Summary
Cette étude porte sur un modèle in vitro de plaie guérison (zéro dosage) comme un mécanisme pour déterminer les contaminants environnementaux tels que les migrations cellulaires d’influence de l’arsenic. Les résultats démontrent que ce test in vitro fournit des indications rapides et précoces des changements à la migration cellulaire avant in vivo de l’expérimentation.
Abstract
La compréhension des mécanismes physiologiques de la cicatrisation des plaies a fait l’objet des recherches en cours depuis de nombreuses années. Cette recherche se traduit directement l’évolution des normes cliniques utilisés pour le traitement des plaies et de diminuer la morbidité et mortalité pour les patients. La cicatrisation est un processus complexe qui nécessite la fonction et interaction stratégique de cellules et de tissus. Une des nombreuses fonctions extrêmement importantes de cicatrisation est individuelle et collective de migration cellulaire. Sur blessure, diverses cellules du sang, entourant les tissus conjonctifs, épithéliaux et rapidement migrent vers le site de la plaie par des stimuli physiques ou chimiques. Cette réponse de migration peut dicter dans une large mesure les résultats et le succès d’une plaie de guérison. Il est important pour la médecine translationnelle qui peut conduire à des résultats de cicatrisation améliorée de comprendre cette fonction cellulaire spécifique. Nous décrivons ici le protocole utilisé pour mieux comprendre les migrations cellulaires en ce qui concerne la cicatrisation, et comment les changements dans l’environnement cellulaire peuvent altérer considérablement ce processus. Dans cette étude de l’exemple, fibroblastes dermiques ont été cultivés en milieu additionné de sérum fœtal (SVF) comme des cultures monocouches dans des flacons de culture de tissus. Cellules ont été aseptiquement transférés en plaques de 12 puits de culture de tissus traitée, développées au confluent de 100 %. En arrivant à confluence, les cellules de la monocouche étaient verticalement grattés à l’aide d’une pointe de pipette p200. L’arsenic dilué dans les milieux de culture additionné de FBS a été ajouté aux puits individuels à écologiquement pertinentes doses variant de 0,1 à 10 M. Images on a capturé toutes les 4 heures (h) sur une période de 24 h à l’aide d’un microscope inversé de lumière pour observer la migration cellulaire (enroulées fermeture). Des images ont été analysés individuellement à l’aide de logiciels d’analyse image et % plaie fermeture a été calculée. Les résultats montrent que l’arsenic ralentit la cicatrisation des plaies. Cette technique fournit un premier écran rapid et peu coûteux pour l’évaluation des effets des contaminants sur la cicatrisation des plaies.
Introduction
La cicatrisation se compose d’une série complexe de chevauchement des étapes qui implique différents types de cellules, molécules de signalisation et de composants de la matrice extracellulaire1. Ensemble, ces composants fonctionnent de concert pour atteindre la résolution de plaie ou de réparation, ce qui conduit finalement à la formation d’une cicatrice fibreuse protection selon le degré de traumatisme1. Pour capturer les processus individuels et les fonctions de plaie dans une expérience de guérison est difficile ; différentes étapes dans la processus de cicatrisation doivent être identifiés et testés séparément. Parmi les nombreuses étapes de la cicatrisation des plaies, le processus de migration cellulaire a été jugé critique lors de l’évaluation de guérison taux2. Migration cellulaire peut être observée dans toutes les phases de la cicatrisation des plaies et donc nécessite davantage de comprendre comment des altérations de la migration cellulaire peuvent avoir des répercussions refermer les plaies. Par exemple, la migration cellulaire est vu dans les deux inflammation de début et de fin de phase, avec agrégation de coagulation et des plaquettes de sang à la plaie site3. Ces événements prévenir la perte excessive de sang en formant un blocage temporaire pour combler les blessés des zones dépourvues de tissus3. Plaquettes en circulation vont synthétiser et sécréter des médiateurs vasoactifs ainsi que de facteurs chimiotactiques, quel signal ensemble pour la migration des leucocytes inflammatoires (globules blancs) dans les tissus blessés pour réparer4. Réépithélialisation survient dans les heures suivant la lésion tissulaire et implique couvrant la plaie par l’activité et la migration des kératinocytes épithéliales pour prévenir toute nouvelle contamination ou invasion de particules étrangères à la plaie site2. Ces exemples de capturer seulement quelques-uns de la migration cellulaire nombreuses fonctions associées à la guérison des plaies.
Le dosage zéro a été décrit et utilisé pour mieux comprendre la migration cellulaire et ses nombreux rôles dans la cicatrisation des5,6. Cet essai est considéré comme simpliste, offre haut-débit et permet à l’enquêteur recueillir des données de migration des cellules représentant. Les essais de migration ont réussi à démontrer que certains composés peuvent accélérer ou ralentir le rythme de migration cellulaire6. En outre, ces résultats d’analyses renseignent translationnelle physiologique qui peut être utilisé pour formuler des traitements de cible, dosage des concentrations et des gènes d’intérêt avant in vivo de l’expérimentation. Le test requiert des techniques de culture de cellule de base et de fournitures, d’une lignée cellulaire de choix et une technologie d’imagerie pour capturer le mouvement avec le temps ou le mouvement en réponse aux traitements.
Le dosage peut être facilement manipulé ou adapté pour répondre aux besoins de l’enquêteur. Cependant, il y a quatre questions de base à considérer avant l’expérimentation. Quelles questions générales ou particulières sont/sont le chercheur tente de répondre ? Cela est vrai pour la plupart des hypothèses axé sur la recherche ; Toutefois, il est essentiel de ce test car elle déterminera plusieurs paramètres nécessaires à avec précision et répondre complètement à la question (s). Quelle lignée de cellules ou lignées de cellules (si plusieurs) devraient être utilisées pour représenter le système physiologique étudié ? Par exemple, dans une cutanée plaie étude guérison, fibroblastes dermiques5,6,7, cellules souches,8, ou les kératinocytes épidermiques9 pourrait être considérée comme représentant des populations de cellules qui se trouvent normalement en abondance dans les tissus de la peau10. Alternativement, les neutrophiles, les macrophages ou les autres cellules inflammatoires peuvent être évaluées dans ce système pour représenter la migration cellulaire des autres composantes de la cicatrisation dans les tissus de peau10. En outre, identification de la ligne de cellule spécifique en cours d’évaluation vous aidera à identifier quels réactifs sont optimales d’utiliser pour promouvoir l’activité métabolique des cellules. Comment la migration cellulaire sera suivi/image ? Il y a un certain nombre de techniques utilisées pour observer la migration cellulaire dans une assiette ou un ballon. Par exemple, la teinture ou fluorescent marquage des cellules et en utilisant la fluorescence ou imagerie confocale pour suivre les cellules fournit un fort contraste, qui permet au chercheur de définir clairement les cellulaires contre des endroits non alvéolaire et mouvement cellulaire11 . Une autre technique courante, décrite dans cette étude, est l’utilisation de la microscopie inversée avec contraste de phase6,7. Cette alternative aux colorants de la cellule et la fluorescence permet à l’utilisateur de vivre les cellules de piste sans avoir à fixer en position terminale cellules avant l’imagerie et permet aussi de capturer des images de la même puits individuels contenant blessés monocouches de cellules dans l’ensemble de points dans le temps. Quel résultat mesure sera utilisé pour l’analyse ? En utilisant les images recueillies tout au long de l’étude, données peuvent être générées dans lequel les changements aux taux de migration cellulaire peuvent être comprises. Dans notre laboratoire, microscopiques images capturées sur le microscope photonique inversé sont téléchargés vers le logiciel d’analyse image et la fermeture de la plaie pour cent et la somme aire sous la courbe (AUC) sont calculés.
Nous mettrons en évidence l’utilisation spécifique de ce test pour élucider les changements à la migration des fibroblastes dermiques en présence d’un contaminant environnemental connu, l’arsenic. L’arsenic est un métalloïde naturel trouvé au sein de la croûte terrestre. Divers endroits ont été trouvés avec des niveaux élevés d’arsenic, qui pose un risque pour les personnes qui vivent près de ces endroits. Ainsi, les sources de nourriture et d’eau ont démontré avoir augmenté les niveaux de contamination par l’arsenic, ce qui augmente la probabilité pour les individus à devenir exposés à l’arsenic. Exposition à l’arsenic environnementale s’est avérée avoir des conséquences à long terme sur la santé dans les populations humaines au-dessus ou même inférieure à l’actuelle United States Environmental Protection Agency (USEPA) Max Contaminant niveau (MCL) de 10 ppb (10 µg/L)12, 13. bien que l’USEPA a mis cette MCL et jugeait potable des limites, des concentrations d’arsenic qui dépassent cette limite ne sont pas rares dans les sources d’eau dans le monde entier. Dans le sud-ouest des États-Unis, les nombreuses eaux souterraines, l’eau des puits et sources ont été documentés pour contenir en ce qui concerne les niveaux d’arsenic14. Par exemple, à Verde Valley, AZ, Montezuma Well contient 210 µg/L de l’arsenic15. Eaux souterraines autour du fleuve Verde, AZ contient 16 µg/L d’arsenic en moyenne, avec des valeurs maximales atteignant 1,3 mg/L15,16. Notamment, des concentrations d’arsenic dans plusieurs puits dans le hangar de l’eau de rivière-vert dépassent 50 µg/L15,16. Avec cette connaissance, les concentrations d’arsenic ont été sélectionnés qui vont en bas de la MCL à 0,1 µM (7,5 ppm), pour au-dessus de la MCL à 10 µM (750 ppb) dans le courant étudier14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Les informations recueillies par ces expériences servira comme un indicateur précoce des changements potentiels pour les taux de migration cellulaire dans in vivo blessure contaminé par l’arsenic. Par la suite, peuvent être sélectionnés les molécules de signalisation basé sur leur rôle en facilitant la cicatrisation et la migration cellulaire, et future polymérase quantitative PCR (qPCR) basé gene expression expériences peuvent être mis en place à la fin de l’actuelle études. Si les taux de migration dans ce test changent en présence de l’arsenic, spécifiques de gènes cibles impliqués dans la migration cellulaire peuvent être la cible des effets délétères de l’arsenic et peuvent donc le mécanisme de la perturbation.
Protocol
1. Elaboration d’une enceinte de sécurité biologique II (BSC)
Remarque : Les méthodes décrites dans le présent protocole devraient être menées avec des équipements de protection individuelle, tout en utilisant les bonnes pratiques de laboratoire pour réaliser une technique aseptique.
- Lever le verre de protection BSC à hauteur d’utilisation et allumez les ventilateurs d’écoulement laminaire.
- Solution aqueuse d’isopropanol 70 % permet d’effectuer un effacement de l’assainissement de la zone de travail. Essuyez le BSC depuis le mur du fond et les parois latérales et travailler vers le bas pour la plaque de base.
- Essuyez tous les matériaux qui seront utilisés dans le test avec 70 % d’alcool (alcool isopropylique ou EtOH) et placez-les à l’intérieur de la BSC.
2. humains fibroblastes dermiques semis dans une fiole de T75
- Obtenir des flacons avec la lignée cryoconservés désiré (néonatales fibroblastes dermiques humains [hDFn], à la concentration cellulaire de 500 000 cellules/flacon et au passage p3-p5).
- Placez une cuvette de cellules dans un bain à 37 ° C pour permettre le dégel 1.0 cm-profondeur. Décongeler le flacon jusqu'à ce qu’environ 70 % de solution cellulaire est liquide. Essuyer la fiole avec de l’alcool 70 % et placer le flacon dans support de flacon à l’intérieur de la BSC.
NOTE : S’assurer que l’eau ne vient pas en contact avec des fils ou le bouchon du flacon pour éviter la contamination potentielle au cours de la cellule ensemencement. Éviter la décongélation complète des cellules dans l’eau de bain comme si vous faire peut entraîner la mort cellulaire accidentelle.
- Placez une cuvette de cellules dans un bain à 37 ° C pour permettre le dégel 1.0 cm-profondeur. Décongeler le flacon jusqu'à ce qu’environ 70 % de solution cellulaire est liquide. Essuyer la fiole avec de l’alcool 70 % et placer le flacon dans support de flacon à l’intérieur de la BSC.
- Tirez 10 mL de milieux supplémentés avec 10 % de sérum fœtal (SVF). Utiliser une pipette automatique et la pointe de pipette de 10 mL pour aspirer T75 flacon de culture de tissus. Permettre aux médias saturer complètement la base de la fiole en poussant doucement le ballon en arrière.
- Flacon ouvert avec solution stock et aspirer de cellule à partir du flacon, en tenant compte de la vitesse de pipetage, comme les membranes cellulaires seront vulnérable de cryoconservation.
- Cellules de transfert dans une fiole de tissu T75 avec les médias. Éjecter cellule décongelé dans ballon de tissu, à nouveau en tenant compte de la vitesse de pipetage.
NOTE : Ensemencement de densité des cellules en fiole de tissu est approchée pour être 6 600 cellules/cm2. Densité de semis peuvent être modifié pour tenir compte de l’utilisateur et le temps souhaité de l’expérimentation. - Prélever 1 mL de médias de fiole de tissu T75 et transfert de volume dans le flacon. Transfert de volume du flacon dans la fiole T75.
Remarque : Cette étape permet de maximiser le rendement de la cellule à partir du flacon. - Serrer le bouchon de flacon de culture de tissus et balancer doucement pour disperser uniformément les cellules en suspension sur toute la surface. Vous recherchez une distribution uniforme des cellules à l’aide d’un microscope inversé.
- Fiole d’étiquette avec cellules type, date, initiales, lignée et le but (p. ex., hDFn, 11/07/2018, NDC, Passage 4, Arsenic Scratch Assay). Place flacon de culture de tissus dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5,0 % de CO2 pendant 72 h.
Remarque : Milieu de croissance devrait être changé 12 à 24 heures après l’ensemencement initial pour enlever les traces de diméthylsulfoxyde (DMSO) cryoconservation et ensuite changé toutes les 48 h après cela pour s’assurer que les cellules sont correctement nourris. La période d’incubation et de la croissance dépendra le nombre de cellules nécessaires pour le dosage de gratter. Le temps de doublement des cellules hDFn est généralement de 16 à 24 heures dans des conditions normales. Cependant, doublement taux peut varier en élévation, pH, température, humidité, type de média, etc.et doit être pris en compte lors de la planification des expériences.
3. comptage de cellules et de sous-culture dans les tissus de 12 puits Culture plaque
- Récupérer la fiole de vitroplants T75 d’incubateur. Observer des cellules adhérentes à l’aide d’un microscope inversé à objectifs grossissement de 10 X (grossissement total de 100 X) et déterminer la confluence cellulaire approximative.
- Analyse la majorité de la fiole de vitroplants lorsque observant confluence pour assurer le pourcentage plus représentatif est approximée. Évaluer la morphologie des cellules individuelles pour toute anomalie ou contamination bactérienne ou fongique.
- Assembler la pipette automatique avec une pointe de pipette 10 mL. Pipette permet d’aspirer tout le volume du média par la solution T75 et le transfert à un conteneur à déchets. Empêcher l’embout de la pipette de toucher la surface des cellules adhérentes. Jeter l’embout de la pipette dans un bac de biohazard.
- Assembler la pipette automatique avec une pointe de pipette de 5 mL. Aspirer 5 mL de la solution saline équilibrée, verser dans la fiole et balancer doucement le flacon pour rincer l’excès médiatique, les cellules mortes et produit des déchets.
- Tirer le volume de la T75 et verser dans le récipient à déchets. Jeter l’embout de la pipette dans le bac de biohazard.
- Assembler la pipette automatique avec un adaptateur de pipette de 5 mL. Aspirer 2 mL de trypsine du stock, verser dans la fiole et balancer doucement le flacon pour disperser l’enzyme dans les cellules adhérentes. Assurer la saturation complète de la surface d’adhérence. Placer le ballon de tissu dans l’incubateur pendant 2-3 minutes (min).
Remarque : La réaction de l’enzyme / substrate maximale ne doit pas dépasser 10 min. - Observer la fiole de tissu sous un microscope inversé à un grossissement de porte-objectif 10 X (grossissement total de X 100). Appliquer les douces vibrations afin de faciliter le détachement de la cellule.
- Essuyer la fiole T75 avec 70 % d’alcool et de la place à l’intérieur de la BSC.
- Assembler la pipette automatique avec une pointe de pipette de 5 mL. Aspirer 5 mL de médias du stock et ajouter dans le ballon de tissu T75 pour arrêter la réaction enzyme / substrate. Le rapport de médias : trypsine doit être de 3:1. Pipette de haut en bas de la base de la fiole 2 ou 3 fois pour rincer et faire en sorte que la réaction est arrêté. Aspirer le volume complet du liquide de la fiole et transvaser dans un tube conique stérile de 15 mL.
- Remplir un deuxième tube conique de 15 mL avec un volume identique de médias.
- Placer les deux tubes coniques 15 mL dans une position aux antipodes les uns. S’applique à 200 g de la force centrifuge pendant 5 min à 25° C en définissant des paramètres de fonctionnement de l’équipement.
- Essuyer le tube conique de 15 mL avec cellules granulés contenant 70 % d’alcool et le placer à l’intérieur de la BSC.
- Utilisez la pipette automatique avec un attachement de 5 mL à la pipette hors médias, laissant derrière eux quelque 250 µL d’extrait concentré liquide et de cellules. Faites attention à l’emplacement de l’embout de la pipette, car le culot cellulaire doit rester immobile. Doser le volume recueilli dans un conteneur à déchets et jeter le bout dans un bac de biohazard.
- Un support de tubes de microcentrifuge permet d’exécuter la partie inférieure du tube conique à travers les fentes de flacon, créant une vibration rapide, pour perturber et remettre en suspension le culot cellulaire (parfois appelé « ratisser des grilles »).
Remarque : Évitez d’utiliser un mélangeur vortex pour effectuer cette étape. Les forces de gravité créées par mélangeurs vortex dépassent les seuils de cellule g-force et peuvent provoquer la lyse. Une fois rempli correctement, la nouvelle solution de cellule apparaîtra comme un mélange nuageux avec aucune granule restant. Diligence raisonnable cette étape créera souvent une suspension monocellulaire, conduisant à une plus grande précision lors du comptage des cellules. - Ajouter 2 mL de médias à la remise en suspension ou des souches de cellules. Pipette les cellules doucement vers le bas de la paroi du tube 20 fois pour briser les mottes. Noter le volume de suspension cellulaire totale et mettre de côté brièvement.
- Pipeter 20 µL de stock bleu Trypan (0,4 %) dans un puits d’une plaque 96 puits à l’aide d’une pipette stérile de vide.
- Mélanger la solution stock cellulaire pour générer une suspension cellulaire uniforme avant le transfert. Utiliser un embout de la pipette stérile pour enlever 20 µL du stock de cellule (en évitant le contact avec les parois du tube). Ajouter à la 20 µL de solution de bleu de Trypan dans la plaque à 96 puits.
- Pipette doucement pour mélanger le contenu. Déposer 10 µL du mélange entre la lamelle et le dépouillement de chambre sur le hémocytomètre.
- Observer les cellules et la grille sous un objectif 10 X. Observer les neuf grandes places dans le champ de vision. Compter les cellules que dans le centre et 4 places d’angle (5 places au total).
Remarque : Recherchez une distribution uniforme des cellules à travers l’ensemble du réseau afin d’assurer un décompte précis. - Toutes les cellules (transparents et bleus) sur les 5 places identifiées de la grille de pointage. Séparément, tally uniquement les cellules non viables (bleus) dans les mêmes 5 carrés.
- Calculer à l’aide de la numération de cellules viables :
où x = nombre de cellules viables, un = cellules totales, b = cellules non viables - Calculer la densité de cellules viables à l’aide :
où x = densité des cellules viables et y = la somme totale des cellules viables. - Calculer le totales cellules viables :
où x = totales cellules viables, y = densité des cellules viables, f = volume de suspension cellulaire (mL). - Calculer la viabilité cellulaire % :
où x = la viabilité des cellules pour cent, y = cellules viables dénombrées sur grille, f = cellules totales comptées sur la grille.
- Tracer une ligne horizontale traversant la partie inférieure de la plaque de 12 puits pour servir de repères en imagerie.
- La densité de cellules viables (calculée en 3.3.7) permet de calculer le volume des médias afin de diluer le stock cellulaire pour les semis d’une plaque de culture de tissu de 12 puits.
Remarque : La cellule optimale semis à densité de cellules hDFn est 5 000 cellules/cm2. - Diluer le stock de cellules à 19 000 cellules/mL à l’aide des médias et chaque cupule avec 1 mL de stock de cellules des graines. Mélanger le stock de cellules périodiquement pour assurer la même cellule ensemencement à travers tous les 12 puits.
- Étiquetez chaque assiette avec le type de cellule, la lignée, les initiales de l’utilisateur et le but. Placer les plaques dans l’incubateur fixé à 37 ° C et 5,0 % de CO2. Permettre aux cellules de croître jusqu'à atteindre 100 % confluence pour dosage zéro.
- La densité de cellules viables (calculée en 3.3.7) permet de calculer le volume des médias afin de diluer le stock cellulaire pour les semis d’une plaque de culture de tissu de 12 puits.
4. l’arsenic (As) Solutions mères et calculs
- Diluer l’Arsénite de sodium (NaAsO2) directement dans les milieux de culture cellulaire avec 10 % FBS à des concentrations de 10, 1.0, 0,1 et 0,01 µM comme travail.
- Pour cela, faire un stock initial de 1 mM comme solution de dilution 3,9 mg d’Arsénite de sodium dans 30 mL de médias. En série, diluer le stock de 1 mM pour les autres solutions.
| 1000 µM en Stock Calculs | Arsenic Concentrations Stock de travail | M1V1= M2V2 | Volume de la Solution précédente de l’Arsenic | Volume des médias | Volume total d’Arsenic, Stock de travail |
| Poids moléculaire de NaAsO2 : 129,9 g/mol | 10 µM comme | (x mL) (1 000 µM) = ()(10 µM) 30 mL x = 0,3 mL | 0,3 mL = 300 µL de 1mM comme solution | médias de 29,7 mL | 30 |
| .03 L x.001 mol/L x 130 g/mol = 3,9 mg d’Arsenic | 1,0 µM comme | (x mL) (10 µM) = ()(1 µM) 30 mL x = 3 mL | 3 mL de 10 µM comme solution | 27 mL de médias | 30 |
| Diluer 3,9 mg d’Arsénite de sodium dans 30 mL de milieu | 0,1 µM comme | (x mL) (1 µM) = ()(0.1 µM) 30 mL x = 3 mL | 3 mL de 1µm comme | 27 mL de médias | 30 |
| 0,01 µM comme | (x mL) (0,1 µM) = ()(0.01 µM) 30 mL x = 3 mL | 3 mL de 0,1 µM comme | 27 mL de médias | 30 |
Tableau 1. Stocks de l’arsenic et les dilutions en série. Ce tableau explique les calculs utilisés pour créer les solutions mères As et solutions courantes pour groupes de travail.
5. si vous grattez la Technique de dosage et de la contamination par l’Arsenic
- Obtenir une plaque de 12 puits avec des cellules de l’incubateur. Découvre des cellules à un 10 X grossissement objectif (grossissement total de X 100). Déterminer le confluent de la cellule au sein de chaque puits.
Remarque : Chaque puits individuels doivent atteindre 100 % confluence avant de gratter. Cette étape critique assure la cohérence dans l’analyse et permet d’uniformiser les dosage à travers des expériences. Si aucun puits n’ont pas atteint 100 % confluence, laisser incuber pendant un délai supplémentaire jusqu'à ce que tous les puits ont atteint 100 % confluence des cellules. Ne souffrira pas temps de croissance supplémentaire dans les puits qui ont déjà atteint le confluent de 100 %. Confluentes généralement deviendra la croissance arrêtée et restent comme une culture monocouche, tout en permettant aux puits Sub confluentes atteindre 100 % confluence. - Assembler un pipetteur automatique avec une pointe de pipette 10 mL. Aspirer les milieux de croissance hors de tous les puits. Disposer le volume de déchets liquides et l’embout de la pipette dans le bac de risques biologiques.
- Assembler une multipipette p200 avec une pointe stérile de 1-200 µL. Dans chaque puits, produire une égratignure « blessure simulée » en glissant la pointe sur la surface des cellules à un 12-heures à 6 heures-Emplacement.
Remarque : Les trois facteurs qui affecteront grandement la cohérence sont vitesse, pression et l’angle de pointe. Le zéro doit être effectué rapidement, avec une pression constante, tout en étant conscient de l’angle de pointe rester perpendiculaire à la base de la plaque. Se gratter trop lentement entraînera lignes bleues en surpression peut définitivement marquer les surfaces adhérentes de cellules et un angle de pointe inférieure à 90° réduira la largeur de la rayure. Une de ces erreurs courantes peuvent entraîner les taux de migration altérée et les modèles. - Nettoient les amas de débris et cellule excédentaires en rinçant avec 1 mL d’une solution saline équilibrée par puits. Roche la plaque à côté pour faciliter le lavage. Enlever la solution saline équilibrée de puits et jeter dans un conteneur à déchets. Jeter la pipette 5 mL dans le bac de risques biologiques.
- Assembler une multipipette p200 avec une pointe stérile de 1-200 µL. Dans chaque puits, produire une égratignure « blessure simulée » en glissant la pointe sur la surface des cellules à un 12-heures à 6 heures-Emplacement.
Figure 1 : représentation schématique de l’essai gratter. Tout le travail est effectué dans un champ aseptique pour diminuer les risques de contamination. Cellules sont ensemencées à la densité voulue dans des flacons de culture de tissus et cultivés dans un incubateur, la valeur des conditions physiologiques humaines (5 % de CO2, 37 ° C). En arrivant à un confluent désiré, cellules sont cultivées aseptiquement Sub en plaques de culture de tissu de 12 puits à une densité de semis désirée. Cellules sont cultivées à la confluence de 100 % dans chaque puits de la plaque de 12 puits et rayé à l’aide d’un embout stérile. Cette « scratch » crée une in vitro simulacre plaie (dénotée par la double flèche vers la tête), dans lequel les cellules migrent naturellement pour fermer l’aire ouverte. Chaque bien peut être particulièrement bien conditionné et les taux de migration cellulaire peuvent être observées et quantifiées en réponse à des conditions différentes de traitement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Utiliser une pipette à p1000 avec une pointe de 1 000 µL à distribuer 1 000 µL provenant des stocks d’arsenic dans les puits qui ont été assignés au hasard à un groupe de traitement. Utiliser un nouvel embout de la pipette pour chaque puits pour éviter toute contamination croisée. Enregistrer l’heure où les traitements sont ajoutés. Placez les plaques de 12 puits dans un incubateur à 37 ° C et 5,0 % de CO2.
6. l’imagerie
- Capturer des images de chaque puits à 10 X grossissement objectif toutes les 4 h sur une période de 24h (0, 4, 8, 12, 16, 20 et 24 h). Faire référence à la ligne tracée précédemment sur la partie inférieure de la plaque d’image au même endroit le long de la rayure au sein de chaque puits aux périodes ultérieures.
Remarque : Il est impératif que les mêmes endroits sont photographiés à chaque point dans le temps permettant l’analyse des images précises et d’obtenir des données représentatives.
7. image Analysis
- Télécharger des images capturées sur le microscope inversé léger à un ordinateur et l’enregistrer sous forme d’image JPEG avec un nom de fichier détaillé.
- Ouvrez ImageJ.
- Télécharger l’image d’un micromètre avec distances connues sur le logiciel pour convertir pixel en millimètres (mm) lors de la prise de mesures de l’image en faisant glisser le fichier dans la fenêtre du logiciel.
Remarque : Le micromètre devrait avoir des lignes délimitant une longueur connue de 1 mm et l’image doit être prise au même grossissement utilisé pour capturer des images de cellules. Par exemple, dans cette étude des images ont été prises à 100 X de grossissement total, donc l’image du micromètre a été amenée à 100 X de grossissement total.- Cliquez sur les options de droite, sectorielleou Des lignes à main levée .
- Tracer une ligne de distance connue sur l’image du micromètre en utilisant les graduations d’une longueur associée à chaque tick marks. Dessiner une ligne droite : cliquez sur la souris, maintenez, faites glisser le curseur à l’emplacement souhaité, puis relâchez la souris.
- Sélectionnez analyser puis sélectionnez Échelle à définir.
- La valeur Distance connue la longueur connue de la ligne tracée à l’étape précédente.
- A unité de longueur en mm.
- Cochez la case globale.
- Cliquez sur OK pour quitter le menu.
- Conclusion de l’image de micromètre de scène.
- Uploader une image de dosage zéro dans ImageJ par glisser-déposer fichier d’image dans la fenêtre.
- Dessiner une ligne droite sur toute la largeur de la rayure (du bord gauche au bord droit).
- Appuyez sur la lettre M sur le clavier pour enregistrer la mesure de la ligne droite tracée. Une petite fenêtre de résultats s’affiche immédiatement après avoir tapé la lettre M. C’est où sera la mesure de la largeur.
- Répétez l’étape 7.4 un total de 10 fois pour obtenir 10 mesures le long de la rayure.
Remarque : Il est important de générer les valeurs de largeur plus représentative sur toute la longueur de la rayure. Veillez à espacer les mesures de 10 largeur également le long de la rayure de haut en bas. - Créez un fichier de feuille de calcul de dosage zéro pour copier et coller les mesures.
- Copiez et collez les mesures 10 largeur de la fenêtre de résultats dans la colonne appropriée dans un fichier de feuille de calcul (tableau 2).
Remarque : Lorsque les mesures sont copiés à partir de la fenêtre de résultats et collés dans la feuille de calcul, il y aura des colonnes superflues des valeurs ; ces valeurs devraient être supprimés, conservant seulement les mesures de 10 largeur.
- Copiez et collez les mesures 10 largeur de la fenêtre de résultats dans la colonne appropriée dans un fichier de feuille de calcul (tableau 2).
| 10 mesures de largeur au hasard | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24h |
| 1 | |||||||
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | |||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | |||||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
| 10 | |||||||
| Moyenne de 10 mesures |
Le tableau 2. Mesures de largeur brute tableau format. Ce tableau montre la structure organisationnelle pour les mesures brutes obtenues.
- Répéter l’étape ci-dessus pour le reste des images dosage zéro.
- Calculer la moyenne des 10 mesures à chaque instant (0-24 h) pour chaque cupule.
- Déterminer le % de fermeture des calculs en utilisant les valeurs de l’étape 7,8.
- Créer une table en bas de la feuille de calcul intitulée « largeur mesure moyennes » (tableau 3).
- Copiez et collez en que la ligne Moyenne de 10 mesures calculée étape 7,8 dans le tableau « mesure de la largeur en moyenne ».
- Créer une autre table à côté de la table Largeur mesure moyennes . Titre de ce tableau Fermeture de plaie pour cent (tableau 4).
Remarque : La valeur dans la colonne 0 h pour chaque puits doit être 0 parce que le scratch est de 0 % à la photo initiale h 0 pour tous les puits. - Accédez à la colonne suivante au-dessus (4 h).
- Calculer la pourcentage fermeture pour 4, 8, 12, 16, 20 et points de temps de 24h :
où, x = pourcentage fermeture, j’ai = largeur initiale de gratter (largeur 0 h), f = finale scratch largeur (4, 8, 12, 16, 20 ou 24 h).
| Moyenne de la largeur du puits | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24h |
| 1 a | |||||||
| 2 a | |||||||
| 3 a | |||||||
| 4 a | |||||||
| 1 b | |||||||
| 2 b | |||||||
| 3 b | |||||||
| 4 b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3C | |||||||
| 4C |
Tableau 3. Mesure de la largeur moyenne de format de tableau. Ce tableau montre la structure organisationnelle pour les moyennes de mesure largeur calculée d’après les mesures de largeur brute dans le tableau 2.
| Eh bien | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24h |
| 1 a | 0 | ||||||
| 2 a | 0 | ||||||
| 3 a | 0 | ||||||
| 4 a | 0 | ||||||
| 1 b | 0 | ||||||
| 2 b | 0 | ||||||
| 3 b | 0 | ||||||
| 4 b | 0 | ||||||
| 1c | 0 | ||||||
| 2c | 0 | ||||||
| 3C | 0 | ||||||
| 4C | 0 |
Tableau 4. Pour cent plaies format de table de fermeture. Ce tableau montre la structure organisationnelle pour les valeurs de fermeture de plaie pourcentage calculé à l’aide de la mesure de la largeur moyenne au tableau 3.
- Créer une autre table à côté de la table Fermeture de plaie pour cent . Titre de ce tableau AUC (tableau 5).
- Calculer le 0-4 h zone inférieur à la valeur de la courbe (AUC) dans le 0-4 h colonne pour chaque puits :
où x = 0-4 h valeur AUC, a = % valeur de fermeture pour 0 h, b = % valeur de fermeture pendant 4 h, h = le temps entre les deux mesures (4 h dans cette étude). - Calculer l’aire de 4 à 8 heures inférieur à la valeur de la courbe (AUC) dans la colonne de 4 à 8 heures pour chaque puits :
Où x = 4-8 h AUC value, un = % valeur de fermeture pendant 4 h, b = % valeur de fermeture pendant 8 h, h = le temps entre les deux mesures (4 h dans cette étude).
NOTE : Une valeur AUC doit être calculée pour chaque intervalle de temps de 4 h sur la période de 24 heures pour chaque puits. - Somme de toutes les valeurs de l’AUC 0-24 h (calculé en étapes 7.10.1-7.10.2) pour obtenir une valeur totale de AUC pour chaque puits. S’assurer que ces valeurs sont correctement enregistrées pour l’analyse statistique.
- Calculer le 0-4 h zone inférieur à la valeur de la courbe (AUC) dans le 0-4 h colonne pour chaque puits :
| Eh bien | 0-4 h | 4-8 h | 8-12 h | 12-16 h | 16-20 h | 20-24 h | AUC somme |
| 1 a | |||||||
| 2 a | |||||||
| 3 a | |||||||
| 4 a | |||||||
| 1 b | |||||||
| 2 b | |||||||
| 3 b | |||||||
| 4 b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3C | |||||||
| 4C |
Tableau 5. Format de table des AUC. Ce tableau montre la structure organisationnelle pour les valeurs de l’AUC calculés en utilisant le pourcentage enroulé valeurs de fermeture dans le tableau 4.
8. analyse statistique
- Déterminer la méthode d’analyse statistique qui correspond le mieux aux somme AUC valeurs obtenues au cours de l’essai et expérimental.
Representative Results
Taille des échantillons (n) pour tous les groupes de traitement a été n = 28. Les cellules sont cultivées avec succès suivant les techniques aseptiques et les protocoles de laboratoire (Figure 1). Rayures uniformes ont été observées dans tous les groupes de traitement avec la largeur de rayure moyenne mesurant mm 0,8 0,4 mm (Figure 2). Groupes témoins avaient une superficie moyenne de somme inférieur à la valeur de la courbe de 1,355.83 ; 0,01 µM que groupes traités avaient une moyenne a résumé les superficies de la valeur de la courbe de 1,366.21 ; 0,1 µM que groupes traités avait une moyenne a résumé zone inférieur à la valeur de la courbe de 1,326.24, 1,0 µM dans le groupe de traitement a eu une moyenne a résumé les superficies de la valeur de la courbe de 1,295.10 ; et enfin les 10 µM comme groupe de traitement était une superficie cumulée moyenne inférieur à la valeur de courbe de 535.12, qui était statistiquement plus faible par rapport à tous les autres groupes (p < 0,05) (Figure 3). R-programme pour l’analyse statistique a été utilisé pour exécuter une ANOVA à un ajustement de post hoc Tukey pour déterminer les différences statistiques entre les groupes de traitement (p < 0,05).
Figure 2 : images de dosage zéro représentant sur une période de 20 h. Images A à D représentent la migration cellulaire des cellules de contrôle ; images E-H représentent la migration cellulaire des cellules contaminées par 1,0 µM images I-L représentent la migration cellulaire des cellules contaminées avec 10 µM comme. Parmi ces images, il est clair que la migration cellulaire est ralentie en présence de l’arsenic. Les images de contrôle montrent une égratignure totalement « guéri » après 20 h, alors que les deux autres groupes comme traitement n’étaient pas « guéries ». Les 10 µM comme traitement inhibe la fermeture complète au total après 24 h. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Arsenic ralentit la migration cellulaire dans le dosage zéro. Des images ont été capturés pendant une période de 24 h pour observer les changements de taux de migration cellulaire en présence de diverses concentrations d’arsenic. Les images brutes ont été analysées à l’aide d’un logiciel automatisé (par exemple, dans MATLAB), quelle largeur de plaie initialement mesurée, puis calculé fermeture pour cent et, enfin, aire sous la courbe (AUC). Barres d’erreur représentent erreur type de la moyenne. Les 10 µM en tant que groupe de traitement ralenti statistiquement la migration cellulaire des fibroblastes dermiques humains néonatales (hDFn), indiqué par une valeur AUC statistiquement plus faible, par rapport à tous les autres groupes de traitement à l’aide d’une ANOVA à avec un ajustement de post hoc Tukey (p) < 0,05). Des différences statistiques sont représentés par les lettres « A » et « B », qui ont été obtenus grâce à l’utilisation de la méthode d’affichage de lettre Compact disponible en R-programme. Les traitements qui ne partagent pas une lettre commune sont statistiquement significatives de l’autre (p < 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Application de ce test fournit une évaluation de haut débit et en temps opportun de la migration cellulaire et peut traduire directement à des systèmes physiologiques complexes5,6,7. Pour cette raison, le modèle de paillasse proposé a été à l’écoute et pratiqué pour évaluer les effets de divers agents thérapeutiques et les toxines environnementales sur6de cicatrisation. Les concentrations d’arsenic utilisé dans la présente étude sont jugées pertinentes pour l’environnement par le biais de recherche documentaire approfondie des niveaux d’exposition connus et d’une étude rétrospective des différentes données bases14,15, 16,17,18,19,20,21. Utilisation de ce dosage zéro in vitro ont démontré que l’exposition à une concentration d’arsenic dans le haut, mais pertinente de l’environnement, retard de fermeture de la plaie (migration cellulaire).
Ce modèle de dessus de banc était également employé pour isoler et étudier une lignée de cellules individuelles (fibroblastes) pour mieux comprendre comment la migration des fibroblastes contribue pour blesser les résultats de guérison. En outre, il est difficile d’étudier les fonctions d’une lignée de cellules individuelles dans des systèmes complexes in vivo avec beaucoup d’autres cellules et tissus présents qui peuvent interférer avec l’analyse. En outre, l’analyse fournit un moyen d’atteindre les données de fermeture de plaie pourcentage semi-quantitative qui peuvent être utilisées pour cibler les mécanismes cellulaires spécifiques par lesquels composés peuvent influer sur la cicatrisation des plaies. Par exemple, les cellules utilisées dans l’essai de gratter soient collectées et stockées dans un réactif désiré et utilisés dans l’expression des gènes (ADN messagère de signal) ou expression de la protéine dosages22. Cette information peut être utile à l’enquêteur s’ils cherchent à comprendre ce que des signaux ou des protéines peuvent largement contribuer à l’évolution de la migration cellulaire en présence de divers traitements (c.-à-d. l’arsenic)22.
Les fibroblastes humains par voie cutanée néonatales ont été sélectionnés pour ce travail basé sur leur rôle de premier plan dans la cicatrisation des plaies. Toutefois, ce protocole de dosage zéro a été implémenté à l’aide de divers types de cellules et pour une gamme des fins de recherche. Par exemple, le dosage zéro a été adopté dans le domaine de l’oncologie pour étudier l’inhibition de la migration des médicaments de chimiothérapie23; pour la migration des cellules musculaires squelettiques, la prolifération et la diffusion24; pour étudier l’effet des extraits de plantes sur la migration cellulaire25; et de comprendre comment la prolifération et la migration des kératinocytes contribuent pour blesser la guérison9. En outre, un précédent document de Pinto et coll. a évalué les effets de l’uranium (U) et le plasma riche en plaquettes (PRP) sur hDFn migration en utilisant le dosage zéro6. Le but de ce travail était de comprendre l’étendue à laquelle ce test pourrait tester l’effet d’un agent censé ralentir la migration cellulaire (U), mais aussi un agent censé accélérer la migration cellulaire (PRP). Comme on le voit dans les travaux susmentionné et recherche par d’autres chercheurs, application du dosage zéro a un potentiel élevé pour une utilisation dans différents modèles expérimentaux26. Malgré les détails fournis dans les méthodes, variance devrait avoir entre les enquêteurs et les expériences. Par exemple, les taux de migration cellulaire fluctuera probablement basée sur la lignée cellulaire utilisée, outre les micronutriments nécessaires requises pour les types de cellule unique. Plusieurs observations importantes pour aider à la viabilité et le rendement de la cellule sont répertoriés comme des NOTEs tout au long de ce protocole. Toutefois, il est fortement recommandé que les enquêteurs suivent des recommandations du fabricant pour les conditions optimales de croissance et d’utiliser cette méthode comme instruction supplémentaire pour les travaux de culture cellulaire générale.
Bien que le dosage zéro est extrêmement versatile pour l’étude de l’activité cellulaire ; préjugés imprévues peuvent survenir dans les techniques de mesure. Par exemple, lorsque vous utilisez ImageJ pour tracer manuellement des fronts de migration cellulaire, variation pouvant exister entre les utilisateurs, ce qui peuvent limiter l’exactitude et la collecte de données représentatives. Il convient également de noter que les fronts de migration doivent être lues en aveugle au traitement pour minimiser les biais de l’utilisateur. En outre, identifier manuellement les fronts de migration peut entraîner une erreur de calcul de la distance moyenne parcourue en raison de la formation de pseudopodes de cellules et de leur capacité à atteindre les adhérences focales forme, qui peuvent être trompeurs visuellement. De la même manière, l’utilisation de fluorescent « traqueur de la cellule » colorants sur la surface des cellules, ou le protéines nucléaires pour détecter la migration peuvent fixer involontairement cellules ce qui entraîne quelques imprécisions lors de la mesure de la migration cellulaire au fil du temps. Il est recommandé que des contrôles appropriés positifs et/ou négatifs inscrits au sein de l’expérience pour évaluer complètement l’effet du traitement sur les lignées cellulaires. Pratique de ce test doit être rempli en reconnaissance de ses limites. Ce test ne garantit pas que les résultats de la migration cellulaire de l’expérimentation in vitro seront traduira directement des résultats in vivo . Plaie des migrations cellulaires et guérison dans un système vivant complexe implique une multitude de types de cellules et les signaux moléculaires ; chacun d'entre eux a la possibilité d’influencer les réponses de guérison.
En résumé, le scratch test s’est avéré fournissent criblage à haut débit de migration cellulaire en réponse à l’évolution des environnements6,25. Plus précisément, nous avons utilisé ce protocole pour détecter avec succès les changements dans la migration cellulaire suite à l’exposition à l’arsenic à diverses doses écologiquement pertinents. Ces données ont fourni de justification pour utiliser le dosage zéro pour une étude plus et d’évaluer les voies mécanistes de la migration cellulaire dans ce test et comment ces voies sont altérées par l’exposition à l’arsenic.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Recherche rapporté dans cette publication a été financée par l’Institut National sur la santé de minorité et les disparités de santé de la National Institutes of Health, sous attribution numéro U54MD012388. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
| Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
| Water Bath | Precision | Model 182 | |
| Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
| CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
| Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
| Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
| Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
| p200 Pipette | Gilson | ||
| p20 Pipette | Gilson | ||
| Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
| T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
| 15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
| 50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
| 5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Tissue Marker | Securline | 92167 | |
| Wipes | Kintech | 34155 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
| Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
| Bleach | Great Value | 220-04 | |
| 96-well | Falcon | 353915 | |
| Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
| Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
| Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
| 12-well plate | Corning | 3598 | |
| Waste Beaker | n/a | n/a | |
| 1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
| Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
| Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
| Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
| Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |
References
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