Summary
Denne studien fokuserer på en i vitro modell av sår helbredelse (scratch analysen) som en mekanisme for å bestemme hvordan miljøgifter som arsen innflytelse mobilnettet migrasjon. Resultatene viser at denne i vitro analysen gir rask og tidlige indikasjoner på endringer i mobilnettet overføringen før i vivo eksperimentering.
Abstract
Forstå fysiologiske mekanismene av sårheling har vært fokus for pågående forskning i mange år. Denne forskningen oversettes direkte endringer i kliniske standarder som brukes til behandling av sår og redusere sykelighet og dødelighet for pasienter. Sårheling er en komplisert prosess som krever strategiske celler og vev samhandling og funksjon. En av mange kritisk viktige funksjoner av sårheling er individuelle og kollektive mobilnettet migrasjon. Ved skade overføre ulike celler fra blodet, omkringliggende connective og epitel vev raskt til såret området ved hjelp av kjemiske og/eller fysiske stimuli. Dette migrasjon svaret kan i stor grad diktere resultater og suksess av en healing sår. Forstå denne bestemte cellulære funksjoner er viktig for translasjonsforskning medisin som kan føre til forbedret sårheling resultater. Her beskriver vi brukes til å forstå mobilnettet overføring som gjelder sårheling, og hvordan endringer i mobilnettet miljø kan betydelig endre denne prosessen. I denne eksempel studien var dermal fibroblaster vokst i media med fosterets bovin serum (FBS) som monolayer kulturer i vev kultur flasker. Cellene ble tas aseptisk overført til vev kultur behandlet 12-vel plater og vokst til 100% samløpet. Ved å nå samløpet, var cellene i monolayer vertikalt riper bruker et p200 Pipetter tips. Arsen fortynnet i kultur medier med FBS ble lagt til individuelle brønner på miljømessig relevante doser alt 0.1-10 M. bilder ble tatt hver 4 timer (h) over en 24-timers periode med en invertert lys mikroskop å observere mobilnettet overføring (sår nedleggelsen). Bildene ble individuelt analysert ved hjelp av analyseprogramvare og prosent sår nedleggelsen ble beregnet. Resultatene viser at arsen bremser ned sårtilheling. Denne teknikken gir en rask og billig første skjermen for evaluering av effekter av miljøgifter på sårtilheling.
Introduction
Sårheling består av en kompleks serie av overlappende trinn som involverer ulike celletyper, signalnettverk molekyler og ekstracellulær matrix komponenter1. Sammen jobber disse komponentene sammen å oppnå såret oppløsning eller reparasjon, som til slutt fører til dannelse av et beskyttende fibrotiske arr avhengig av traumer1. For å fange den individuelle prosesser og funksjoner av sår er helbredelse i ett eksperiment vanskelig; enkelttrinn i såret helbredelsesprosessen må identifiseres og testet separat. Blant de mange trinnene av sårheling, prosessen med cellular overføring har vært ansett som kritisk når du vurderer helbredende priser2. Mobilnettet migrasjon kan observeres i alle faser av sårheling, og dermed nødvendiggjør videre forståelse av hvordan endringer i celle migrasjon kan påvirke såret nedleggelse. For eksempel er mobilnettet overføring sett i begge tidlige og sene fasen betennelse, med blod koagulasjon og blodplater samling på såret området3. Disse hendelsene hindre overdreven blodtap ved å danne en midlertidig blokkering for å fylle såret områder uten vev3. Blodplater i omløp vil syntetisere og utsondre vasoactive meglere sammen med chemotactic faktorer, som sammen signalet for inflammatorisk leukocytter migrasjon (hvite blodlegemer) til de sårede vev for reparere4. Re epithelialization oppstår i timene av vev skade og innebærer dekker såret området gjennom aktivitet og migrering av epitelial keratinocytter å hindre videre smitte eller invasjon av fremmede partikler til såret området2. Disse eksemplene ta bare noen av mange celle migrasjon funksjonene tilknyttet sårtilheling.
Scratch analysen er beskrevet og brukes til å forstå celle migrasjon og dens mange roller på sårtilheling5,6. Denne analysen anses forenklede, gir høy gjennomstrømming og gjør etterforskeren samle representant celle migrasjon data. Migrasjon analyser har vist at visse stoffer kan akselerere eller redusere hastigheten av mobilnettet migrasjon6. Videre gir disse analyseresultatene translasjonsforskning fysiologiske informasjon som kan brukes til å formulere målet behandlinger, dosering konsentrasjoner, og gener rundt før i vivo eksperimentering. Analysen krever grunnleggende celle kultur teknikker og forsyninger, en celle linje av valg og bildeteknologi å fange bevegelse over tid eller bevegelse svar på behandlinger.
Analysen kan lett manipulert eller tilpasset behovene til etterforskeren. Men er det fire grunnleggende spørsmål du bør vurdere før eksperimentering. Hvilke generelle eller spesifikke spørsmålet (er) er investigator(s) prøver å besvare? Dette gjelder for de fleste hypoteser drevet forskning; Det er imidlertid avgjørende for denne analysen fordi den vil finne mange av parameterne for å nøyaktig og fullstendig svar på spørsmålene. Hva celle linje eller cellelinjer (Hvis flere) skal brukes til å representere fysiologiske systemet blir studert? For eksempel i en cutaneous sår helbredelse studie, dermal fibroblast5,6,7, Stamcelle8eller epidermal keratinocyte9 kan anses å representere celle populasjoner som normalt finnes i overflod i huden vev10. Alternativt kan nøytrofile, makrofager eller andre inflammatoriske celler evalueres i dette systemet til å representere celle migrasjon av andre komponenter i sårheling innenfor huden vev10. I tillegg vil identifiserer bestemt celle linjen evaluering bidra til å identifisere hvilke reagenser er optimal å bruke å fremme cellen metabolsk aktivitet. Hvordan blir celle migrasjon sporet/fotografert? Det finnes en rekke teknikker brukes til å observere celle migrasjon i en tallerken eller kolbe. Inneholder for eksempel en sterk kontrast, som lar etterforskeren klart definere mobilnettet vs ikke-mobilnettet steder og mobilnettet bevegelse11 farging eller fluorescently merking celler og bruker fluorescens eller AC confocal imaging for å spore celler . En annen vanlig teknikk, beskrevet i denne studien er bruken av omvendte * lys med fase kontrast6,7. Dette alternativ til celle fargestoffer og fluorescens lar brukeren live spor celler uten å måtte fikse terminalt celler før bildebehandling og også kan fange bilder av samme individuelle brønner som inneholder sårede monolayers celler over tidspunkt. Hva utfallet tiltak vil bli brukt for analyse? Bruker bildene samlet gjennom hele studiet, data kan genereres som endringer i mobilnettet overføring priser kan forstås. I vår lab, mikroskopiske bilder på invertert lys mikroskopet er lastet opp til analyseprogramvare og prosent såret nedleggelse og summerte området under kurven (AUC) beregnes.
Vi vil markere bestemt bruk av denne analysen å belyse endringer dermal fibroblast overføring i nærvær av en kjent miljømessige miljøgifter, arsen. Arsen er en naturlig forekommende metalloid funnet i jordskorpen. Forskjellige steder er funnet med forhøyede nivåer av arsen, som utgjør en risiko for personer som bor i nærheten av disse stedene. Som et resultat, har mat og vann kilder vist har økte nivåer av arsen forurensning, noe som øker sannsynligheten for enkeltpersoner å bli utsatt for arsen. Miljømessige arsen eksponering har vist seg å ha langsiktige helsemessige konsekvenser i menneskelige populasjoner over eller selv under den gjeldende USA Environmental Protection Agency (USEPA) Max miljøgifter nivå (MCL) 10 ppb (10 µg/L)12, 13. selv om USEPA har satt denne MCL og ansett det trygt for drikkevann grenser, arsen konsentrasjoner som overstiger denne grensen er ikke uvanlig i vannkilder over hele verden. I det sørvestlige USA, er mange grunnvann, godt vann og kilder dokumentert for å inneholde om nivåer av arsen14. I Verde Valley, AZ inneholder for eksempel Montezuma godt 210 µg/L arsen15. Grunnvann rundt elven Verde, AZ inneholder 16 µg/L av arsen i gjennomsnitt med topp verdier nå 1.3 mg/L15,16. Spesielt overstige arsen konsentrasjoner i mange brønner i Verde elva vann skjulet 50 µg/L15,16. Med denne kunnskapen, miljømessig relevante arsen konsentrasjoner ble valgt som spenner fra under MCL på 0,1 µM (7,5 ppb), over MCL på 10 µM (750 ppb) i gjeldende studere14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Informasjonen som samles inn fra disse eksperimentene vil bli brukt som en tidlig indikator på mulige endringer til mobilnettet overføring priser i en i vivo sår forurenset med arsen. Etterpå signalnettverk molekyler kan velges basert på deres rolle i tilrettelegge sårheling og mobilnettet migrasjon, og fremtidige kvantitative polymerase kjedereaksjon (qPCR) basert gene expression eksperimenter kan settes opp ved gjennomføring av gjeldende studier. Hvis overføring priser i denne analysen endrer i nærvær av arsen, bestemte genet mål involvert i cellulær migrasjon være for skadelige effekter av arsen, og dermed kan være mekanisme avbrudd.
Protocol
1. utarbeidelse av en Biosafety II skap (BSC)
Merk: Er beskrevet i denne protokollen bør utføres med personlig verneutstyr, mens du bruker god laboratorium praksis for å oppnå steril teknikk.
- Løft BSC beskyttelsesglass drifts høyde og aktivere laminær strømning fans.
- Bruk 70% isopropanol vandig løsning for å utføre sanitær tømming av arbeidsområdet. Tørk BSC fra bak veggen og sidevegger og arbeid ned bunnplate.
- Tørk alle materialer som brukes i analysen med 70% alkohol (isopropanol eller EtOH), og plasser dem innenfor BSC.
2. menneskets Dermal fibroblaster frø i en MT75 bolle
- Få ampuller med ønsket cryopreserved celle linje (neonatal menneskelig dermal fibroblaster [hDFn], ved celle konsentrasjon av 500.000 celler/medisinglass og passasje p3-p5).
- Plass ampuller med celler i et 1.0-cm-dypt vannbad på 37 ° C tillate tining. Tine ampullen til ca 70% av cell løsningen er flytende. Tørk ned hetteglass med 70% alkohol og legger medisinglass i hetteglass rack inne BSC.
Merk: Kontroller at vannet ikke kommer i kontakt med tråder eller cap medisinglass å forhindre potensielle forurensning under cellen seeding. Forhindre komplett tiner celler i vann bad gjøres kan forårsake utilsiktet celledød.
- Plass ampuller med celler i et 1.0-cm-dypt vannbad på 37 ° C tillate tining. Tine ampullen til ca 70% av cell løsningen er flytende. Tørk ned hetteglass med 70% alkohol og legger medisinglass i hetteglass rack inne BSC.
- Trekke ut 10 mL av medier med 10% fosterets Bovine Serum (FBS). Bruke en automatisk for å hindre og 10 mL pipette tips inneholder i MT75 vev kultur kolbe. Tillate media å fullt mette bunnen av flasken av forsiktig rocking kolbe frem og tilbake.
- Åpne hetteglass med cellen lager og leveringstanken løsning fra ampullen, å være oppmerksom på pipettering hastighet, cellemembraner blir sårbare fra kryonisk bevaring.
- Overføre cellene til en MT75 vev kolbe med media. Løse ut tinte celle i vev kolbe, igjen å være oppmerksom på pipettering hastighet.
Merk: Seeding tettheten av celler i vevet kolbe anslås for å være 6,600 celler/cm2. Såing tetthet kan endres til brukeren og ønsket timing av eksperimentering. - Mål ut 1 mL av media fra MT75 vev kolbe og overføre volum tilbake til ampullen. Overføre volum fra ampullen tilbake i MT75 kolbe.
Merk: Dette grepet bidrar til å maksimere celle avkastning fra ampullen. - Snurp vev kultur kolbe hetten og forsiktig rock for å spre celler i suspensjon jevnt over hele overflaten. Sjekk for jevn fordeling av celler med en invertert mikroskop.
- Etiketten flasken celle type, dato, initialer, avstamning og formål (f.eks, hDFn, 07/11/2018, NDC, passasjen 4, arsen Scratch analysen). Plasser vev kultur kolbe i en fuktet inkubator på 37 ° C og 5.0% CO2 72 h.
Merk: Vekstmediet skal endret 12-24 h etter innledende seeding for å fjerne sporstoffer mengder dimethyl sulfoxide (DMSO) cryopreservative, og deretter endret hver 48 timer etter at slik celler er riktig næring. Inkubasjon og vekst perioden avhenger av det beregnede antallet nødvendig for scratch analysen. Dobling tid for hDFn cellene er vanligvis 16-24 h under normale forhold. Imidlertid doble hastigheten kan endres på grunn av høyden, pH, temperatur, fuktighet, medietypen, etc., og må regnskapsføres ved planlegging eksperimenter.
3. celle teller og subkultur inn 12-vel vev kultur Plate
- Hente MT75 vev kultur kolbe fra inkubator. Observere overholdt celler med en invertert mikroskopet på 10 X objektive forstørrelse (100 X totale forstørrelse) og bestemme omtrentlig cellen der.
- Skann flertallet av vev kultur kolbe når observere samløpet å sikre mest representative prosenten anslås. Evaluere enkelt celle morfologi noe unormalt eller bakteriell og/eller fungal smitte.
- Montere den automatisk å hindre med 10 mL pipette tips. Bruk for å hindre inneholder hele volumet av media fra MT75 og overføre løsning til en avfallsbeholderen. Hindre Pipetter spissen å overholde celleoverflaten. Kast pipette tips i en biohazard hylle.
- Montere den automatisk å hindre med 5 mL pipette tips. Sug opp 5 mL av balansert salt løsning, dispensere i flasken og forsiktig rock kolbe å skylle overflødig medier, døde celler og avfallsprodukter.
- Trekke volumet fra MT75 og støte inn i avfallsbeholderen. Kast pipette spissen i biohazard bin.
- Montere den automatisk å hindre med 5 mL pipette adapter. Sug opp 2 mL av trypsin fra lager, dispensere i flasken og forsiktig rock flasken for å spre enzymet over de adhered cellene. Sikre komplett metning av tilhenger overflaten. Sted vev kolbe i inkubator for 2-3 minutter (min.).
Merk: Den maksimale enzym-underlag reaksjonen bør ikke overstige 10 min. - Observere vev kolbe under en invertert mikroskop på et 10 X linsen forstørrelsen (100 X totale forstørrelse). Bruke skånsom vibrasjoner for å lette celle avdeling.
- Tørk MT75 flasken 70% alkohol og sted innenfor BSC.
- Montere den automatisk å hindre med 5 mL pipette tips. Sug opp 5 mL av media fra lager og legge til MT75 vev kolbe stoppe enzym-underlaget reaksjonen. Media: trypsin forholdet skal 3:1. Pipetter opp og ned bunnen av flasken 2 - 3 ganger å skylle og sikre at reaksjonen har stoppet. Sug opp hele volumet av væske fra flasken og overføring til et sterilt 15 mL konisk rør.
- Fyll en andre 15 mL konisk rør med en identisk volumet av media.
- Plass begge 15 mL konisk rør i antipodal stilling til hverandre. Bruke 200 g sentrifugalkraften i 5 minutter ved 25° C ved å sette utstyret kjører parametere.
- Tørk 15 mL konisk røret med pelleted celler med 70% alkohol og plasser inne BSC.
- Bruke den automatiske hindre med en 5 mL tilknytning til Pipetter av media, etterlot ca 250 µL av væske og celle pellets. Vær oppmerksom på plasseringen av Pipetter spissen, som cellen pellet bør forbli uforstyrret. Dispensere volumet i en avfallsbeholderen og kast spissen i en biohazard hylle.
- Bruk et microcentrifuge rør rack kjøre bunnen av koniske røret over medisinglass sporene, skape en rask vibrasjon, forstyrre og å suspendere celle pellet (kalles "rack raking").
Merk: Unngå å bruke en vortex mikser utføre dette trinnet. Gravitasjon styrker skapt av vortex blandebatterier overskrider celle g-force terskler og kan forårsake lysing. Når fullført riktig, vises den nye celle løsningen som en skyet blanding med ingen gjenværende pellets. Flid utføre dette trinnet vil ofte opprette en enkeltcelle suspensjon, fører til økt nøyaktighet ved telling celler. - Legge til 2 mL media celle aksjen eller rørets. Pipetter cellene forsiktig ned på siden av røret 20 ganger for å bryte opp noen klumper. Registrere total-celle suspensjon volumet og sette kort.
- Pipetter 20 µL av Trypan blå lager (0,4%) i en tom godt av en 96-brønns tallerken med et sterilt pipetter.
- Bland lager celle løsningen for å generere en jevn celle suspensjon før overføring. Bruk en steril Pipetter tips for å fjerne 20 µL av cellen lager (unngå berøre tube vegger). Legge til 20 µL Trypan blå løsning i 96-brønnen plate.
- Pipetter forsiktig å blande innholdet. Pipetter 10 µL av blandingen mellom dekkglassvæske og telling kammer på hemocytometer.
- Observere cellene og rutenettet under et 10 X mål. Observere ni store firkanter i synsfeltet. Telle celler i midten og 4 hjørneruter (totalt 5 ruter).
Merk: Se etter en jevn fordeling av celler over hele rutenettet å sikre et nøyaktig antall. - Telleapparat alle celler (gjennomsiktig og blå) i 5 identifiserte rutene i rutenettet. Separat, telleapparat bare uholdbare (blå) cellene i de samme 5 rutene.
- Beregne levedyktig cellen telle ved hjelp:
der x = levedyktig celletall, en = totalt celler, b = ikke-levedyktige celler - Beregne levedyktig celle Densitet hjelp:
der x = levedyktig celle tetthet og y = totalt antall levedyktige cellers. - Beregne totale levedyktig celler:
der x = totalt levedyktig celler, y = levedyktig celle tetthet, f = celle suspensjon volum (mL). - Beregne % celle levedyktighet:
der x = prosent celle levedyktighet, y = levedyktige cellers telles på rutenettet, f = totalt celler telles på rutenettet.
- Merk en horisontal linje nederst på 12-vel-plate for å tjene som henvisningen merkene under bildebehandling.
- Bruk levedyktig celle tetthet (beregnet i 3.3.7) for å beregne volumet av media å fortynne celle lager i for såing en 12-vel vev kultur plate.
Merk: Den optimale cellen seeding tetthet for hDFn celler er 5000 celler/cm2. - Fortynne celle lager til 19000 celler/mL bruker media og frø hver godt med 1 mL av cellen lager. Bland celle lager regelmessig for å sikre selv cellen seeding over alle 12 brønner.
- Label hver plate med hvilken celle, linjen, bruker initialene og formålet. Sett platene i inkubator til 37 ° C og 5.0% CO2. Tillate at celler vokse til 100% samløpet er oppnådd for scratch analysen.
- Bruk levedyktig celle tetthet (beregnet i 3.3.7) for å beregne volumet av media å fortynne celle lager i for såing en 12-vel vev kultur plate.
4. arsen (As) lager løsninger og beregninger
- Fortynne natrium arsenite (NaAsO2) direkte i cellen kultur medier med 10% FBS på arbeider konsentrasjoner av 10, 1.0, 0,1 og 0,01 µM som.
- For dette, å gjøre en innledende 1 mM lager som løsning fortynne 3,9 mg av natrium arsenite til 30 mL av media. Serielt fortynne 1 mM lager for de resterende som løsninger.
| 1000 µM som lager Beregninger | Arsen arbeider lager konsentrasjoner | M1V1= M2V2 | Volumet av tidligere arsen løsning | Volumet av Media | Totalvolum av arsen arbeider lager |
| NaAsO2 molekylvekt: 129.9 g/mol | 10 µM som | (x mL) (1000 µM) = (30 mL)(10 µM) x = 0,3 mL | 0,3 mL = 300 µL av 1mM som løsning | 29.7 mL media | 30 |
| .03 L x.001 mol/L x 130 g/mol = 3,9 mg av arsen | 1.0 µM som | (x mL) (10 µM) = (30 mL)(1 µM) x = 3 mL | 3 mL 10 µM som løsning | 27 mL av media | 30 |
| Fortynne 3,9 mg av natrium arsenite til 30 mL media | 0,1 µM som | (x mL) (1 µM) = (30 mL)(0.1 µM) x = 3 mL | 3 mL 1 µM som | 27 mL av media | 30 |
| 0,01 µM som | (x mL) (0,1 µM) = (30 mL)(0.01 µM) x = 3 mL | 3 mL 0,1 µM som | 27 mL av media | 30 |
Tabell 1. Arsen aksjer og føljetong fortynninger. Denne tabellen forklarer beregningene brukes til å opprette som lager løsninger og jobber lager løsninger for behandlingsgrupper.
5. skrape analysen teknikk og arsen forurensning
- Få en 12-vel plate med celler fra inkubator. Vis celler på et 10 X objektive forstørrelse (100 X totale forstørrelse). Bestemme cellen samløpet i hver brønn.
Merk: Hver individuelle godt må nå 100% samløpet før skrape. Denne viktige skritt sikrer konsistens i analysen og hjelper standardisere analysen protokoller over eksperimenter. Hvis noen brønner ikke har nådd 100% samløpet, at cellene å ruge tid til alle brønnene har nådd 100% samløpet. Ytterligere vekst tid i brønner som allerede har nådd 100% samløpet påvirkes ikke. Confluent celler vil vanligvis bli vekst arrestert og forblir som en monolayer kultur, samtidig som sub confluent brønner å nå 100% samløpet. - Sett sammen en automatisk hindre med 10 mL pipette tips. Sug opp vekst media av alle brønnene. Kast volumet i flytende avfall og pipette spissen på biohazards hyllen.
- Sett sammen en p200 hindre med 1-200 µL sterilt tips. I hver brønn, produsere en ripe "uekte sår" av gli spissen over celleoverflaten fra en 12-klokken 6-o'clock plassering.
Merk: Tre faktorer som vil sterkt påvirke konsistensen er fart og trykk spissen vinkel. Grunnen skal utføres raskt, med en konstant press, samtidig være oppmerksom på tips vinkelen bor vinkelrett til bunnen av platen. Avlysning for tregt, vil det føre til at skjeve linjer, høyt trykk kan permanent score celle overholde flater og en tips vinkel mindre enn 90° begrenses scratch bredden. Noen av disse vanlige feil kan føre til endrede overføring priser og mønstre. - Fjerne overflødig rusk og celle klumper av skylling med 1 mL balansert salt per brønn. Rock den platen til siden for å lette vask. Fjerne balansert salt løsning fra brønner og kast i et avfallsbeholderen. Kast 5 mL pipette spissen i biohazards bin.
- Sett sammen en p200 hindre med 1-200 µL sterilt tips. I hver brønn, produsere en ripe "uekte sår" av gli spissen over celleoverflaten fra en 12-klokken 6-o'clock plassering.
Figur 1: skjematisk fremstilling av scratch analysen. Alt arbeidet er gjort innen en aseptisk å redusere sjansen for kontaminering. Celler er seeded på en ønsket tetthet i vev kultur flasker og dyrket i en inkubator satt til menneskelige fysiologiske forhold (5% CO2, 37 ° C). På å nå en ønsket samløpet, er tas aseptisk celler sub kultivert i 12-vel vev kultur platene på en ønsket seeding tetthet. Celler er vokst til 100% samløpet i hver brønn 12-vel platen og riper bruker et sterilt Pipetter tips. Denne "scratch" skaper en i vitro narr såret (betegnet av ledet dobbeltpil), der celler naturlig overføre for å lukke det åpne området. Hver godt kan unikt betinget og mobilnettet overføring priser kan observert og kvantifisert svar forskjellig behandling forhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bruke en p1000 hindre med 1000 µL tips til Pipetter 1000 µL fra arsen aksjer i brønner som er tilordnet tilfeldig med en behandlingsgruppe. Bruk en ny Pipetter tips for hver brønn for å forhindre. Registrere tiden når behandlinger er lagt. Plasser 12-vel plater i en inkubator satt på 37 ° C og 5.0% CO2.
6. imaging
- Ta bilder av hver brønn på 10 X objektive forstørrelse hver 4 timer over en 24-timers periode (0, 4, 8, 12, 16, 20 og 24 timer). Referanselinje tegnet nederst på platen til bildet på samme sted langs scratch i hver brønn på senere tidspunkt.
Merk: Det er viktig at de samme stedene er fotografert på hvert tidspunkt å tillate nøyaktige bildeanalyse og å få representativt data.
7. bildeanalyser
- Last opp bilder på invertert lys mikroskopet til en datamaskin og lagre som et JPEG-bilde med en detaljert filnavn.
- Åpne ImageJ.
- Last opp et bilde av en scene mikrometer med kjente avstander til programvare for å konvertere piksler til millimeter (mm) når du tar bildet målinger ved å dra og slippe filen i vinduet programvare.
Merk: Mikrometer bør ha linjer demarcating en kjent 1 mm lengde og bildet må tas på samme forstørrelse brukes til å fange bilder av celler. For eksempel i denne studien bilder ble tatt på 100 X totale forstørrelse ble dermed bildet av scenen mikrometer tatt på 100 X totale forstørrelse.- Klikk alternativene rett, segmenterteller Frihåndslinjer .
- Tegner en linje med kjent distanse på mikrometer bildet ved hjelp av aksemerker-med en lengde som er knyttet til hvert kryss merker. Tegne en rett linje: Klikk musen, holde, dra markøren til ønsket plassering, og slipp musen.
- Velg analyser og velg Angi skala.
- Angi Kjent fra kjente lengden på linjen i forrige trinn.
- Angi måleenhet for lengde mm.
- Merk av globale.
- Velg OK for å gå ut av menyen.
- Lukk ut av scenen mikrometer bildet.
- Laste opp en ripe analysen bilde i ImageJ ved å dra og slippe bildefil i vinduet.
- Tegne en rett linje langs bredden av scratch (fra venstre ledende høyre ledende kant).
- Trykk bokstaven M på tastaturet til å registrere måling av rette linjen. En liten resultatvinduet vises umiddelbart etter bokstaven M. Dette er hvor bredde målingen skal.
- Gjenta trinn 7.4 totalt 10 ganger å få 10 målinger langs scratch.
Merk: Det er viktig å generere mest representasjons bredde verdiene over hele lengden av scratch. Husk å sperre ute 10 bredden målinger like langs scratch fra topp til bunn. - Opprett en ripe analysen regnearkfil å avskrift og pasta målinger.
- Kopier og lim 10 bredden målinger fra resultatvinduet til riktig kolonne i en regnearkfil (tabell 2).
Merk: Når målingene kopieres fra resultatvinduet og limes inn i regnearket, vil det være overflødig kolonner med verdier. disse verdiene skal slettes, bevare bare 10 bredden målinger.
- Kopier og lim 10 bredden målinger fra resultatvinduet til riktig kolonne i en regnearkfil (tabell 2).
| 10 tilfeldige bredden målinger | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1 | |||||||
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | |||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | |||||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
| 10 | |||||||
| Gjennomsnittlig 10 mål |
Tabell 2. Rå bredden målinger tabell format. Denne tabellen viser organisasjonsstrukturen for rå målene oppnås.
- Gjenta trinnet ovenfor for resten av scratch analysen bildene.
- Beregne gjennomsnittet av 10 målinger på hvert tidspunkt (0-24 h) for hver godt.
- Bestemme prosent nedleggelse beregninger ved hjelp av verdier fra trinn 7,8.
- Opprette en tabell nederst i regnearket med tittelen "bredde måling gjennomsnitt" (tabell 3).
- Kopiere og lime inn raden Gjennomsnittlig av 10 målinger beregnes i trinn 7,8 i tabellen "bredde måling gjennomsnitt".
- Opprette en annen tabell Bredde måling gjennomsnitt for bordet. Tittel dette tabell Prosent sår nedleggelse (Tabell 4).
Merk: Verdien i kolonnen 0t for hver brønn skal være 0 fordi scratch er 0% til første 0t bildet alle brønner. - Gå til neste spalte over (4 h).
- Beregne prosent nedleggelsen for 4, 8, 12, 16, 20 og 24 h tidspunkt:
der x = prosent nedleggelsen, jeg = første scratch bredde (0 h bredde), f = endelige bunnen width (4, 8, 12, 16, 20 eller 24 h bredde).
| Vel bredde gjennomsnitt | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3a | |||||||
| 4a | |||||||
| 1B | |||||||
| 2b | |||||||
| 3b | |||||||
| 4b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tabell 3. Bredde måling gjennomsnitt tabellformat. Denne tabellen viser organisasjonsstrukturen for bredde måling gjennomsnitt beregnet med omtrentlig bredde målene i tabell 2.
| Vel | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | 0 | ||||||
| 2a | 0 | ||||||
| 3a | 0 | ||||||
| 4a | 0 | ||||||
| 1B | 0 | ||||||
| 2b | 0 | ||||||
| 3b | 0 | ||||||
| 4b | 0 | ||||||
| 1c | 0 | ||||||
| 2c | 0 | ||||||
| 3c | 0 | ||||||
| 4c | 0 |
Tabell 4. Prosent sår nedleggelse tabellformat. Denne tabellen viser organisasjonsstrukturen for prosent såret nedleggelse verdiene beregnes ved hjelp av bredde-måling gjennomsnitt i tabell 3.
- Opprette en annen tabell Prosent sår nedleggelse bordet. Tittel dette tabell AUC (tabell 5).
- Beregne den 0-4 h området under kurven (AUC) verdien i 0-4 h-kolonnen for hver brønn:
der x = 0-4 h AUC verdi, en = % nedleggelse verdi 0 h, b = % nedleggelse verdi 4 h, h = tiden mellom de to tiltakene (4 h i denne studien). - Beregne 4-8 h området under kurven (AUC) verdien i kolonnen 4-8 h for hver brønn:
Der x = 4-8 h AUC verdi, en = % nedleggelse verdi 4 h, b = % nedleggelse verdi for 8 h, h = tiden mellom de to tiltakene (4 h i denne studien).
Merk: AUC verdier skal beregnes for hvert 4 h tidsintervall i 24 timer perioden for hver brønn. - Summere alle AUC verdiene fra 0-24 h (beregnet i trinn 7.10.1-7.10.2) for å få en summerte AUC verdi for hver brønn. Kontroller disse verdiene lagres riktig for statistisk analyse.
- Beregne den 0-4 h området under kurven (AUC) verdien i 0-4 h-kolonnen for hver brønn:
| Vel | 0-4 h | 4-8 h | 8-12 h | 12-16 h | 16-20 h | 20-24 h | Summerte AUC |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3a | |||||||
| 4a | |||||||
| 1B | |||||||
| 2b | |||||||
| 3b | |||||||
| 4b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tabell 5. HiA tabellformat. Denne tabellen viser organisasjonsstrukturen for AUC verdiene beregnes ved hjelp prosentandelen sår nedleggelse verdier i Tabell 4.
8. statistisk analyse
- Finne statistisk analysemetode som passer både eksperimentell design og summerte AUC verdier fikk under analysen.
Representative Results
Utvalgsstørrelsene (n) for alle behandlingsgrupper var n = 28. Celler var vellykket kulturperler følgende aseptiske teknikker og lab protokoller (figur 1). Uniform riper ble observert alle behandling grupper med mener scratch bredden måler 0,8 mm 0.4 mm (figur 2). Kontrollgruppe hadde en gjennomsnittlig summerte området under kurven verdien av 1,355.83; 0,01 µM som behandlingsgrupper hadde et gjennomsnitt oppsummerte området under kurven verdien av 1,366.21; 0,1 µM som behandlingsgrupper hadde en gjennomsnittlig oppsummerte området under kurven verdien av 1,326.24, 1.0 µM som behandlingsgruppe hadde et gjennomsnitt oppsummerte området under kurven verdien av 1,295.10; og endelig den 10 µM behandlingsgruppe hadde en gjennomsnittlig summerte området under kurven verdien av 535.12, som var statistisk lavere sammenlignet med alle andre grupper (p < 0,05) (Figur 3). R-programmet for statistisk analyse ble brukt til å kjøre en enveis VARIANSANALYSE med en Tukey legge hoc justering til å finne statistiske forskjellen blant behandling (p < 0,05).
Figur 2: representant grunnen analysen bilder løpet 20t. Bilder ad representerer mobilnettet overføring av kontroll celler. bildene eh representerer mobilnettet migrering av celler forurenset med 1,0 µM som; bilder jeg-L representerer mobilnettet migrering av celler forurenset med 10 µM som. Fra disse bildene er det klart at mobilnettet overføring er redusert i nærvær av arsen. Kontroll bildene viser en fullstendig "helbredet" avlyse etter 20 h, mens de to andre som behandling gruppene ikke ble "helbredet". Den 10 µM som behandling inhibited komplett nedleggelse helt etter 24 h. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: arsen bremser mobilnettet migrasjon i scratch analysen. Bildene ble tatt over en 24-timers periode å observere endringer i mobilnettet overføring priser i nærvær av varierende konsentrasjoner av arsen. RAW-bilder ble analysert ved hjelp av en automatisert programvare (f.eksi MATLAB), hvilke opprinnelig målte såret bredde, så beregnet prosent nedleggelse og endelig området under kurven (AUC). Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt. Den 10 µM som behandlingsgruppe statistisk bremset mobilnettet migrering av menneskelig dermal fibroblaster neonatal (hDFn), vist av en statistisk lavere AUC verdi, sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper med en én-veis VARIANSANALYSE med en Tukey legge hoc justering (p < 0,05). Statistisk forskjeller representeres av bokstavene "A" og "B", som ble oppnådd gjennom bruk av Compact brev visningsmetoden tilgjengelig i R-programmet. Behandlinger som ikke deler et felles brev er statistisk signifikant fra hverandre (p < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Anvendelsen av denne analysen gir en høy gjennomstrømming og rettidig evaluering av mobilnettet migrasjon og kan direkte oversette til komplekse fysiologiske systemer5,6,7. Derfor er foreslått benk toppen modellen innstilt og praktisert for å evaluere effekten av ulike terapeutiske agenter og miljøgifter på sårtilheling6. Konsentrasjonen av arsen i denne studien ble ansett som miljøvennlig relevante gjennom omfattende litteratursøk av kjente eksponeringsnivåer, og fra Retrospektiv gjennomgang av ulike data baser14,15, 16,,17,,18,,19,,20,,21. Bruk av denne i vitro scratch analysen viste at eksponering for en arsen konsentrasjon i høy, men miljømessig relevante området, forsinket såret nedleggelse (mobilnettet migrasjon).
Denne benken toppmodellen var også ansatt å isolere og studere en enkeltcelle linje (fibroblast) for ytterligere å forstå hvordan fibroblast overføring bidrar til sår helbredelse resultater. Det er vanskelig å studere funksjonene i en enkeltcelle linje i komplekse i vivo systemer med mange andre celler og vev tilstede som kan forstyrre analysen. Dessuten gir analysen et middel til å oppnå semi kvantitative prosent såret nedleggelse data som kan brukes til å målrette bestemte cellulære mekanismer som forbindelser kan påvirke sårtilheling. For eksempel cellene i scratch analysen kan samles og lagres i en ønskede reagensen og brukes i genuttrykk (signal mRNA) eller protein uttrykk søk22. Denne informasjonen kan være nyttig å etterforskeren hvis de søker å forstå hva signaler eller proteiner kan i stor grad bidra til endringer i mobilnettet migrasjon i nærvær av varierende behandlinger (dvs. arsen)22.
Menneskelig neonatal dermal fibroblaster ble valgt for dette basert på deres framtredende rolle i sårtilheling. Men denne scratch analysen protokollen er implementert ved hjelp av ulike celletyper og for en rekke forskningsformål. For eksempel er scratch analysen vedtatt i onkologi for å studere migrasjon hemming av kjemoterapi narkotika23; for skjelettlidelser muskel celle migrasjon, spredning og diffusion24; å studere effekten av planteekstrakter på mobilnettet migrasjon25; og for å forstå hvordan keratinocyte migrasjon og spredning bidra til sår helbredelse9. I tillegg evaluert en tidligere artikkel av Pinto et al. virkningene av uran (U) og blodplater-rich plasma (PRP) på hDFn overføring ved hjelp av scratch analysen6. Hensikten med verket var å forstå omfanget som denne analysen kan teste effekten av en agent trodde å bremse mobilnettet overføring (U), samt en agent å fart cellular migrasjon (PRP). Som kan sees i de nevnte arbeidet og forskning av andre etterforskere, anvendelse av scratch analysen har stort potensial for bruk i ulike eksperimentelle modeller26. Til tross for detaljer gitt metodene, bør avvik forventes mellom etterforskere og eksperimenter. For eksempel vil mobilnettet overføring priser trolig variere basert på celle linjen i bruk, i tillegg til nødvendig mikronæringsstoffer kreves for enestående celletyper. Mange av de viktige observasjonene til hjelp i cellen avkastning og levedyktighet er oppført som notater i denne protokollen. Men anbefales det sterkt at etterforskerne følger produsentens anbefalinger for optimale forhold, og bruke denne metoden som supplerende instruksjon for generelle celle kultur arbeid.
Selv om scratch analysen er ekstremt allsidig for studier av cellular aktivitet. uforutsette biases kan oppstå i måling teknikker. For eksempel når du bruker ImageJ å manuelt trace celle migrasjon fronter, kan variasjon finnes blant brukere som kan begrense nøyaktigheten og representant datainnsamling. Det bør også bemerkes at overføringen fronter bør leses blind til behandling å minimere bruker bias. Videre kan manuelt identifisere migrasjon fronter resultere i feilberegning av gjennomsnittlig distanse på grunn av pseudopod dannelsen av celler og deres evne til å nå ut til skjemaet fokal adhesjon, som kan være visuelt villedende. På samme måte, bruk av fluorescerende "celle tracker" fargestoffer på celleoverflaten eller kjernefysiske proteiner å oppdage migrasjon kan utilsiktet fastsette celler som resulterer i feil ved måling av mobilnettet overføring over tid. Det anbefales at aktuelle positiv og/eller negative kontroller være registrert i eksperimentet til helt esler effekten av behandling på cellelinjer. Praktisering av denne analysen må fullføres i erkjennelse av begrensninger. Denne analysen garanterer ikke at mobilnettet migrasjon resultatene i vitro eksperimentering direkte vil oversette til i vivo resultater. Sår helbredelse og mobilnettet migrasjon i en kompleks levende system innebærer en rekke celletyper og molekylære signaler; hver har potensial til å påvirke helbredende svar.
I sammendraget, har scratch analysen blitt funnet for å gi høy gjennomstrømming screening av mobilnettet overføring som svar på endrede miljøer6,25. Vi utnyttet spesielt denne protokollen for å oppdage endringer i mobilnettet migrering som følge av arsen eksponering ved ulike miljømessig relevante doser. Disse dataene har gitt begrunnelse for å bruke scratch analysen videre studier og vurdere mekanistisk veier for mobilnettet denne analysen og hvordan disse veiene er endret av arsen eksponering.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av National Institute on minoritet helse og helse forskjeller i National Institutes of Health under prisen nummer U54MD012388. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
| Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
| Water Bath | Precision | Model 182 | |
| Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
| CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
| Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
| Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
| Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
| p200 Pipette | Gilson | ||
| p20 Pipette | Gilson | ||
| Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
| T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
| 15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
| 50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
| 5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Tissue Marker | Securline | 92167 | |
| Wipes | Kintech | 34155 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
| Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
| Bleach | Great Value | 220-04 | |
| 96-well | Falcon | 353915 | |
| Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
| Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
| Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
| 12-well plate | Corning | 3598 | |
| Waste Beaker | n/a | n/a | |
| 1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
| Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
| Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
| Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
| Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |
References
- Diegelmann, R., Evans, M. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing. Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).
- Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. Novel insights into wound healing sequence of events. Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).
- Michelson, A. Platelets. , 3rd edition, Waltham, Massachusetts. (2013).
- Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations. American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).
- Liang, C., Park, A., Guan, J. In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. , 329-333 (2007).
- Pinto, B., et al. A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied. In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).
- Pinto, B., et al. Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model. Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).
- Roubelakis, M., et al. Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).
- Shibata, S., et al. Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway. Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).
- Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. Cellular aspects of wound healing. Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).
- Gentry, P. R., Clewell, H. J. III, Greene, T. B., et al. The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).
- Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media. International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).
- Robertson, F. N. Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States. Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).
- Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA. Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).
- Uhlman, K. Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics. , The University of Arizona. Tucson, AZ. Arizona Cooperative Extension, AZ 1453 (2008).
- Agusa, T., et al. Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam. Science of the Total Environment. , 488-489, 562-569 (2014).
- Ayotte, J. D., et al. Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States. Science of the Total Environment. , (2014).
- Dummer, T. J., et al. Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada. Science of the Total Environment. , (2014).
- Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations. Water Research. 48, 156-169 (2014).
- Beamer, P. I., et al. Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).
- Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).
- Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. Optimization of cell motility evaluation in scratch assay. Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).
- Harishkumar, M., et al. Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract. BioMed Research International. 13, Article ID 963457, 8 pages (2013).
- Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay? Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).
