई) = ।

अच्छी तरह से चौड़ाई औसत	0 ज	4 ज	8 ज	12 ज	16 ज	20 ज	24 ज
1a
2a
3a
4a
1b
2b
3b
4b
1c
2c
3c
4c

तालिका 3. चौड़ाई माप औसत तालिका स्वरूप । यह तालिका चौड़ाई माप औसत तालिका 2में raw चौड़ाई माप का उपयोग करके परिकलित के लिए संगठनात्मक संरचना दिखाती है ।

अच्छा	0 ज	4 ज	8 ज	12 ज	16 ज	20 ज	24 ज
1a	0
2a	0
3a	0
4a	0
1b	0
2b	0
3b	0
4b	0
1c	0
2c	0
3c	0
4c	0

तालिका 4. प्रतिशत घाव बंद करने तालिका स्वरूप । यह तालिका तालिका 3में चौड़ाई माप औसत का उपयोग करके परिकलित प्रतिशत घाव बंद करने वाले मानों के लिए संगठनात्मक संरचना दिखाती है.

प्रतिशत घाव बंद करने तालिका के आगे किसी अन्य तालिका बनाएँ । शीर्षक यह तालिका auc (तालिका 5) ।
1. प्रत्येक के लिए 0-4 h स्तंभ में वक्र (auc) मान के अंतर्गत 0-4 h क्षेत्र की गणना करें:
  
  जहां x = 0-4 h auc मान, a =% बंद करने के लिए मान 0 h, b =% बंद करने के लिए मान 4 h, h = दो उपायों के बीच का समय (इस अध्ययन में 4 ज) ।
2. प्रत्येक के लिए 4-8 h स्तंभ में वक्र (auc) मान के अंतर्गत 4-8 h क्षेत्र की गणना करें:
  
  जहां x = 4-8 h auc मान, a =% बंद करने के लिए मान 4 h, b =% बंद करने के लिए मान 8 h, h = दो उपायों के बीच का समय (इस अध्ययन में 4 ज) ।
  नोट: एक auc मान प्रत्येक 4 h समय अंतराल के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 24 h अवधि के लिए परिकलित किया जाना चाहिए ।
3. 0-24 ज (चरण 7.10.1-7.10.2) से प्रत्येक अच्छी तरह के लिए एक अभिव्यक्त auc मूल्य प्राप्त करने के लिए सभी auc मूल्यों के Sum. सुनिश्चित करें कि ये मान सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए ठीक से सहेजे गए हैं ।

अच्छा	0-4 ज	4-8 ज	8-12 ज	12-16 ज	16-20 ज	20-24 ज	summed auc
1a
2a
3a
4a
1b
2b
3b
4b
1c
2c
3c
4c

तालिका 5. auc तालिका स्वरूप । यह तालिका तालिका 4में प्रतिशत घाव बंद मानों का उपयोग करके परिकलित किए गए auc मानों के लिए संगठनात्मक संरचना दिखाती है.

8. सांख्यिकीय विश्लेषण

सांख्यिकीय विश्लेषण विधि है कि सबसे अच्छा दोनों प्रयोगात्मक डिजाइन फिट बैठता है और परख के दौरान प्राप्त auc मूल्यों अभिव्यक्त किया निर्धारित करें ।

Representative Results

सभी उपचार समूहों के लिए नमूना आकार (n) n = 28 था । कोशिकाओं को सफलतापूर्वक सड़न रोकनेवाला तकनीकों और प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के बाद (चित्रा 1) सुसंस्कृत थे । वर्दी खरोंच मतलब खरोंच ०.८ मिमी ०.४ मिमी (चित्रा 2) को मापने चौड़ाई के साथ सभी उपचार समूहों में मनाया गया । नियंत्रण समूह १,३५५.८३ के वक्र मान के अंतर्गत एक औसत अभिव्यक्त किया क्षेत्र था; ०.०१ μm के रूप में उपचार समूहों की वक्र मूल्य के तहत एक औसत अभिव्यक्त किया क्षेत्र था १,३६६.२१; ०.१ μm उपचार समूह के रूप में एक औसत अभिव्यक्त किया क्षेत्र था १,३२६.२४ के वक्र मूल्य के तहत, १.० μm के रूप में उपचार दल के एक औसत अभिव्यक्त किया क्षेत्र था १,२९५.१० की वक्र मूल्य के तहत; और अंत में उपचार समूह के रूप में 10 μm ५३५.१२ के वक्र मूल्य के तहत एक औसत अभिव्यक्त किया क्षेत्र था, जो सांख्यिकीय रूप से कम था अन्य सभी समूहों (पी < ०.०५) (चित्रा 3) की तुलना में. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए आर-प्रोग्राम का उपयोग एक-तरफ़ा anova को एक टकी पोस्ट हॉक समायोजन के साथ चलाने के लिए किया गया था जो उपचार समूहों (p < ०.०५) के बीच सांख्यिकीय अंतर निर्धारित करता है.

चित्रा 2: एक 20 एच अवधि में प्रतिनिधि खरोंच परख छवियां । छवियां A-D नियंत्रण कक्षों के सेलुलर माइग्रेशन का प्रतिनिधित्व करती हैं; छवियां ई एच के रूप में १.० μm के साथ दूषित कोशिकाओं के सेलुलर प्रवास का प्रतिनिधित्व; छवियां I-L 10 μm के साथ संदूषित कोशिकाओं के सेलुलर प्रवास का प्रतिनिधित्व करते हैं । इन छवियों से, यह स्पष्ट है कि सेलुलर प्रवास आर्सेनिक की उपस्थिति में धीमा है । नियंत्रण छवियों को दिखाने के एक पूरी तरह से "चंगा" खरोंच के बाद 20 ज, जबकि अंय दो के रूप में उपचार समूहों "चंगा" नहीं थे । उपचार के रूप में 10 μm पूरी तरह से बंद होने से हिचकते 24 ज. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

चित्रा 3: आर्सेनिक खरोंच परख में सेलुलर प्रवास धीमा कर देती है । छवियों आर्सेनिक की बदलती सांद्रता की उपस्थिति में सेलुलर माइग्रेशन दरों में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए एक 24 एच अवधि पर कब्जा कर लिया गया. कच्चे छवियों एक स्वचालित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया (जैसे, matlab में), जो शुरू में घाव की चौड़ाई मापा, तो गणना प्रतिशत बंद करने और अंत में वक्र के तहत क्षेत्र (auc) । त्रुटि पट्टियां माध्य के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं । 10 μm उपचार समूह के रूप में सांख्यिकीय मानव चमड़े की फाइब्रोब्लास्ट नवजात (hdfn), एक सांख्यिकीय कम auc मूल्य द्वारा दिखाए गए सेलुलर माइग्रेशन धीमा, अन्य सभी उपचार समूहों की तुलना में एक एक तरह से anova का उपयोग कर के साथ एक tukey पोस्ट हॉक समायोजन (p < 0.05). सांख्यिकीय मतभेद पत्र द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं "एक" और "बी", जो कॉम्पैक्ट पत्र प्रदर्शन विधि आर कार्यक्रम में उपलब्ध का उपयोग कर के माध्यम से प्राप्त किए गए. उपचार है कि एक आम पत्र का हिस्सा नहीं है सांख्यिकीय एक दूसरे से महत्वपूर्ण (पी < 0.05) हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Discussion

इस परख के आवेदन सेलुलर प्रवास के एक उच्च throughput और समय पर मूल्यांकन प्रदान करता है और सीधे जटिल शारीरिक प्रणालियों के लिए अनुवाद कर सकते है⁵^,⁶^,⁷। इस कारण से, प्रस्तावित बेंच-टॉप मॉडल को देखते हुए और घाव हीलिंग⁶पर विभिन्न चिकित्सीय एजेंटों और पर्यावरणीय विषाक्त पदार्थों के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए अभ्यास किया गया है । वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल आर्सेनिक की सांद्रता ज्ञात जोखिम के स्तर की व्यापक साहित्य खोज के माध्यम से पर्यावरण की दृष्टि से प्रासंगिक समझा रहे थे, और विभिन्न डेटा ठिकानों की पूर्वव्यापी समीक्षा से¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹. इस का उपयोग करें इन विट्रो खरोंच परख का प्रदर्शन किया है कि उच्च के भीतर एक आर्सेनिक एकाग्रता के लिए जोखिम, लेकिन पर्यावरण की दृष्टि से प्रासंगिक रेंज, घाव बंद करने में देरी (सेलुलर प्रवास) ।

इस बेंच शीर्ष मॉडल भी अलग करने के लिए नियोजित किया गया था और एक व्यक्तिगत सेल लाइन (रेशकोरक) का अध्ययन करने के लिए आगे कैसे रेशकोरक माइग्रेशन घाव भरने के परिणामों के लिए योगदान देता है समझने के लिए. इसके अलावा, कई अन्य कोशिकाओं और ऊतकों मौजूद है कि विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के साथ vivo प्रणालियों में जटिल में एक व्यक्तिगत सेल लाइन के कार्यों का अध्ययन करने के लिए मुश्किल है । इसके अतिरिक्त, परख अर्द्ध मात्रात्मक प्रतिशत घाव बंद करने के डेटा है कि विशिष्ट सेलुलर तंत्र के माध्यम से जो यौगिकों घाव भरने को प्रभावित कर सकते है लक्ष्य इस्तेमाल किया जा सकता है प्राप्त करने का एक साधन प्रदान करता है । उदाहरण के लिए, खरोंच परख में इस्तेमाल किया कोशिकाओं को एकत्र किया जा सकता है और एक वांछित अभिकर्मक में संग्रहीत और जीन अभिव्यक्ति में इस्तेमाल किया (संकेत mrna) या प्रोटीन अभिव्यक्ति²²assays । यह जानकारी जांचकर्ता के लिए उपयोगी हो सकता है अगर वे समझने की क्या संकेतों या प्रोटीन मोटे तौर पर अलग उपचार (यानी, आर्सेनिक)²²की उपस्थिति में सेलुलर प्रवास में परिवर्तन करने के लिए योगदान हो सकता है की तलाश कर सकते हैं ।

मानव नवजात त्वचीय फाइब्रोब्लास्टर्स को घाव भरने में उनकी प्रमुख भूमिका के आधार पर इस काम के लिए चुना गया था । हालांकि, इस खरोंच परख प्रोटोकॉल विभिंन प्रकार के सेल का उपयोग कर लागू किया गया है और अनुसंधान प्रयोजनों की एक सीमा के लिए । उदाहरण के लिए, खरोंच परख रसायन चिकित्सा दवाओं के प्रवासन निषेध का अध्ययन करने के लिए ऑन्कोलॉजी के क्षेत्र में अपनाया गया है²³; कंकाल मांसपेशी सेल प्रवास, प्रसार, और प्रसार के लिए²⁴; सेलुलर माइग्रेशन²⁵पर संयंत्र निष्कर्षों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए; और समझने के लिए कैसे केराटिनोसाइट माइग्रेशन और प्रसार के लिए योगदान घाव हीलिंग⁹. इसके अतिरिक्त, pinto एट अल द्वारा एक पिछले कागज, यूरेनियम के प्रभाव का मूल्यांकन (यू) और प्लेटलेट रिच प्लाज्मा (prp) hdfn माइग्रेशन पर खरोंच परख⁶का उपयोग कर । इस काम का उद्देश्य हद तक जो इस परख एक एजेंट के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए सेलुलर माइग्रेशन (यू) धीमा करने के लिए सोचा था, साथ ही एक एजेंट सेलुलर माइग्रेशन (पीआरपी) की गति के लिए सोचा था समझ गया था । के रूप में aforementioned काम और अंय जांचकर्ताओं द्वारा अनुसंधान में देखा जा सकता है, खरोंच परख के आवेदन विभिंन प्रायोगिक²⁶मॉडलों में उपयोग के लिए उच्च क्षमता है । तरीकों के भीतर प्रदान की विस्तार के बावजूद, प्रसरण जांचकर्ताओं और प्रयोगों के बीच की उंमीद की जानी चाहिए । उदाहरण के लिए, सेलुलर प्रवास दरों की संभावना अद्वितीय सेल प्रकार के लिए आवश्यक माइक्रोंयूट्रेंट्स के अलावा, उपयोग में सेल लाइन के आधार पर उतार चढ़ाव होगा । सेल उपज और व्यवहार्यता में सहायता करने के लिए महत्वपूर्ण टिप्पणियों के कई इस प्रोटोकॉल के दौरान नोटों के रूप में सूचीबद्ध हैं । हालांकि, यह पुरजोर अनुशंसित है कि जांचकर्ताओं इष्टतम वृद्धि शर्तों के लिए निर्माता की सिफारिशों का पालन करें, और सामांय सेल कल्चर कार्य के लिए अनुपूरक अनुदेश के रूप में इस पद्धति का उपयोग करें ।

हालांकि खरोंच परख सेलुलर गतिविधि के अध्ययन के लिए अत्यंत बहुमुखी है; अप्रत्याशित पूर्वाग्रहों की तकनीक मापने में उत्पन्न हो सकती है । उदाहरण के लिए, imagej का उपयोग करते समय मैंयुअल रूप से कक्ष माइग्रेशन मोर्चों का पता लगाने के लिए, भिन्नता उपयोगकर्ताओं के बीच मौजूद हो सकती है, जो सटीकता और प्रतिनिधि डेटा संग्रह को सीमित कर सकते हैं. यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि माइग्रेशन मोर्चों उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह को कम करने के लिए इलाज के लिए अंधा पढ़ा जाना चाहिए. इसके अलावा, मैन्युअल रूप से माइग्रेशन मोर्चों की पहचान करने के परिणामस्वरूप कोशिकाओं द्वारा स्यूटोपॉड गठन के कारण यात्रा की औसत दूरी की गलत गणना हो सकती है और फोकल आसंजन बनाने के लिए बाहर पहुंचने की उनकी क्षमता है, जो नेत्रहीन भ्रामक हो सकते हैं । तरह में, फ्लोरोसेंट सेल ट्रैकर का उपयोग "सेल सतह या परमाणु प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्रवास पर रंजक अनजाने में समय के साथ सेलुलर प्रवास को मापने जब inaccuracies में जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं को ठीक कर सकते हैं । यह अनुशंसित है कि उपयुक्त धनात्मक और/या ऋणात्मक नियंत्रणों को कक्ष रेखाओं पर उपचार के प्रभाव को पूरी तरह से गधों में प्रयोग के भीतर नामांकित किया जाए । इस परख का अभ्यास अपनी सीमाओं की मांयता में पूरा किया जाना चाहिए । इस परख गारंटी नहीं है कि सेलुलर प्रवास के परिणाम में विट्रो प्रयोग से प्राप्त सीधे vivo परिणामों में अनुवाद करेंगे। एक जटिल जीवन प्रणाली में घाव भरने और सेलुलर प्रवास में सेल प्रकार और आणविक संकेतों की एक भीड़ शामिल है; जिनमें से प्रत्येक के लिए चिकित्सा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करने की क्षमता है ।

संक्षेप में, खरोंच परख को बदलने के वातावरण⁶^,²⁵के जवाब में सेलुलर प्रवास के उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रदान पाया गया है । हम विशेष रूप से सफलतापूर्वक विभिन्न पर्यावरण की दृष्टि से प्रासंगिक खुराक पर आर्सेनिक जोखिम का एक परिणाम के रूप में सेलुलर प्रवास में परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया. इन आंकड़ों के लिए खरोंच परख का उपयोग करने के लिए आगे अध्ययन और इस परख में सेलुलर प्रवास के यंत्रवादी रास्ते का मूल्यांकन और कैसे इन रास्ते आर्सेनिक एक्सपोजर द्वारा बदल रहे है औचित्य प्रदान की है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस प्रकाशन में अनुसंधान की रिपोर्ट राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के अल्पसंख्यक स्वास्थ्य और स्वास्थ्य के अपार्टीज पर नेशनल इंस्टीट्यूट द्वारा पुरस्कार संख्या U54MD012388 के तहत समर्थन किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Class II A/B3 Biological Safety Cabinet	Forma Scientific	15201-816
Nitrile Gloves	Kimberly-Clark	55082
Water Bath	Precision	Model 182
Inverted Microscope	Leica	Q080318
CPR Centrifuge	Beckman	349702
Analytical Scale	Ohaus	I093 1125062111P
Weighting paper	VWR	H351125781212A
Biohazard bags	Fisherbran	01-830A
Water Jacketed CO₂Incubator	Thermo Scientific	309739-31053
Hanks Balanced Salt Solution	Gibco	14175-095
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	10566-016
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079
Automatic Pipettor	Drummond	140685
p200 Pipette	Gilson
p20 Pipette	Gilson
Denominator	Fisher Scientific	D59707
Trypan Blue Stain	Gibco	15250-061
T75 tissue flask	Corning	430725U
15 mL Conical Tube	Fisherbrand	05-539-5
50 mL Conical Tube	VWR	21008-178
5 mL Pipette	Fisherbrand	13-678-11D
10 mL Pipette	Fisherbrand	13-678-11E
Tissue Marker	Securline	92167
Wipes	Kintech	34155
70% Ethanol	Fisher	63-67-0
Non-Filter Pipet Tips	Fisherbrand	16160210
Bleach	Great Value	220-04
96-well	Falcon	353915
Cryovial Rack	Nalgene	5030-0505
Hemacytometer	Gizmo Supply	B00SCOGY56
TrypLE Express	Gibco	12605-028
Conical Tube Rack	n/a	n/a
12-well plate	Corning	3598
Waste Beaker	n/a	n/a
1 mL Pipette	Fisherbrand	13-678-11B
Straight Edge Ruler	n/a	n/a
Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn)	lot: 1734, 2902	106-05n
Rstudio Statistical Software		ver: 3.5.1
Image J	NIH	ver: 1.8.0_112

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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इन विट्रो खरोंच परख त्वचा सेल प्रवास पर आर्सेनिक के प्रभाव का प्रदर्शन करने के लिए

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