Denna studie fokuserar på en in vitro- modell av såret helande (scratch assay) som en mekanism för att fastställa hur miljögifter såsom arsenik inflytande cellulära migration. Resultaten visar att denna in vitro -analys ger snabba och tidiga indikationer på förändringar i cellulära migration före in-vivo -experiment.
Förstå de fysiologiska mekanismerna bakom sårläkning har varit i fokus för pågående forskning i många år. Denna forskning översätter direkt till förändringar i kliniska standarder som används för att behandla sår och minska sjuklighet och dödlighet för patienter. Sårläkning är en komplex process som kräver strategiska cell och vävnad interaktion och funktion. En av de många kritiskt viktiga funktionerna i sårläkning är individuella och kollektiva cellulära migration. Vid skada migrera olika celler från blodet, omgivande bindväv och epitelial vävnader snabbt till sårområdet genom kemiska eller fysiska stimuli. Denna migration svar kan till stor del diktera resultaten och framgång av ett läkande sår. Förstå detta särskilda cellulär funktion är viktigt för translationell medicin som kan leda till förbättrad sårläkning utfall. Här beskriver vi ett protokoll som används för att bättre förstå cellulära migration den avser sårläkning och hur förändringar till den cellulära miljön kan markant ändra denna process. I detta exempel studie odlades dermal fibroblaster i media kompletteras med fetalt bovint serum (FBS) som enskiktslager kulturer i vävnadsodling kolvar. Cellerna var aseptiskt överförs i vävnadsodling behandlas 12-bra plattor och vuxit till 100% sammanflödet. När du når sammanflödet, var cellerna i enskiktslager vertikalt kliade användande en p200 Pipettera spets. Arsenik som utspädd i kultur media kompletteras med FBS lades till enskilda brunnar på miljömässigt relevanta doser 0,1-10 M. bilder fångades var 4 timmar (h) under en 24 h period med ett inverterat ljusmikroskop att iaktta cellulära migration (sår stängning). Bilder individuellt analyserade med bild analys programvara, och procent såret stängning beräknades. Resultaten visar att arsenik långsammare sårläkning. Denna teknik ger en snabb och billig första skärm för utvärdering av effekterna av föroreningar på sårläkning.
Sårläkning består av en komplex serie överlappande steg som involverar olika celltyper, signalmolekyler och extracellulär matrix komponenter1. Tillsammans arbetar dessa komponenter i samförstånd för att uppnå såret upplösning eller reparation, som i slutändan leder till bildandet av ett skyddande fibrotisk ärr beroende på graden av trauma1. För att fånga de enskilda processer och funktioner för såret är läka i ett experiment svårt; enskilda steg inom sårläkningsprocessen behöver identifieras och testas separat. Bland de många stegen av sårläkning, har processen för cellulära migration ansetts vara kritisk när du utvärderar helande priser2. Cellulära migration kan observeras i alla faser av sårläkning, och således kräver ytterligare förståelse för hur förändringar av cellmigration kan påverka sårslutning. Cellulära migration ses exempelvis i både tidiga och sena fas inflammation, med blod koagulation och trombocyter aggregering på såret plats3. Dessa händelser förhindra kraftig blodförlust genom att bilda en tillfällig blockering för att fylla sårade områden saknar vävnad3. Trombocyter i omlopp kommer att syntetisera och utsöndrar vasoaktiv medlare tillsammans med kemotaktiska faktorer, vilka tillsammans signal för inflammatoriska leukocytmigration (vita blodkroppar) på den skadade vävnaden för reparera4. Återepitelisation uppstår inom timmar efter vävnadsskada och innebär som täcker såret webbplatsen genom aktivitet och migrering av epitelial keratinocyter att förhindra ytterligare förorening eller invasion av främmande partiklar i såret plats2. Dessa exempel fånga bara några av de många cellmigration funktioner är associerad med sårläkning.
Scratch analysen har beskrivits och används för att bättre förstå cellmigration och dess många roller i sårläkning5,6. Denna analys anses förenklade, ger hög genomströmning och gör det möjligt för utredaren att samla in representativa cell migration uppgifter. Migration-analyser har framgångsrikt visat att vissa föreningar kan accelerera eller bromsa av cellulära migration6. Dessutom ger dessa analysens resultat translationell fysiologisk information som kan användas för att formulera mål behandlingar, dosering koncentrationer och gener av intresse före in-vivo -experiment. Analysen kräver grundläggande cell kultur tekniker och leveranser, en cell fodrar av val, och bildteknik för att fånga rörelse över tid eller rörelse som svar på behandlingar.
Analysen kan lätt manipuleras eller skräddarsydda för att passa behoven hos utredaren. Men finns det fyra grundläggande frågor att överväga innan experiment. Vilka allmänna eller specifika fråga är den försöksledarna som samtliga försöker besvara? Detta gäller för de flesta hypoteser driven forskning; Det är dock kritisk till denna analys eftersom det kommer avgöra många av parametrarna som behövs för att korrekt och fullständigt besvara frågan/frågorna. Vad cellinje eller cellinjer (om flera) ska användas att representera den fysiologiska system studeras? Till exempel i en kutan sår helande studie, en dermal fibroblast5,6,7, stem cell8eller epidermala keratinocyter9 kan anses representera cellpopulationer som normalt finns i överflöd på huden vävnad10. Alternativt, neutrofiler, makrofager eller andra inflammatoriska celler kunde utvärderas i detta system att representera cellmigration av andra beståndsdelar i sårläkning inom hud vävnad10. Dessutom hjälper identifierar den specifika cellen fodrar utvärderas till att identifiera vilka reagenser är optimala att använda att främja cellernas metaboliska aktivitet. Hur blir cellmigration spåras/avbildas? Det finns ett antal tekniker som används för att observera cellmigration inom en tallrik eller kolv. Till exempel ger färgning eller fluorescently taggning celler och använder fluorescens eller confocal imaging för att spåra celler en stark kontrast, vilket gör att utredaren att tydligt definiera cellulära vs. icke-cellulär platser och cellulära rörelse11 . En annan vanlig teknik, beskrivs i denna studie är att utnyttja inverterat ljusmikroskop med fas kontrast6,7. Detta alternativ till cell färgämnen och fluorescens tillåter användaren att live spår celler utan fixar obotligt celler före imaging och möjliggör också att fånga bilder av samma enskilda brunnar innehållande sårade enskiktslager av celler över tidpunkter. Vad resultatet åtgärder kommer att användas för analys? Med hjälp av bilderna samlades under hela studien, data kan skapas där förändringar i cellulära migration priser kan förstås. I vårt labb mikroskopiska bilder som tagits på den inverterat ljusmikroskop överförs till bild analys programvara och beräknas den procentuella sårslutning och summerade arean under kurvan (AUC).
Vi kommer att belysa den specifika användningen av denna analys att belysa förändringar av dermal fibroblast migration i närvaro av en känd miljö förorening, arsenik. Arsenik är en naturligt förekommande metalloid finns inom jordskorpan. Olika platser har hittats med förhöjda halter av arsenik, som utgör en risk för personer som bor nära dessa platser. Som ett resultat, har mat och vatten källor visat sig ha förhöjda halter av arsenik föroreningar, vilket ökar risken för individer att bli exponerad för arsenik. Miljömässiga arsenikexponering har visat sig ha långsiktiga hälsokonsekvenser i mänskliga populationer över eller ens nedanför nuvarande USA Environmental Protection Agency (USEPA) Max föroreningars nivå (MCL) 10 ppb (10 µg/L)12, 13. även om den amerikanska MILJÖVÅRDSMYNDIGHETEN har satt denna MCL och anses det säkert att dricka gränser, arsenik koncentrationer som överskrider denna gräns är inte ovanliga i vattenkällor över hela världen. I sydvästra USA, har många grundvatten, brunnsvatten och fjädrar dokumenterats för att innehålla när det gäller halter av arsenik14. Till exempel i Verde Valley, AZ innehåller Montezuma väl 210 µg/L arsenik15. Grundvattnet runt floden Verde, AZ innehåller 16 µg/L arsenik i genomsnitt med toppvärden når 1,3 mg/L15,16. Noterbart överstiger i många brunnar i Verde River vatten Boden koncentrationerna av arsenik 50 µg/L15,16. Med denna kunskap, miljömässigt relevanta arsenik koncentrationer var markerat intervallet underifrån MCL på 0,1 µM (7,5 ppb), ovanför MCL på 10 µM (750 ppb) i aktuellt studera14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Den information som samlats in från dessa experiment kommer att användas som en tidig indikator på potentiella ändringar av cellulära migration priser i en in-vivo sår förorenad med arsenik. Efteråt, signaling molekyler kan väljas baserat på deras roll för att underlätta sårläkning och cellulära migration och framtida kvantitativa polymerasen kedjar reaktion (qPCR) baserat gen uttryck experiment kan inrättas vid slutförandet av nuvarande studier. Om migration priser i denna analys ändrar i närvaro av arsenik, specifik gen mål inblandning i cellulära migration kan vara målet för skadliga effekterna av arsenik, och kan således vara mekanismen av störningar.
Tillämpningen av denna analys ger en hög genomströmning och snabb utvärdering av cellulära migration och direkt kan översätta till komplexa fysiologiska system5,6,7. Av denna anledning har den föreslagna bänk modellen trimmad och övade för att utvärdera effekterna av olika terapeutiska medel och miljögifter på sårläkning6. Koncentrationerna av arsenik som används i den aktuella studien ansågs miljörelevanta genom omfattande litteratursökning kända exponeringsnivåer och från retrospektiv genomgång av olika data baser14,15, 16,17,18,19,20,21. Användningen av denna i vitro scratch analys visat att exponering för en arsenik koncentrationen inom höga, men miljömässigt relevanta utbud, försenad sårslutning (cellular migration).
Denna bänk topp modell var också anställd att isolera och studera en enskild cell linje (fibroblast) för att ytterligare förstå hur fibroblast migration bidrar till att såret helande utfall. Dessutom är det svårt att studera funktionerna i en enskild cell linje i komplexa i vivo system med många andra celler och vävnader närvarande som kan störa analysen. Dessutom ger analysen ett medel att uppnå semikvantitativt procent såret stängning data som kan användas för att rikta specifika cellulära mekanismer genom vilka föreningar kan påverka sårläkningen. Till exempel celler används i scratch analysen kan samlas och lagras i en önskad reagens och används i genuttryck (signal mRNA) eller proteinuttryck analyser22. Denna information kan vara användbar till utredaren om de försöker förstå vad signaler eller proteiner kan i hög grad bidra till förändringar i cellulära migration i närvaro av varierande behandlingar (dvs, arsenik)22.
Mänskliga neonatal dermal fibroblaster valdes för detta arbete utifrån deras framträdande roll i sårläkning. Dock detta scratch test protokoll har genomförts med hjälp av olika celltyper och för en rad forskningsändamål. Till exempel har scratch analysen antagits inom området onkologi för att studera migration hämning av kemoterapi droger23; för skelettmuskulaturen cellmigration, proliferation och diffusion24; att studera effekten av växtextrakt på cellulära migration25; och för att förstå hur keratinocyter migration och spridning bidra till såret helande9. Dessutom utvärderat en tidigare papper av Pinto o.a. effekterna av uran (U) och trombocyter-rich plasma (PRP) på hDFn migrering med scratch test6. Syftet med detta arbete var att förstå den utsträckning som denna analys kunde testa effekten av en agent som trodde att sakta cellulära migration (U), liksom en agent som tros påskynda cellulära migration (PRP). Som kan ses i ovannämnda arbete och forskning av andra utredare, tillämpningen av scratch analysen har hög potential för användning i olika experimentella modeller26. Trots den detalj som tillhandahålls inom metoderna, bör det förväntas variansen mellan utredare och experiment. Till exempel varierar cellulära migration priser sannolikt baserat på raden cell används, förutom de nödvändiga mikronäringsämnen behövs för unika celltyper. Många av de viktiga yttranden till stöd i cell avkastning och lönsamhet är listade som anteckningar i hela detta protokoll. Det rekommenderas dock starkt att utredarna följer tillverkarens rekommendationer för optimal tillväxt villkorar, och att använda denna metod som kompletterande anvisning för allmänna cell kulturarbete.
Även om scratch analysen är extremt mångsidig för studie av cellulär aktivitet; oförutsedda fel kan uppstå i mätteknik. Till exempel när du använder ImageJ att manuellt spåra cell migration fronter, kan variation finnas bland användare, vilket kan begränsa noggrannhet och representativa datainsamling. Det bör också noteras att migration fronter ska läsas dubbelblind behandling att minimera användaren bias. Dessutom kan manuellt identifiera migration fronter resultera i felberäkning av genomsnittliga körsträcka på grund av pseudopod bildandet av celler och deras förmåga att nå ut till formuläret fokal sammanväxningar, som kan vara visuellt vilseledande. På samma sätt, användning av fluorescerande ”cell tracker” färgämnen på cellens yta eller nukleära proteiner att upptäcka migration kan oavsiktligt fixa celler vilket leder till felaktigheter vid mätning av cellulära migration över tid. Det rekommenderas att lämpliga positiva och negativa kontroller vara inskrivna inom experimentet att helt bedöma effekten av behandling på cell linjer. Bruket av denna analys måste slutföras som ett erkännande av dess begränsningar. Denna analys garanterar inte att cellulära migration resultat från in vitro experiment kommer att direkt översätta till i vivo resultat. Såret helande och cellulära migration i ett komplex levande system innebär en mängd celltyper och molekylära signaler. som alla har potential att påverka helande svar.
Sammanfattningsvis, har scratch analysen visat sig ge hög genomströmning screening av cellulära migration som svar på förändrade miljöer6,25. Vi utnyttjade specifikt detta protokoll för att identifiera förändringar i cellulära migration till följd av arsenikexponering vid olika miljömässigt relevanta doser. Dessa data har motiverat att använda scratch analysen vidare studium och utvärdera de mekanistiska vägarna i cellulära migration i denna analys och hur dessa vägar ändras med arsenikexponering.
The authors have nothing to disclose.
Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Institute on minoritet hälsa och hälsa skillnader av det nationella Institutes of Health under Award nummer U54MD012388. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
Water Bath | Precision | Model 182 | |
Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
p200 Pipette | Gilson | ||
p20 Pipette | Gilson | ||
Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
Tissue Marker | Securline | 92167 | |
Wipes | Kintech | 34155 | |
70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
Bleach | Great Value | 220-04 | |
96-well | Falcon | 353915 | |
Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
12-well plate | Corning | 3598 | |
Waste Beaker | n/a | n/a | |
1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |