Summary
وتركز هذه الدراسة على نموذج في المختبر للجرح شفاء (الصفر المقايسة) كآلية لتحديد الملوثات البيئية كيف مثل الزرنيخ تأثير الهجرة الخلوية. وتبين النتائج أن هذا التحليل في المختبر يوفر مؤشرات السريع والمبكر للتغييرات للهجرة الخلوية قبل التجريب في فيفو .
Abstract
وقد فهم الآليات الفسيولوجية لالتئام تركيز البحوث الجارية لسنوات عديدة. يترجم هذا البحث مباشرة إلى التغييرات في المعايير السريرية المستخدمة لعلاج الجروح وخفض معدلات الاعتلال والوفيات للمرضى. التئام الجروح هو عملية معقدة تتطلب التفاعل الاستراتيجي في الخلايا والأنسجة والوظيفة. واحدة من العديد من الوظائف ذات أهمية حاسمة لالتئام الجروح هو الهجرة الخلوية الفردية والجماعية. عند إصابة، تهاجر خلايا مختلفة من الدم والأنسجة الضام، والظهاريه المحيطة بسرعة إلى موقع الجرح عن طريق المحفزات الكيميائية و/أو المادية. يمكن أن تملي هذه الاستجابة الهجرة إلى حد كبير نتائج ونجاح التئام الجروح. فهم هذه الوظيفة الخلوية محددة مهم للطب متعدية الجنسيات يمكن أن تؤدي إلى تحسين الجرح الشفاء نتائج. هنا، يمكننا وصف بروتوكول يستخدم من أجل فهم أفضل للهجرة الخلوية كما أنها تتصل بالتئام الجرح، وكيف التغييرات في البيئة الخلوية يمكن أن يغير كثيرا من هذه العملية. في هذا المثال الدراسة، كانت تزرع الليفية الجلدية في وسائل الإعلام التي تستكمل بالمصل البقري الجنين (FBS) كثقافات أحادي الطبقة في قوارير زراعة الأنسجة. أسيبتيكالي الخلايا المحولة إلى زراعة الأنسجة تعامل 12-جيدا لوحات ونمت لالتقاء 100%. عند الوصول إلى التقاء، كانت عمودياً خدش الخلايا في أحادي الطبقة استخدام تلميح بيبيت p200. الزرنيخ المخفف في وسائط الثقافة تستكمل مع FBS وأضيفت إلى الآبار الفردية في بيئياً ذات الصلة جرعات تتراوح بين 0.1-10 م الصور تم القبض على كل 4 ساعات (ح) على مدى فترة 24 ساعة مجهر ضوء معكوس لمراقبة الهجرة الخلوية (الجرح باستخدام إغلاق). صور منفردة حللت باستخدام برنامج تحليل الصور، والجرح في المائة الإغلاق تم حسابها. وتبين النتائج أن الزرنيخ يبطئ التئام الجروح. يوفر هذا الأسلوب شاشة أولى سريعة وغير مكلفة لتقييم آثار الملوثات على التئام الجروح.
Introduction
التئام الجروح ويتكون من سلسلة معقدة من تداخل الخطوات التي تنطوي على مختلف أنواع الخلايا والجزيئات مما يشير إلى عناصر المصفوفة خارج الخلية1. معا، هذه المكونات والعمل يدا واحدة لتحقيق القرار الجرح أو إصلاحها، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى تشكيل ندبة تليفية الحماية تبعاً لدرجة الصدمة1. للقبض على العمليات الفردية والوظائف للجرح الشفاء في تجربة واحدة صعبة؛ الخطوات الفردية داخل الجرح الشفاء عملية تحتاج إلى تحديد واختبارها بشكل منفصل. من بين العديد من الخطوات لالتئام الجروح، عملية الهجرة الخلوية اعتبرت حاسمة عند تقييم معدلات الشفاء2. الهجرة الخلوية يمكن ملاحظتها في جميع المراحل من التئام الجروح، ومما يستلزم زيادة فهم كيف يمكن أن تؤثر التعديلات للهجرة الخلية إغلاق الجرح. على سبيل المثال، يعتبر الهجرة الخلوية في كلا التهاب المرحلة المبكرة والمتأخرة، مع تجميع الدم تخثر الدم والصفائح الدموية في موقع الجرح3. هذه الأحداث منع فقدان الدم المفرط عن طريق تشكيل انسداد مؤقت لملء المناطق الجرحى خالية من الأنسجة3. سوف توليف الصفائح الدموية بالدورة الدموية وإفراز وسطاء فعال في الأوعية جنبا إلى جنب مع العوامل تشيموتاكتيك، أي إشارة معا لهجرة الكريات البيض الالتهابية (خلايا الدم البيضاء) للأنسجة الجرحى لإصلاح4. Epithelialization إعادة يحدث في غضون ساعة إصابة الأنسجة وينطوي على تغطية الموقع الجرح من خلال النشاط والهجرة من الخلايا الظهارية الكيراتينيه لمنع زيادة تلوث أو غزو من الجسيمات الأجنبية إلى موقع الجرح2. التقاط هذه الأمثلة فقط عدد قليل من الهجرة الخلية العديد من المهام المرتبطة بالتئام الجروح.
تم وصف المقايسة الصفر واستخدامه لفهم أفضل للهجرة الخلية ولها العديد من الأدوار في الجرح الشفاء5،6. هذا التحليل يعتبر التبسيط ويوفر الفائق، وتمكن المحقق لجمع بيانات الهجرة الخلية الممثل. وقد أظهرت فحوصات الهجرة بنجاح أن بعض المركبات قد تسريع أو إبطاء معدل الهجرة الخلوية6. وعلاوة على ذلك، توفر هذه نتائج الفحص متعدية المعلومات الفسيولوجية التي يمكن استخدامها لوضع العلاجات المستهدفة، الجرعات التركيزات، والجينات للفائدة قبل التجريب في فيفو . الفحص يتطلب تقنيات استزراع الخلايا الأساسية واللوازم، خط خلية للاختيار، وتكنولوجيا التصوير لالتقاط حركة عبر الوقت أو الحركة استجابة للعلاج.
ويمكن التلاعب المقايسة سهولة أو مصممة خصيصا لتناسب احتياجات المحقق. ومع ذلك، هناك أربع مسائل أساسية للنظر قبل التجريب. ما هو السؤال عامة أو محددة (ق) هو/هي investigator(s) محاولة للإجابة؟ وهذا ينطبق على معظم الفرضيات مدفوعة للبحث؛ ومع ذلك، أنها حاسمة بالنسبة لهذا التحليل لأنه سيتم تحديد العديد من المعلمات المطلوبة بدقة والإجابة السؤال (ق) تماما. يجب استخدام ما الخلية خط أو الخلية الخطوط (إذا كانت متعددة) لتمثيل النظام الفسيولوجية قيد الدراسة؟ على سبيل المثال، في الجلدي الجرح الدراسة الشفاء، وتنتجها الخلايا الليفية الجلد5،،من67،8من الخلايا الجذعية، أو قد تعتبر البشرة keratinocyte9 تمثيل السكان الخلية التي توجد عادة بكثرة في الأنسجة الجلد10. وبدلاً من ذلك، يمكن تقييم العَدلات أو الضامة أو الخلايا الملتهبة الأخرى في هذا النظام تمثل الهجرة الخلية للمكونات الأخرى لالتئام الجروح داخل أنسجة الجلد10. بالإضافة إلى ذلك، تحديد خط خلية معينة، يجري تقييم سوف يساعد على تحديد الكواشف التي هي الأمثل استخدامها لتعزيز النشاط الأيضي في الخلية. كيف ستكون الهجرة الخلية تتبع تصويرها؟ وهناك عدد من التقنيات المستخدمة لمراقبة الهجرة الخلية داخل اللوحة أو قارورة. على سبيل المثال، يوفر الصباغة أو فلوريسسينتلي تمييز الخلايا واستخدام الفلورية أو التصوير [كنفوكل] لتعقب الخلايا على النقيض قوي، الذي يسمح للمحقق يحدد بوضوح الخلوية مقابل المواقع غير الخلوي والحركة الخلوية11 . تقنية شائعة أخرى، الموصوفة في هذه الدراسة، هو استخدام الفحص المجهري الخفيفة المقلوب مع مرحلة التباين6،7. يسمح للمستخدم بالعيش تعقب الخلايا دون الحاجة إلى إصلاح الميؤوس من شفائهم الخلايا قبل تصوير هذا البديل للخلية الأصباغ والأسفار ويسمح أيضا لالتقاط الصور من نفس الآبار الفردية التي تحتوي على مونولاييرس الجرحى من الخلايا عبر النقاط الزمنية. ما هي نتائج التدابير التي سيتم استخدامها لتحليل؟ استخدام الصور التي جمعت طوال فترة الدراسة، يمكن توليد البيانات التي يمكن فهم التغيرات في معدلات الهجرة الخلوية. في لدينا مختبر، مجهرية من الصور التي تم التقاطها في المجهر المقلوب الخفيفة يتم تحميلها إلى برمجيات تحليل الصور ويتم حسابها بإغلاق الجرح في المائة ومجموع المساحة تحت المنحنى (AUC).
سوف نسلط الضوء استخدام محدد من هذا التحليل توضيح التغييرات للهجرة عن طريق الجلد تنتجها الخلايا الليفية حضور الملوثات بيئية معروفة، الزرنيخ. الزرنيخ ميتالويد التي تحدث بشكل طبيعي وجدت داخل قشرة الأرض. قد تم العثور على المواقع المختلفة مع مستويات مرتفعة من الزرنيخ، الذي يشكل خطرا على الأفراد الذين يعيشون بالقرب من هذه المواقع. كنتيجة لذلك، أظهرت مصادر الغذاء والماء إلى زيادة مستويات التلوث بالزرنيخ، مما يزيد من احتمالات للأفراد لتصبح عرضه للزرنيخ. التعرض للزرنيخ البيئية قد ثبت أن عواقب صحية طويلة الأجل في المجموعات السكانية البشرية أعلاه أو حتى أدناه الحالي وكالة حماية البيئة في "الولايات المتحدة" (USEPA) ماكس الملوث مستوى (MCL) من 10 جزء في البليون (10 ميكروغرام/لتر)12، 13-على الرغم من أن تعيين هذا MCL USEPA ويرى أنه للشرب حدود، تركيزات الزرنيخ التي تتجاوز هذا الحد غير المألوف في مصادر المياه في العالم. في جنوب غرب الولايات المتحدة، أن المياه الجوفية ومياه الآبار والينابيع العديدة قد وثقت لاحتواء فيما يتعلق بمستويات الزرنيخ14. على سبيل المثال، يتضمن كذلك مونتيزوما في الوادي الأخضر، من الألف إلى الياء، 210 ميكروغرام/لتر للزرنيخ15. المياه الجوفية حول نهر الأخضر، من الألف إلى الياء يحتوي على 16 ميكروغرام/لتر للزرنيخ في المتوسط، مع قيم الذروة التي وصلت إلى 1.3 مغ/لتر15،16. جدير بالذكر أن تركيزات الزرنيخ في العديد من الآبار في إلقاء مياه النهر الأخضر يتجاوز 50 ميكروغرام/لتر15،16. مع هذه المعرفة، كانت تركيزات الزرنيخ بيئياً ذات الصلة المحددة التي تتراوح من أسفل MCL في 0.1 ميكرومتر (7.5 جزء في البليون)، أعلاه MCL الساعة 10 ميكرون (750 جزء في البليون) الحالية في دراسة14،،من1516 , 17 , 18 , 19 , 20 .
سيتم استخدام المعلومات التي تم جمعها من هذه التجارب كمؤشر مبكر للتغييرات المحتملة لمعدلات الهجرة الخلوية في في فيفو الجرح ملوثة بالزرنيخ. بعد ذلك، مما يشير إلى إمكانية تحديد الجزيئات استناداً إلى دورها في تسهيل التئام الجروح والهجرة الخلوية، وقد تحدد بوليميريز الكمية المقبلة سلسلة من ردود الفعل (قبكر) على أساس الجينات التعبير تجارب عند انتهاء الحالية الدراسات. إذا تغير معدلات الهجرة في هذا التحليل وجود الزرنيخ، الجينات محددة الأهداف المعنية بالهجرة الخلوية قد تكون هدفا للآثار الضارة للزرنيخ، وهكذا قد تكون الآلية التي تعطل.
Protocol
1-إعداد مجلس الوزراء الثاني السلامة البيولوجية (بكالوريوس العلوم)
ملاحظة: الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول، ينبغي أن يتم مع المعدات الواقية الشخصية، بينما استخدام الممارسات المختبرية الجيدة لتحقيق الأسلوب العقيم.
- رفع الزجاج واقية BSC إلى ارتفاع التشغيل وقم بتشغيل مراوح التدفق الصفحي.
- استخدام الايزوبروبانول 70% محلول مائي لإجراء مسح المرافق الصحية في مجال العمل. مسح BSC من الجدار الخلفي والجدران الجانبية والعمل وصولاً إلى الصفيحة القاعدية.
- مسح جميع المواد التي سيتم استخدامها في التحليل مع الكحول 70% (الايزوبروبانول أو EtOH) ووضعها بداخل بكالوريوس العلوم.
2-الإنسان الليفية الجلدية البذر في قارورة T75
- الحصول على قارورة مع خط الخلايا المطلوب cryopreserved (المواليد البشرية عن طريق الجلد الليفية [هدفن]، تركيز خلية من خلايا 500,000/فيال، ومرور p3-p5).
- ضع قنينة مع الخلايا في حمام مائي عميق-1.0-سم في 37 درجة مئوية للسماح لذوبان الجليد. ذوبان الجليد القنينة حتى حوالي 70% حل خلية السائل. مسح أسفل القنينة بالكحول 70% والقنينة في حامل قنينة داخل BSC.
ملاحظة: تأكد من المياه لا تأتي على اتصال بالمواضيع أو غطاء القنينة لمنع التلوث المحتملة خلال الخلية البذر. منع ذوبان كامل للخلايا في المياه حمام أن عدم القيام بذلك قد يسبب موت الخلية غير مقصود.
- ضع قنينة مع الخلايا في حمام مائي عميق-1.0-سم في 37 درجة مئوية للسماح لذوبان الجليد. ذوبان الجليد القنينة حتى حوالي 70% حل خلية السائل. مسح أسفل القنينة بالكحول 70% والقنينة في حامل قنينة داخل BSC.
- رسم من 10 مل من وسائل الإعلام وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS). استخدام بيبيتور الآلي ونصيحة الماصة 10 مل لنضح في قارورة زراعة الأنسجة T75. السماح لوسائل الإعلام الكامل تشبع قاعدة قارورة بلطف هزاز قارورة ذهابا وإيابا.
- سوف تكون القنينة المفتوحة مع الخلية حل الأسهم و aspirate من القنينة، وإدراكا منها لسرعة بيبيتينج، ويجري أغشية الخلية الضعيفة من تجميد.
- نقل الخلايا إلى قارورة أنسجة T75 مع وسائل الإعلام. إخراج الخلية المذابة في قارورة الأنسجة، مراعاة سرعة بيبيتينج مرة أخرى.
ملاحظة: بذر كثافة الخلايا في الأنسجة قارورة هو تقريب 6,600 الخلايا/سم2. ويمكن تغيير كثافة البذر لاستيعاب المستخدم والتوقيت المطلوب للتجريب. - قياس 1 مل من وسائل الإعلام من قارورة T75 الأنسجة ونقل وحدة التخزين مرة أخرى إلى القنينة. تحويل وحدة التخزين من القنينة مرة أخرى إلى قارورة T75.
ملاحظة: إجراء هذه الخطوة تساعد على تعظيم العائد الخلية من القنينة. - تشديد غطاء قارورة زراعة الأنسجة والصخرة برفق لتفريق الخلايا في تعليق شكل موحد عبر كامل السطح. التحقق من التوزيع حتى للخلايا باستخدام مجهر مقلوب.
- قارورة التسمية مع نوع الخلية، تاريخ، الأحرف الأولى، والنسب، والغرض (مثلاً، هدفن، 11/07/2018، ممولين، مرور 4، الزرنيخ الصفر المقايسة). ضع قارورة زراعة الأنسجة في حاضنة هوميديفيد في 37 درجة مئوية و 5.0 في المائة CO2 ح 72.
ملاحظة: متوسط النمو يجب تغيير 12-24 ح بعد البذور الأولى لإزالة كميات نزرة من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) كريوبريسيرفاتيفي، وغيرت كل 48 ساعة ثم بعد ذلك لضمان تغذية الخلايا يتم بشكل صحيح. فترة الحضانة والنمو سيتوقف على عدد الخلايا اللازمة للتحليل الصفر محسوبة. عادة ما يكون الوقت مضاعفة للخلايا هدفن ح 16-24 في الظروف العادية. ومع ذلك، تضاعف معدل قد تتغير بسبب ارتفاع، الأس الهيدروجيني، درجة الحرارة، والرطوبة، ونوع الوسيطة، إلخ، ويجب أن يحسب عند التخطيط للتجارب.
3-خلية العد وثقافة فرعية في الأنسجة 12-كذلك لوحة
- استرداد قارورة زراعة الأنسجة T75 من الحاضنة. مراقبة التقيد بها الخلايا باستخدام مجهر مقلوب في موضوعي 10 X التكبير (100 X التكبير الكلي) وتحديد التقاء الخلية التقريبي.
- مسح أغلبية قارورة زراعة الأنسجة عندما يقترب من مراقبة التقاء لضمان نسبة الأكثر تمثيلاً. تقييم مورفولوجيا الخلايا الفردية لأي شذوذ أو للتلوث الجرثومي و/أو الفطريات.
- تجميع بيبيتور التلقائي مع طرف ماصة 10 مل. استخدم بيبيتور لنضح كامل حجم الوسائط من الحل T75 ونقل إلى حاوية نفايات. منع نصيحة بيبيت من الاتصال بسطح الخلية المنضمة. تجاهل نصيحة ماصة في سلة واقية.
- تجميع بيبيتور التلقائي مع تلميح ماصة 5 مل. نضح 5 مل من الملح حل متوازن والاستغناء عن في قارورة صخرة قارورة شطف الإعلامية الزائدة والخلايا الميتة ومنتج النفايات بلطف.
- رسم الحجم من T75 والاستغناء عن في حاوية النفايات. تجاهل نصيحة الماصة إلى بن واقية.
- تجميع بيبيتور التلقائي مع محول ماصة 5 مل. نضح 2 مل التربسين من المخزون والاستغناء في قارورة الصخور بلطف قارورة لتفريق الإنزيم فوق الخلايا التقيد بها. ضمان الإشباع الكامل للسطح ملتصقة. ضع قارورة الأنسجة في الحاضنة لمدة 2-3 دقائق (دقيقة).
ملاحظة: ينبغي أن لا تتجاوز الركازة الإنزيم أقصى رد فعل 10 دقيقة. - مراقبة قارورة الأنسجة تحت مجهر مقلوب الساعة 10 X الهدف عدسة تكبير (100 X التكبير الكلي). تطبيق لطيف الاهتزازات لتسهيل مفرزة الخلية.
- مسح قارورة T75 مع الكحول 70% والمكان داخل بكالوريوس العلوم.
- تجميع بيبيتور التلقائي مع تلميح ماصة 5 مل. نضح 5 مل من وسائل الإعلام من المخزون، وإضافة إلى قارورة الأنسجة T75 لإيقاف فعل الإنزيم الركازة. يجب أن تكون نسبة وسائل الإعلام: التربسين 3:1. بيبيت صعودا وهبوطاً قاعدة قارورة 2-3 مرات شطف والتأكد من توقف عن رد فعل. نضح كامل حجم السائل من قارورة ونقل إلى أنبوب مخروطي عقيمة 15 مل.
- ملء أنبوب مخروطي 15 مل ثاني مع حجم مماثل من وسائل الإعلام.
- ضع كلا من أنابيب مخروطية الشكل 15 مل في موقف المتناقضة لبعضها البعض. تطبيق 200 جرام قوة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية عن طريق تحديد معلمات تشغيل المعدات.
- مسح 15 مل الأنبوبة المخروطية مع خلايا الأعلاف بالكحول 70% ومكان داخل بكالوريوس العلوم.
- استخدام بيبيتور التلقائي مع مرفق 5 مل إلى بيبيت قبالة وسائط الإعلام، مخلفة وراءها حوالي 250 ميليلتر بيليه السوائل والخلايا. الاهتمام بموقع طرف بيبيت، كما ينبغي أن يظل بيليه الخلية دون عائق. الاستغناء عن وحدة التخزين التي تم جمعها في حاوية نفايات وتجاهل نصيحة في سلة واقية.
- استخدم حامل أنبوب ميكروسينتريفوجي لتشغيل الجزء السفلي من الأنبوبة المخروطية عبر فتحات قنينة، خلق اهتزاز سريع، لزعزعة وتعليق إعادة بيليه الخلية (التي تسمى أحياناً "حامل بنبش").
ملاحظة: تجنب استخدام خلاط دوامة للقيام بهذه الخطوة. القوات الجاذبية التي تم إنشاؤها بواسطة خلاطات دوامة تتجاوز عتبات جي فورس الخلية، ويمكن أن يسبب ليسينج. عند إكمال بشكل صحيح، ستظهر حل خلية جديدة كخليط غائم مع لا بيليه المتبقية. الحرص على القيام بهذه الخطوة ستخلق في كثير من الأحيان تعليق خلية مفردة، مما يؤدي إلى زيادة الدقة عند عد الخلايا. - إضافة 2 مل من وسائل الإعلام إلى مخزون الخلية أو استثارة. بيبيت الخلايا برفق أسفل الجانب من الأنبوب 20 مرات لتفريق أي كتل. سجل حجم تعليق خلية الإجمالي وجانبا بإيجاز.
- بيبيت 20 ميليلتر مخزون تريبان الأزرق (0.4%) في بئر فارغة من لوحة 96-جيدا باستخدام بيبيت عقيمة.
- مزيج الحل خلية الأسهم لتوليد تعليق خلية موحدة قبل نقل. استخدام تلميح بيبيت عقيمة لإزالة 20 ميليلتر من مخزون الخلية (تجنب لمس جدران الأنبوب). إضافة إلى 20 ميليلتر لحل تريبان الأزرق في اللوحة 96-جيدا.
- بيبيت برفق لخلط المحتويات. بيبيت 10 ميليلتر الخليط بين ساترة وفرز للدائرة على هيموسيتوميتير.
- مراقبة الخلايا والشبكة تحت هدف X 10. مراقبة تسعة مربعات كبيرة داخل مجال الرؤية. عد الخلايا فقط في الوسط والمربعات الزاوية 4 (مجموع المربعات 5).
ملاحظة: ابحث عن توزيع الخلايا بصورة موحدة عبر الشبكة كاملة لضمان حصيلة دقيقة. - حصر كافة الخلايا (شفافة والأزرق) في المربعات المحددة 5 من الشبكة. كل على حدة، حصر الخلايا (الأزرق) غلق فقط في الساحات 5 نفسه.
- حساب خلية قابلة للتطبيق باستخدام العد:
حيث x = عدد خلايا قابلة للحياة، = مجموع الخلايا، ب = الخلايا غير قابل للحياة - حساب الكثافة خلية قابلة للتطبيق باستخدام:
حيث x = الكثافة خلية قابلة للتطبيق و y = مجموع خلايا قابلة للحياة. - حساب مجموع الخلايا قابلة للتطبيق:
حيث x = مجموع خلايا قابلة للحياة، y = كثافة الخلايا قادرة على البقاء، و = حجم تعليق الخلية (mL). - حساب % بقاء الخلية:
حيث x = خلية نسبة البقاء، y = خلايا قابلة للبقاء تعتمد على الشبكة، و = مجموع الخلايا التي تعتمد على الشبكة.
- علامة خط أفقي عبر الجزء السفلي من لوحة 12-جيدا لتكون بمثابة علامات مرجعية أثناء التصوير.
- استخدام كثافة خلية قابلة للتطبيق (محسوباً 3.3.7) لاحتساب حجم الوسائط تمييع مخزون الخلية في لبذر طبق استنبات الأنسجة 12-جيدا.
ملاحظة: الخلية أمثل البذر الكثافة للخلايا هدفن هو 5,000 الخلايا/سم2. - تمييع الأسهم خلية إلى خلايا/مل 19,000 باستخدام وسائط الإعلام والبذور كل جيدا مع 1 مل مخزون الخلية. خلط الأوراق المالية الخلية بشكل دوري لضمان الخلية حتى البذر عبر جميع الآبار 12.
- قم بتسمية كل لوحة مع نوع الخلية والنسب، الأحرف الأولى من اسم المستخدم والغرض. وضع لوحات في حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية و 5.0 في المائة من أول أكسيد الكربون2. السماح للخلايا أن تنمو حتى يتم تحقيق التقاء 100% للمقايسة الصفر.
- استخدام كثافة خلية قابلة للتطبيق (محسوباً 3.3.7) لاحتساب حجم الوسائط تمييع مخزون الخلية في لبذر طبق استنبات الأنسجة 12-جيدا.
4-الزرنيخ (ك) الحلول المخزون والحسابات
- تمييع زرنيخيت الصوديوم (ناسو2) مباشرة في خلية ثقافة الإعلام مع 10% FBS في تركيزات العامل من 10، 1.0 و 0.1 و 0.01 ميكرومتر ك.
- لهذا، جعل أسهم أولية 1 مم كحل بتمييع 3.9 ملغم زرنيخيت الصوديوم إلى 30 مل من وسائل الإعلام. متسلسل تمييع 1 مم الأسهم المتبقية كحلول.
| 1000 ميكرومتر كالأسهم العمليات الحسابية | تعمل الأسهم تركيزات الزرنيخ | 1ت م1= م2ت2 | حجم الحل الزرنيخ السابقة | حجم الوسائط | الحجم الإجمالي للزرنيخ العامل المخزون |
| ناسو2 الوزن الجزيئي: 129.9 غ/مول | 10 ميكرون | (س مل) (1,000 ميكرومتر) = (30 مل)(10 µM) x = 0.3 مل | ميليلتر 0.3 مل = 300 مم 1 كحل | وسائط 29.7 مل | 30 |
| .03 L x.001 mol/L x 130 g/mol = 3.9 ملغم الزرنيخ | 1.0 ميكرومتر كما | (س مل) (10 ميكرون) = (30 مل)(1 µM) x = 3 مل | 3 مل من 10 ميكرون كحل | 27 مل من وسائل الإعلام | 30 |
| تمييع 3.9 ملغم زرنيخيت الصوديوم في وسائل الإعلام 30 مل | 0.1 ميكرومتر كما | (س مل) (1 ميكرومتر) = (30 مل)(0.1 µM) x = 3 مل | 3 مل من 1 ميكرومتر كما | 27 مل من وسائل الإعلام | 30 |
| 0.01 ميكرومتر كما | (س مل) (0.1 ميكرومتر) = (30 مل)(0.01 µM) x = 3 مل | 3 مل من 0.1 ميكرومتر كما | 27 مل من وسائل الإعلام | 30 |
الجدول 1. الأرصدة الزرنيخ وتخفيف المسلسل. هذا الجدول يوضح العمليات الحسابية المستخدمة لإنشاء حلول الأسهم كما وتعمل حلول الأسهم لمجموعات العلاج.
5-الصفر تقنية المقايسة والتلوث بالزرنيخ
- الحصول على لوحة 12-جيدا مع الخلايا من الحاضنة. عرض الخلايا في 10 X التكبير موضوعية (100 X التكبير الكلي). تحديد التقاء خلية داخل كل بئر.
ملاحظة: كل جيدا الفردية يجب التوصل إلى التقاء 100% قبل الخدش. يضمن الاتساق داخل مقايسة هذه الخطوة الحاسمة ويساعد على توحيد بروتوكولات الفحص عبر التجارب. إذا لم تصل أي الآبار إلى التقاء 100%، تسمح للخلايا لاحتضان المزيد من الوقت حتى وصلت جميع الآبار التقاء 100%. لن تتأثر الوقت النمو الإضافي في الآبار التي وصلت بالفعل التقاء 100%. سوف عادة يصبح النمو القبض على خلايا الجلد وتبقى كثقافة أحادي الطبقة، بينما تسمح الآبار المتلاقية دون التوصل إلى التقاء 100%. - تجميع بيبيتور تلقائي مع طرف ماصة 10 مل. نضح وسائط النمو من جميع الآبار. التصرف في حجم النفايات السائلة ونصيحة ماصة في بن مبعدة.
- تجميع بيبيتور p200 مع تلميح 1-200 ميليلتر عقيمة. في كل بئر، تنتج الصفر "الجرح صورية" بالانزلاق نصيحة عبر سطح الخلية من 12-مساء إلى الساعة السادسة صباحا من الموقع.
ملاحظة: هناك ثلاثة عوامل ستؤثر إلى حد كبير على الاتساق هي السرعة والضغط، وزاوية تلميح. ينبغي إجراء الصفر سريعاً، مع ضغط مستمر، مع مراعاة زاوية نصيحة البقاء عمودي لقاعدة اللوحة. الخدش ببطء شديد سوف يسبب خطوط ملتوية، الضغط الزائد يمكن بشكل دائم نقاط أسطح الخلية المنضمة، وزاوية نصيحة أقل من 90° سيتم تضييق عرض الصفر. يمكن أن يؤدي أي من هذه الأخطاء الشائعة في أنماط ومعدلات الهجرة غيرت. - واضحة بعيداً كتل الحطام وخلية زائدة بدهن مع 1 مل من محلول ملح متوازن كل بئر. روك لوحة لجنبا إلى تسهيل الغسيل. إزالة الحل الملح متوازنة من الآبار، والتصرف في حاوية نفايات. التخلص من طرف ماصة 5 مل إلى بن مبعدة.
- تجميع بيبيتور p200 مع تلميح 1-200 ميليلتر عقيمة. في كل بئر، تنتج الصفر "الجرح صورية" بالانزلاق نصيحة عبر سطح الخلية من 12-مساء إلى الساعة السادسة صباحا من الموقع.
رقم 1: التمثيل التخطيطي للمقايسة الصفر. جميع العمل داخل حقل العقيم لتقليل فرص التلوث. خلايا المصنف في كثافة المرجوة في قوارير زراعة الأنسجة ونما في حاضنة للظروف الفسيولوجية البشرية (5% CO2، 37 درجة مئوية). عند الوصول إلى التقاء المرجوة، خلايا أسيبتيكالي الفرعي تستزرع في لوحات زراعة الأنسجة 12-جيدا في كثافة بذر المطلوب. وتزرع الخلايا لالتقاء 100% في كل من لوحة 12-جيدا وخدش استخدام تلميح بيبيت معقمة جيدا. ينشئ هذا "الصفر" في المختبر صورية جرحا (النطاق المرمز إليه بواسطة سهم مزدوج الرأس)، التي تهاجر فيها الخلايا بطبيعة الحال إغلاق منطقة مفتوحة. كل جيدا يمكن أن يكون فريد مكيفة ويمكن ملاحظة معدلات الهجرة الخلوية وكمياً في الاستجابة لشروط معاملة مختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- استخدام بيبيتور p1000 مع تلميح ميليلتر 1,000 بيبيت 1,000 ميليلتر من الأرصدة الزرنيخ في الآبار التي تم تعيينها بشكل عشوائي مع مجموعة علاج. استخدام تلميح بيبيت جديدة لكل بئر لمنع حدوث التلوث المنتقل. سجل الوقت عند إضافة العلاجات. وضع لوحات 12-جيدا في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5.0 في المائة من أول أكسيد الكربون2.
6-التصوير
- التقاط صور لكل بئر في 10 X التكبير موضوعية كل ح 4 على مدى فترة 24 ساعة (0، 4، 8، 12، 16، 20 و 24 h). الإشارة إلى الخط الذي رسمته سابقا في الجزء السفلي من لوحة الصورة في نفس المكان على طول الصفر داخل كل بئر في النقاط الزمنية اللاحقة.
ملاحظة: من الضروري أن يتم تصويرها في نفس المواقع عند كل نقطة الوقت للسماح بتحليل صورة دقيقة، والحصول على بيانات تمثيلية.
7-صورة التحليل
- تحميل الصور التي تم التقاطها في المجهر المقلوب الخفيفة إلى جهاز كمبيوتر وحفظها كصورة بتنسيق JPEG باستخدام اسم ملف مفصل.
- افتح إيماجيج.
- تحميل صورة ميكرومتر المرحلة مع المسافات المعروفة للبرنامج لتحويل وحدات البكسل إلى ميليمتر (مم) عندما أخذ قياسات الصورة عن طريق سحب وإسقاط الملف في إطار البرنامج.
ملاحظة: ميكرومتر ينبغي أن يكون لخطوط ترسيم بطول 1 ملم معروفة ويجب اتخاذ الصورة في نفس التكبير المستخدمة لالتقاط صور للخلايا. على سبيل المثال، في هذه الدراسة كانت تؤخذ الصور 100 × مجموع التكبير، وبالتالي صورة ميكرومتر المرحلة قد اتخذ في 100 × مجموع التكبير.- انقر فوق خيارات مستقيمأو سيجمينتيدأو أسطر يدوي .
- رسم خط من المسافة المعروفة في الصورة ميكرومتر باستخدام علامات التجزئة بطول المرتبطة لكل علامة علامات. لرسم خط مستقيم: انقر فوق الماوس واضغط واسحب المؤشر إلى الموقع المطلوب، ثم ترك الماوس.
- حدد تحليل ثم حدد ضبط مقياس.
- تعيين المسافة المعروفة على طول الخط الذي رسمته في الخطوة السابقة المعروفة.
- تعيين وحدة الطول مم.
- تحقق من مربع العالمية.
- حدد "موافق" للخروج من القائمة.
- إغلاق خارج الصورة ميكرومتر المرحلة.
- تحميل صورة المقايسة الصفر إلى إيماجيج عن طريق سحب وإسقاط ملف الصورة في النافذة.
- رسم خط مستقيم عبر عرض الصفر (من الحافة اليسرى مما يؤدي إلى الحافة اليمنى الرائدة).
- اضغط على الحرف M على لوحة المفاتيح لتسجيل قياس الخط المستقيم الذي رسمته. سوف تظهر نافذة النتائج صغيرة مباشرة بعد كتابة الحرف M. هذا حيث سيتم قياس العرض.
- كرر الخطوة 7، 4 ما مجموعة 10 مرات للحصول على قياسات 10 على طول الصفر.
ملاحظة: من المهم لتوليد القيم العرض الأكثر تمثيلية إلى أسفل على طول من الصفر. تأكد من مساحة قياسات العرض 10 التساوي على طول الصفر من أعلى إلى أسفل. - قم بإنشاء ملف جدول مقايسة الصفر لنسخ ولصق القياسات.
- نسخ ولصق قياسات العرض 10 من إطار النتائج في العمود المناسب في ملف جدول بيانات (الجدول 2).
ملاحظة: عندما يتم نسخها من إطار نتائج القياسات ولصقها في جدول البيانات، يكون هناك أعمدة غريبة من القيم؛ وينبغي حذف هذه القيم، الحفاظ على قياسات العرض 10 فقط.
- نسخ ولصق قياسات العرض 10 من إطار النتائج في العمود المناسب في ملف جدول بيانات (الجدول 2).
| 10 قياسات عرض عشوائي | ح 0 | ح 4 | ح 8 | ح 12 | ح 16 | ح 20 | ح 24 |
| 1 | |||||||
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | |||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | |||||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
| 10 | |||||||
| متوسط القياسات 10 |
الجدول 2. قياسات عرض الخام الجدول تنسيق. هذا الجدول يبين الهيكل التنظيمي للقياسات الخام التي تم الحصول عليها.
- كرر الخطوة أعلاه لما تبقى صور التحليل الصفر.
- حساب متوسط القياسات 10 في كل وقت نقطة (0-24 ح) لكل بئر.
- تحديد المائة الإغلاق عمليات حسابية باستخدام قيم من الخطوة 7.8.
- إنشاء جدول في أسفل جدول بعنوان "عرض قياس المتوسطات" (الجدول 3).
- نسخ ولصق الصف المتوسط من 10 القياسات المحسوبة في الخطوة 7.8 في الجدول "قياس عرض المتوسط".
- إنشاء جدول آخر بجوار الجدول المتوسطات قياس العرض . العنوان هذا الجدول إغلاق الجرح في المائة (الجدول 4).
ملاحظة: يجب أن تكون القيمة في العمود 0 ح لكل بئر 0 لأن الصفر هو 0% مغلقة في الصورة الأولى 0 ح لجميع الآبار. - انتقل إلى العمود التالي على (ح 4).
- حساب على الإغلاق بالنسبة المئوية النسبة 4، 8، 12، 16، 20، والنقاط الزمنية ح 24:
حيث x = النسبة المئوية من الإغلاق، أنا = عرض الصفر الأولى (العرض 0 ح)، و = العرض النهائي الصفر (4، 8، 12، 16، 20، أو 24 ساعة العرض).
| كذلك عرض المتوسطات | ح 0 | ح 4 | ح 8 | ح 12 | ح 16 | ح 20 | ح 24 |
| 1a | |||||||
| 2 ألف | |||||||
| 3a | |||||||
| 4a | |||||||
| 1b | |||||||
| 2 (ب) | |||||||
| 3 (ب) | |||||||
| 4b | |||||||
| ج 1 | |||||||
| ج 2 | |||||||
| ج 3 | |||||||
| ج 4 |
الجدول 3. ويبلغ متوسط قياس عرض تنسيق الجدول. هذا الجدول يبين الهيكل التنظيمي لعرض قياس المتوسطات المحسوبة باستخدام القياسات الخام العرض في الجدول 2.
| بئر | ح 0 | ح 4 | ح 8 | ح 12 | ح 16 | ح 20 | ح 24 |
| 1a | 0 | ||||||
| 2 ألف | 0 | ||||||
| 3a | 0 | ||||||
| 4a | 0 | ||||||
| 1b | 0 | ||||||
| 2 (ب) | 0 | ||||||
| 3 (ب) | 0 | ||||||
| 4b | 0 | ||||||
| ج 1 | 0 | ||||||
| ج 2 | 0 | ||||||
| ج 3 | 0 | ||||||
| ج 4 | 0 |
الجدول 4. الجرح بالمئة تنسيق جدول الإغلاق. هذا الجدول يبين الهيكل التنظيمي لحساب قيم إغلاق الجرح نسبة استخدام قياس عرض المتوسطات في الجدول 3.
- إنشاء جدول آخر بجوار الجدول إغلاق الجرح بالمئة . العنوان هذا الجدول أوك (الجدول 5).
- حساب 0-4 ح المنطقة تحت المنحنى (AUC) القيمة 0-4 في العمود h لكل بئر:
حيث x = 0-4 ح أوك القيمة، و = قيمة الإغلاق % 0 ح، ب = قيمة الإغلاق % 4 ح، ح = الوقت بين التدابير اثنين (ح 4 في هذه الدراسة). - حساب المنطقة تحت المنحنى (AUC) القيمة في العمود h 4-8 لكل بئر ح 4-8:
حيث x = 4-8 ح أوك القيمة، = قيمة الإغلاق % 4 ح، ب = قيمة الإغلاق % 8 ح، ح = الوقت بين التدابير اثنين (ح 4 في هذه الدراسة).
ملاحظة: ينبغي حساب قيمة أوك واحدة لكل الفاصل الزمني ح 4 على مدى فترة 24 ساعة لكل بئر. - مجموع كافة قيم أوك من ح 0-24 (محسوبة بالخطوات 7.10.1-7.10.2) للحصول على قيمة أوك summed لكل بئر. ضمان هذه القيم يتم حفظها بشكل صحيح للتحليل الإحصائي.
- حساب 0-4 ح المنطقة تحت المنحنى (AUC) القيمة 0-4 في العمود h لكل بئر:
| بئر | 0-4 ح | 4-8 ح | 8-12 ح | 12-16 ح | 16-20 ح | ح 20-24 | أوك summed |
| 1a | |||||||
| 2 ألف | |||||||
| 3a | |||||||
| 4a | |||||||
| 1b | |||||||
| 2 (ب) | |||||||
| 3 (ب) | |||||||
| 4b | |||||||
| ج 1 | |||||||
| ج 2 | |||||||
| ج 3 | |||||||
| ج 4 |
الجدول 5. تنسيق الجدول أوك. هذا الجدول يبين الهيكل التنظيمي لحساب القيم/أوك/باستخدام النسبة المئوية للجرح قيم الإغلاق في الجدول 4.
8-إحصائية تحليل
- تحديد أسلوب التحليل الإحصائي الذي يناسب كل من التصميم التجريبي ومجموع القيم/أوك/التي تم الحصول عليها أثناء الفحص.
Representative Results
وكان حجم العينة (n) لكل معاملة المجموعات n = 28. وكانت الخلايا المستزرعة بنجاح التقنيات التالية العقيم وبروتوكولات مختبر (الشكل 1). ولوحظت خدوش موحدة عبر كافة مجموعات علاجية مع عرض الصفر يعني قياس 0.8 ملم 0.4 مم (الشكل 2). مجموعات التحكم كان متوسط مساحة summed تحت المنحنى قيمة 1,355.83؛ ميكرومتر 0.01 كمجموعات العلاج كان متوسط قد لخص المنطقة تحت المنحنى قيمة 1,366.21؛ 0.1 ميكرومتر كمجموعات العلاج قد لخص متوسط المساحة تحت المنحنى قيمة 1,326.24، قد 1.0 ميكرومتر كفريق العلاج في متوسط قد لخص المنطقة تحت المنحنى قيمة 1,295.10؛ وأخيراً 10 ميكرومتر كما كان الفريق معاملة منطقة summed متوسط تحت المنحنى قيمة 535.12، الذي كان أقل إحصائيا مقارنة بجميع الفئات الأخرى (p < 0.05) (الشكل 3). واستخدمت برنامج R للتحليل الإحصائي لتشغيل ANOVA أحادي اتجاه مع تسوية توكي الوظائف المخصصة لتحديد الفروق الإحصائية بين المجموعات المعالجة (ف < 0.05).
رقم 2: الاعتداء الصفر الممثل الصور على مدى فترة 20 ح. د-الصور تمثل الهجرة الخلوية لخلايا المراقبة؛ الصور ه-ح تمثل الهجرة الخلوية للخلايا الملوثة مع 1.0 ميكرومتر ك؛ وتمثل الصور أنا-L الهجرة الخلوية للخلايا الملوثة مع 10 ميكرون ك. من هذه الصور، فمن الواضح أن الهجرة الخلوية تباطأ حضور الزرنيخ. إظهار الصور تحكم الصفر "شُفي" تماما بعد ح 20، بينما الفريقان كمعاملة أخرى لا "تلتئم". ميكرومتر 10 كعلاج أعاق الإغلاق الكامل تماما بعد 24 h. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الزرنيخ يؤدي إلى إبطاء الهجرة الخلوية في مقايسة الصفر. تم القبض على الصور على مدى فترة 24 ساعة لمراقبة التغييرات في معدلات الهجرة الخلوية وجود تركيزات متفاوتة من الزرنيخ. تم تحليل صور raw باستخدام برامج الآلي (مثلاً، في MATLAB)، الذي عرض الجرح المقاسة في البداية، ثم تحسب نسبة الإغلاق، وأخيراً المنطقة تحت المنحنى (AUC). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط. ميكرومتر 10 كمجموعة العلاج إحصائيا تباطأت الهجرة الخلوية البشرية عن طريق الجلد الخلايا الليفية الولدان (هدفن)، سيظهر بقيمة أوك إحصائيا أقل، مقارنة بجميع المجموعات المعاملة الأخرى استخدام ANOVA اتجاه واحد مع تسوية وظيفة المخصص توكي (ف < 0.05). يتم تمثيل الاختلافات الإحصائية بالحروف "ألف" و "باء"، والتي تم الحصول عليها من خلال استخدام أسلوب "ضغط رسالة العرض" المتاحة في برنامج البحث والتطوير. العلاجات التي لا تشترك في رسالة مشتركة يعتد به إحصائيا من بعضها البعض (ف < 0.05). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
تطبيق هذا الفحص يوفر تقييم الفائق، وفي الوقت المناسب للهجرة الخلوية وقد يترجم مباشرة إلى النظم الفسيولوجية المعقدة5،،من67. ولهذا السبب، تم ضبطها ويمارس لتقييم آثار مختلف العوامل العلاجية والسموم البيئية على الجرح الشفاء6مقاعد البدلاء-أعلى النموذج المقترح. تركيزات الزرنيخ المستخدمة في الدراسة الحالية تعتبر بيئياً ذات الصلة عن طريق البحث في الأدبيات واسعة من مستويات التعرض المعروفة، ومن مراجعة استعادية بيانات مختلف قواعد1514،، 16،،من1718،19،،من2021. استخدام هذا في المختبر الصفر الفحص أثبتت أن التعرض لتركيز الزرنيخ داخل العالية، لكن نطاق بيئياً ذات الصلة، وتأخر إغلاق الجرح (الهجرة الخلوية).
كما كان يعمل هذا النموذج الأعلى في مقاعد البدلاء لعزل ودراسة خط خلية فردية (تنتجها الخلايا الليفية) زيادة فهم كيفية إسهام الهجرة تنتجها الخلايا الليفية الجرح نتائج الشفاء. وعلاوة على ذلك، من الصعب دراسة مهام خط الخلية الفردية في الأنظمة المعقدة في فيفو مع العديد من الخلايا والأنسجة الحالية الأخرى التي يمكن أن تتداخل مع التحليل. بالإضافة إلى ذلك، يوفر المقايسة إلى وسيلة لتحقيق البيانات إغلاق الجرح نسبة نصف الكمية التي يمكن استخدامها لاستهداف آليات خلوية محددة من خلالها المركبات قد تؤثر على التئام الجروح. على سبيل المثال، يمكن جمع الخلايا المستخدمة في التحليل الصفر والمخزنة في كاشف المرجوة والمستخدمة في التعبير الجيني (إشارة مرناً) أو تعبير البروتين فحوصات22. يمكن أن تكون هذه المعلومات مفيدة للمحقق إذا كانت تسعى إلى فهم ما إشارات أو البروتينات قد إلى حد كبير يسهم في أحداث تغييرات في الهجرة الخلوية حضور متفاوتة علاجات (أي، الزرنيخ)22.
واختيرت الليفية الجلدية الولدان البشرية لهذا العمل استناداً إلى دورها البارز في التئام الجروح. ومع ذلك، تم تنفيذ هذا البروتوكول المقايسة الصفر باستخدام مختلف أنواع الخلايا ومن أجل تحقيق مجموعة من الأغراض البحثية. على سبيل المثال، اعتمد التحليل الصفر في مجال الأورام لدراسة تثبيط الهجرة للعلاج الكيميائي المخدرات23؛ للهجرة الخلية الهيكل العظمى والعضلات، والانتشار، ونشر24؛ لدراسة تأثير المستخلصات النباتية على25من الهجرة الخلوية؛ وأن نفهم كيف تساهم الهجرة keratinocyte وانتشار الجرح الشفاء9. بالإضافة إلى ذلك، ورقة سابقة بواسطة بينتو et al. تقييم آثار اليورانيوم (U) والبلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) على الهجرة هدفن استخدام مقايسة الصفر6. وكان الغرض من هذا العمل فهم المدى الذي يمكن اختبار هذا التحليل تأثير عامل الفكر إلى إبطاء الهجرة الخلوية (U)، فضلا عن عامل الفكر إلى تسريع الهجرة الخلوية (الحزب الثوري). كما يمكن أن يرى في العمل المذكور آنفا والبحوث محققون آخرون، تطبيق التحليل الصفر إمكانات عالية للاستخدام في مختلف النماذج التجريبية26. على الرغم من التفاصيل المقدمة ضمن الأساليب، يتوقع أن الفرق بين المحققين والتجارب. على سبيل المثال، معدلات الهجرة الخلوية سوف يرجح أن تتقلب استناداً إلى خط الخلية في الاستخدام، بالإضافة إلى المغذيات الدقيقة المطلوبة اللازمة لأنواع الخلايا الفريدة. يتم سرد العديد من الملاحظات الهامة للمساعدة في الخلية العائد والجدوى كما يلاحظ في جميع أنحاء هذا البروتوكول. ومع ذلك، فمن المستحسن أن المحققين اتبع توصيات الشركة المصنعة لظروف النمو الأمثل، واستخدام هذا الأسلوب كالتعليم التكميلي للخلية العامة ثقافة العمل.
على الرغم من أن التحليل الصفر مرنة للغاية لدراسة الأنشطة الخلوية؛ قد تنشأ التحيز غير المنظورة في قياس التقنيات. على سبيل المثال، عند استخدام إيماجيج لتتبع يدوياً جبهات الهجرة الخلية، قد يوجد تباين بين المستخدمين، والتي يمكن أن تحد من دقة وجمع بيانات تمثيلية. كما تجدر الإشارة إلى أن الجبهات الهجرة ينبغي أن يقرأ الأعمى للعلاج للتقليل من التحيز المستخدم. وعلاوة على ذلك، يدوياً تحديد جبهات الهجرة قد يؤدي إلى سوء تقدير لمتوسط المسافة سافر بسبب تشكيل بسيودوبود الخلايا وقدرتها على الوصول إلى نموذج الالتصاقات المحورية، التي يمكن أن تكون مضللة بصريا. وعلى نفس المنوال، استخدام فلوري "تعقب خلية" الأصباغ على سطح الخلية أو البروتينات النووية للكشف عن الهجرة قد غير قصد إصلاح الخلايا أدى إلى عدم الدقة عند قياس الهجرة الخلوية على مر الزمن. من المستحسن أن يكون المسجلين الضوابط الإيجابية و/أو السلبية المناسبة داخل هذه التجربة لتقويم تماما تأثير العلاج على خطوط الخلية. يجب إكمال الممارسة لهذا التحليل واعترافاً بأوجه القصور. هذا التحليل لا تضمن أن نتائج الهجرة الخلوية التي تم الحصول عليها من التجارب في المختبر سوف تترجم مباشرة إلى نتائج في فيفو . الهجرة الجرح الشفاء والخلوية في نظام معيشة معقدة تنطوي على العديد من أنواع الخلايا والإشارات الجزيئية؛ كل منها لديه القدرة على التأثير على استجابات الشفاء.
في ملخص، وجد المقايسة الصفر لتوفير الفرز الفائق للهجرة الخلوية استجابة لتغير البيئات6،25. ونحن على وجه التحديد تستخدم هذا البروتوكول بنجاح الكشف عن التغييرات في الهجرة الخلوية نتيجة للتعرض للزرنيخ في جرعات مختلفة بيئياً ذات الصلة. وقدمت هذه البيانات مبررا لاستخدام مقايسة الصفر إلى مزيد من الدراسة وتقييم مسارات آليا إلى الهجرة الخلوية في هذا التحليل، وكيف يتم تغيير هذه المسارات بالتعرض للزرنيخ.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد المعهد الوطني لصحة الأقليات والفوارق الصحية من "المعاهد الوطنية للصحة" تحت رقم جائزة U54MD012388 للبحث عنها في هذا المنشور. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
| Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
| Water Bath | Precision | Model 182 | |
| Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
| CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
| Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
| Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
| Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
| p200 Pipette | Gilson | ||
| p20 Pipette | Gilson | ||
| Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
| T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
| 15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
| 50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
| 5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Tissue Marker | Securline | 92167 | |
| Wipes | Kintech | 34155 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
| Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
| Bleach | Great Value | 220-04 | |
| 96-well | Falcon | 353915 | |
| Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
| Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
| Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
| 12-well plate | Corning | 3598 | |
| Waste Beaker | n/a | n/a | |
| 1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
| Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
| Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
| Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
| Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |
References
- Diegelmann, R., Evans, M. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing. Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).
- Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. Novel insights into wound healing sequence of events. Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).
- Michelson, A. Platelets. , 3rd edition, Waltham, Massachusetts. (2013).
- Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations. American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).
- Liang, C., Park, A., Guan, J. In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. , 329-333 (2007).
- Pinto, B., et al. A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied. In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).
- Pinto, B., et al. Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model. Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).
- Roubelakis, M., et al. Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).
- Shibata, S., et al. Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway. Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).
- Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. Cellular aspects of wound healing. Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).
- Gentry, P. R., Clewell, H. J. III, Greene, T. B., et al. The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).
- Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media. International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).
- Robertson, F. N. Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States. Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).
- Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA. Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).
- Uhlman, K. Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics. , The University of Arizona. Tucson, AZ. Arizona Cooperative Extension, AZ 1453 (2008).
- Agusa, T., et al. Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam. Science of the Total Environment. , 488-489, 562-569 (2014).
- Ayotte, J. D., et al. Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States. Science of the Total Environment. , (2014).
- Dummer, T. J., et al. Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada. Science of the Total Environment. , (2014).
- Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations. Water Research. 48, 156-169 (2014).
- Beamer, P. I., et al. Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).
- Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).
- Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. Optimization of cell motility evaluation in scratch assay. Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).
- Harishkumar, M., et al. Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract. BioMed Research International. 13, Article ID 963457, 8 pages (2013).
- Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay? Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).
