Summary
מחקר זה מתמקד מודל במבחנה של הפצע הריפוי (גירוד assay) בתור מנגנון לקביעת מזהמים סביבתיים איך כגון ארסן השפעה הסלולר ההעברה. התוצאות מדגימים כי assay חוץ גופית בתוך זה מספק אינדיקציות מהיר ולא מוקדם של שינויים ההעברה הסלולר לפני ניסויים ויוו .
Abstract
הבנת המנגנונים הפיזיולוגיות של ריפוי הפצע היה המוקד של מחקר שוטף במשך שנים רבות. מחקר זה מיתרגם ישירות על שינויים קליניים סטנדרטים משמשת לטיפול פצעי הפחתת התחלואה והתמותה בחולים. ריפוי הפצע הוא תהליך מורכב שדורש אינטראקציה אסטרטגית תאים ורקמות, הפונקציה. אחת מהפונקציות חשובה ביותר רבים של ריפוי הפצע היא העברה הסלולר אישיים וקיבוציים. על פגיעה, תאים שונים מהדם, סביב רקמות חיבור ואפיתל במהירות העברת האתר הפצע באמצעות גירויים כימיים ו/או גופניים. תגובה זו ההעברה יכולה להכתיב במידה רבה את התוצאות ואת ההצלחה של פצע ריפוי. להבנת תפקוד התאים הספציפי הזה חשוב translational רפואה זה יכול להוביל ריפוי תוצאות משופרות הפצע. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול המשמש כדי להבין טוב יותר את ההעברה הסלולר כפי שהוא נוגע ריפוי הפצע, איך שינויים בסביבת הסלולר יכול לשנות באופן משמעותי את התהליך הזה. במחקר זה דוגמה, עורי fibroblasts גדלו בתקשורת עם סרום שור עוברית (FBS) כמו טפט תרבויות מבחנות תרביות רקמה. התאים היו גילוח ורחיצה כירורגית הועבר תרביות רקמה יחס טוב 12 לוחות, גדל הנהרות 100%. כשמגיעים הנהרות, התאים טפט היו שרוט אנכית באמצעות טיפ pipet p200. ארסן מדולל בתקשורת תרבות בתוספת FBS נוספה בארות בודדים-לסביבה מינונים רלוונטי החל מ 0.1-10 תמונות נלכדו כל 4 שעות (ח) במשך 24 שעות ביממה באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך להתבונן ההעברה הסלולר (פצע סגירת מעגל). תמונות בנפרד נותחו באמצעות תוכנת ניתוח התמונה, אחוז פצע הסגר חושבה. תוצאות מדגימים כי זרניך מאט ריפוי הפצע. טכניקה זו מספקת מסך הראשון מהיר וזול עבור הערכת ההשפעות של מזהמים על ריפוי הפצע.
Introduction
ריפוי הפצע כוללת סדרה מורכבת של חופפים צעדים המערבות שונים סוגי תאים מולקולות איתות, מטריצה חוץ-תאית רכיבים1. יחד, רכיבים אלה לעבוד ביחד כדי להשיג רזולוציה הפצע או תיקון, מה שמוביל בסופו של דבר היווצרות צלקת שהותירה מגן תלוי בדרגת טראומה1. כדי ללכוד את התהליכים הנפרדים והפונקציות של הפצע ריפוי בניסוי אחד קשה; צעדים בודדים בתוך תהליך ריפוי הפצע שצריך להיות מזוהה, נבדק בנפרד. בין הצעדים רבים של ריפוי הפצע, התהליך של העברה הסלולר נחשב קריטית בעת הערכת שיעורי הריפוי2. ההעברה הסלולר יכול להיות שנצפו בכל השלבים של ריפוי הפצע, ולכן מחייבת עוד יותר הבנה של מה שינויים ל נדידת תאים שיכולים להשפיע סגירת הפצע. לדוגמה, הגירה הסלולר הוא ראה שני בדלקת בשלב מוקדם ומאוחר, עם צבירת קרישת הדם, טסיות דם באתר הפצע3. אירועים אלה למנוע איבוד דם מוגברת על ידי יצירת סתימה זמנית למלא אזורים פצוע ללא רקמה3. טסיות הדם במחזור לסנתז, מפרישים מגשרים vasoactive יחד עם גורמים chemotactic, איזה אות יחד להעברת ליקוציט דלקתיות (כדוריות דם לבנות) אל הרקמה הפצועים עבור תיקון4. Epithelialization מחדש מתרחשת בתוך שעות של פגיעה ברקמות, והיא כוללת כיסוי הפצע האתר באמצעות פעילות של הגירה של אפיתל keratinocytes כדי למנוע זיהום או פלישה של חלקיקים זרים כדי לאתר הפצע2. דוגמאות אלה ללכוד רק מספר נדידת תאים רבים פונקציות המשויכות ריפוי פצעים.
גירוד וזמינותו תיאר ומשמשת להבין טוב יותר את נדידת תאים ותפקידים רבים שלה ב-5,6ריפוי הפצע. Assay הזה נחשב פשטני, מספק תפוקה גבוהה ומאפשר החוקר לאסוף נתוני הגירה תא נציג. העברת מבחני בהצלחה הראו כי תרכובות מסוימות עשוי להאיץ או להאט את הקצב של ההעברה הסלולר6. יתר על כן, תוצאות אלו וזמינותו מספקים מידע הפיזיולוגיות translational יכול לשמש על מנת לגבש יעד טיפולי, מינון ריכוזים, ואת הגנים של עניין לפני ניסויים ויוו . וזמינותו מחייבת טכניקות התרבות התא הבסיסי, אספקה, קו תא לפי בחירתך, ולבחור טכנולוגיית הדמיה כדי ללכוד תנועה לאורך זמן או תנועה בתגובה לטיפולים.
הבדיקה ניתן בקלות מניפולציות או ייחודיות הנתפרות בהתאם לצרכים של החוקר. עם זאת, ישנם ארבע שאלות בסיסיות שיש לקחת בחשבון לפני הניסויים. מה ות כלליות או ספציפיות הוא/הם investigator(s) מנסה לענות? זה דבר נכון גם לגבי רוב ההשערות מונע מחקר; עם זאת, חיוני assay הזה כי זה יקבע רבות של הפרמטרים הדרושים כדי במדויק וענה לחלוטין ות. מה תא קו או תא קווים (אם מרובים) יש להשתמש כדי לייצג את מערכת הפיזיולוגיות נחקר? לדוגמה, בעורית פצע לימוד ריפוי, עורי פיברובלסט5,6,7, תאי הגזע8, או תקין עוריות9 עשוי להיחשב לייצג את אוכלוסיית תאים הנמצאים בדרך כלל שפע רקמת העור10. לחלופין, נויטרופילים, מקרופאגים או תאים דלקתיים אחרים יוכל להעריך במערכת זו לייצג את נדידת תאים של רכיבים אחרים של ריפוי הפצע בתוך רקמת העור10. בנוסף, זיהוי קו תא ספציפי חישובו תסייע לזהות נוגדנים אילו הם אופטימליים כדי לקדם פעילות חילוף החומרים של התא. איך נדידת תאים יהיה במעקב/עם תמונה? ישנן מספר טכניקות המשמשות להתבונן נדידת תאים בתוך צלחת או את הבקבוק. לדוגמה, או fluorescently תיוג תאים וצביעת באמצעות קרינה פלואורסצנטית או הדמיה קונאפוקלית כדי לעקוב אחר תאים מספקת קונטרסט חזק, המאפשר את החוקר להגדיר בבירור הסלולר לעומת הלא-סלולר מיקומים של התנועה הסלולרית11 . טכניקה נפוצה אחרת, המתוארים במחקר זה, הוא השימוש של מיקרוסקופ אור הפוך עם שלב ניגודיות6,7. חלופה זו ועד תא צבעי זריחה מאפשר למשתמש לחיות עקוב אחר תאים מבלי לתקן סופני תאים לפני הדמיה ומאפשר גם עבור לכידת תמונות של אותו בארות בודדים המכיל monolayers הפצועים של תאים על-פני זמן נקודות. מה התוצאה מודדת ישמש לניתוח? באמצעות הדימויים התאספו במהלך המחקר, נתונים יכול להיווצר בו ניתן להבין שינויים תעריפי הסלולר ההעברה. במעבדה שלנו, מיקרוסקופיים התמונות שנתפסו על מיקרוסקופ אור הפוך מועלות לתוכנה ניתוח התמונה, סגירת הפצע אחוז של שטח מסוכם. מתחת העקומה (AUC) מחושבים.
אנחנו ידגיש את השימוש הזה assay התירי שינויים פיברובלסט עורי ההעברה בנוכחות מזהם סביבתי ידוע, ארסן ספציפי. ארסן הוא מתכות למחצה המתרחשים באופן טבעי נמצא בתוך קרום כדור הארץ. במקומות שונים נמצאו עם רמות גבוהות של ארסן, אשר מהווה סיכון לאנשים המתגוררים בסמוך מיקומים אלה. כתוצאה מכך, מקורות מזון ומים הוכחו יש רמות גבוהות של ארסן זיהום, אשר יגבירו את הסיכויים לאנשים להיות חשופים ארסן. חשיפה סביבתית ארסן הוכח להיות השלכות לטווח ארוך בריאות באוכלוסיות אנושיות מעל או אפילו מתחת את הנוכחי ארצות הברית סביבתי הגנת סוכנות (USEPA) מקס מזהם רמת (MCL) של 10 ppb (10 µg/L)12, 13. למרות USEPA הגדר MCL הזה, כאילו זה בטוח לשתייה גבולות, ריכוזים ארסן זה לחרוג ממגבלה זו אינן נדירות במקורות מים ברחבי העולם. במערב ארצות הברית, תהום, במי ו מעיינות רבים תועדו להכיל בנוגע ארסן14רמות. לדוגמה, בעמק ורדה, AZ, מונטזומה טוב מכיל 210 µg/L של ארסן15. מי תהום סביב נהר ורדה, AZ מכיל 16 µg/L ארסן בממוצע, עם השיא לערכים להגיע 1.3 mg/L15,16. ראוי לציין, ארסן ריכוזים ב בארות רבות במחסן ורדה נהר מים לחרוג µg/L 5015,16. עם הידע הזה, לסביבה הרלוונטיים ריכוזים ארסן היו נבחרים הטווח מתחת MCL-0.1 מיקרומטר (7.5 ppb), ללמוד מעל MCL-10 מיקרומטר (750 ppb) הנוכחית14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
המידע שנאסף ניסויים אלה ישמש בתור מדד מוקדם של שינויים פוטנציאל ההעברה הסלולר המחירים ויוו פצע מזוהם עם ארסן. לאחר מכן, מערכת אזעקה ניתן לבחור מולקולות בהתבסס על תפקידו בקידום ריפוי הפצע והעברה הסלולר ולאחר פולימראז כמותיים בעתיד תגובת שרשרת (qPCR) המבוסס על גנים ביטוי ניסויים ייתכן מוגדר עם סיומו של הזרם מחקרים. אם ההעברה בבתי assay הזה לשנות בנוכחות ארסן, מטרות גנים ספציפיים המעורבים בהעברה הסלולר עשוי להיות היעד עבור השפעות מזיקות של ארסן, ובכך עשוי להיות המנגנון של הפרעה.
Protocol
1. הכנת ארון אבטחה II (BSC)
הערה: בשיטות המתוארות פרוטוקול זה צריך להתנהל עם ציוד מגן אישי, תוך שימוש שיטות מעבדה כדי להשיג את הטכניקה aseptic.
- הרם הזכוכית מגן BSC לגובה ההפעלה, הפעל זרימה שכבתית האוהדים.
- השתמש תמיסה מימית של אלכוהול איזופרופיל 70% כדי לבצע מחיקה תברואה של אזור העבודה. לנגב BSC מן הקיר האחורי והקירות הצדדיים ולעבוד אל הבסיס.
- למחוק את כל החומרים אשר ישמש את הבדיקה עם אלכוהול 70% (אלכוהול איזופרופיל או EtOH) ומניחים בפנים BSC.
2. האדם Fibroblasts עורי זריעה בבקבוקון T75
- להשיג בקבוקונים עם הקו הרצוי תא cryopreserved (neonatal האנושי עורי fibroblasts [hDFn], התא ריכוז של תאים 500,000/מבחנה, ועל המעבר p3 – p5).
- הצב בקבוקון עם תאים בתוך אמבט מים 1.0 ס מעמוק ב 37 ° C כדי לאפשר מפשיר. הפשרת המבחנה עד כ- 70% של פתרון תא נוזלי. לנגב את המבחנה עם אלכוהול 70% ולמקם המבחנה בדרגש המבחנה בתוך BSC.
הערה: ודא מים אינו בא במגע עם הליכי משנה או שווי של המבחנה למניעת זיהום פוטנציאליים במהלך תא זריעה. למנוע מפשיר מלאה של תאים במים אמבטיה כמו הימנעות מלעשות זאת עלולה לגרום מוות של תאים לא מכוונת.
- הצב בקבוקון עם תאים בתוך אמבט מים 1.0 ס מעמוק ב 37 ° C כדי לאפשר מפשיר. הפשרת המבחנה עד כ- 70% של פתרון תא נוזלי. לנגב את המבחנה עם אלכוהול 70% ולמקם המבחנה בדרגש המבחנה בתוך BSC.
- לצייר את 10 מ"ל של מדיה בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS). להשתמש pipettor אוטומטי עצה פיפטה של 10 מ"ל לרוקן לתוך הבקבוק T75 תרביות רקמה. לאפשר המדיה באופן מלא עיתוני הבסיס + בקבוקי שתייה צידניות במוזיקת בעדינות את הבקבוק אחורה וקדימה.
- . בקבוקון פתוח עם מניות תא פתרון וביופסיה של המבחנה, להיות קשובה של מהירות pipetting, כמו קרום התא תהיה פגיעה של הקפאה קריוגנית
- העברת תאים בקבוקון רקמות T75 עם מדיה. הוצאה תא המופשרים לתוך הבקבוק רקמות, שוב להיות קשובים מהירות pipetting.
הערה: זריעה צפיפות של תאים בתוך הרקמה הבקבוק מוערכת להיות תאים/cm 6,6002. זריעה צפיפות יכול להשתנות כדי להכיל את המשתמש ואת התזמון הרצוי של ניסויים. - למדוד את 1 מ"ל של המדיה מן הבקבוק רקמות T75 ולהעביר נפח בחזרה לתוך המבחנה. להעביר נפח מ המבחנה בחזרה לתוך הבקבוק T75.
הערה: ביצוע שלב זה מסייעת למקסם את התשואה תא המבחנה. - להדק את הפקק של הבקבוק תרביות רקמה, רוק בעדינות לפיזור אחיד של תאים ההשעיה על פני כל. בדוק גם חלוקת תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה.
- תווית הבקבוק עם סוג התא, התאריך, ראשי תיבות, שושלת היוחסין, המטרה (למשל, hDFn, 07/11/2018, NDC, פסקה 4, ארסן לגרד Assay). למקם את הבקבוק תרביות רקמה חממה humidified-CO 37 ° C ו- 5.0%2 עבור 72 h.
הערה: מדיום הגידול צריך להיות שונה 12-24 שעות לאחר זריעה הראשונית כדי להסיר כמויות קטנות של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) cryopreservative ולאחר מכן השתנה כל 48 שעות אחרי זה כדי להבטיח תאים מוזנים כראוי. תקופת דגירה וגידול תלויות מחושב מספר התאים הדרושים וזמינותו מאפס. זמן ההכפלה תאים hDFn הוא בדרך כלל 16-24 h בתנאים רגילים. עם זאת, הכפלת קצב עשויים להשתנות עקב העלאת ה-pH, טמפרטורה, לחות, סוג המדיום, וכו ', ואני חייב להיות אחראים בעת תכנון ניסויים.
3. תא סופר ו תת-תרבות לתוך רקמות 12-ובכן תרבות צלחת
- לאחזר את הבקבוקון תרביות רקמה T75 חממה. להתבונן מודבקת תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה 10 X אובייקטיבית (100 X הגדלה סה כ) ולקבוע את המפגש תא משוער.
- סרוק את הרוב המכריע של הבקבוק תרביות רקמה בעת התבוננות זרימה כדי להבטיח את האחוז קנאס מוערכת. הערכת מורפולוגיה תא בודד על חריגות, או על זיהום חיידקי או פטרייתי.
- להרכיב את pipettor אוטומטי עם טיפ פיפטה של 10 מ"ל. השתמש pipettor האחות נפח מלא של מדיה מן הפתרון T75 והעברה פח אשפה. למנוע את הטיפ pipet פנייה אל פני השטח adhering של התא. להתעלם פיפטה עצה בתוך סל חומרים מסוכנים.
- להרכיב את pipettor אוטומטי עם טיפ פיפטה 5 מ. האחות 5 מיליליטר תמיסת מלח מאוזנת, לוותר על הבקבוק, רוק בעדינות את הבקבוק לשטוף מדיה עודפי תאים מתים, תוצר הפסולת.
- שואבים את עוצמת הקול T75, לוותר על תוך המיכל פסולת. למחוק את הטיפ פיפטה לפח חומרים מסוכנים.
- להרכיב את pipettor אוטומטי עם מתאם פיפטה 5 מ. האחות 2 מ של טריפסין במלאי, לוותר על הבקבוק, רוק בעדינות את הבקבוק כדי לפזר את האנזים על התאים מודבקת. ודא רוויה מלאה של המשטח חסיד. מקם את הבקבוקון רקמות החממה במשך 2-3 דקות (דקות).
הערה: התגובה סובסטרט המרבי לא יעלה על 10 דקות. - לבחון את הבקבוקון רקמות תחת מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה גדולה 10 X עדשה אובייקטיבי (100 X הגדלה סה כ). החל לתנודות העדינות כדי להקל על ניתוק התא.
- נגב את הבקבוקון T75 עם אלכוהול 70% והמקום פנימה BSC.
- להרכיב את pipettor אוטומטי עם טיפ פיפטה 5 מ. האחות 5 מ של מדיה מן המלאי ולהוסיף הבקבוקון רקמות T75 לעצור את התגובה סובסטרט. היחס מדיה: טריפסין צריך להיות 3:1. Pipet לכל אורך הבסיס + בקבוקי שתייה צידניות 2 - 3 פעמים כדי לשטוף ולהבטיח תגובת הופסקה. האחות האחסון מלאה של נוזל מן הבקבוק העברת לתוך צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל.
- למלא צינור חרוטי השני 15 מ"ל עם אמצעי אחסון זהה של מדיה.
- מקום שני צינורות חרוט 15 מ"ל במצב antipodal אחד לשני. החל 200 גרם של כוח צנטריפוגלי למשך 5 דקות 25° c על-ידי הגדרת פרמטרי הפעלה של ציוד.
- לנגב את הצינור חרוט 15 מ"ל עם מגורען תאים עם אלכוהול 70% ומניחים בפנים BSC.
- השתמש את pipettor אוטומטי עם קובץ מצורף מ ל כדי pipet את התקשורת, משאיר מאחור כ-250 µL של נוזל ותא גלולה. שים לב למיקום של הטיפ pipet, כפי בגדר תא תישאר ללא הפרעה. לוותר על אמצעי האחסון שנאספו לתוך מיכל פסולת וזורקים את הקצה בתוך סל חומרים מסוכנים.
- השתמש מתלה צינור microcentrifuge לפעול התחתון של צינור חרוטי ברחבי החריצים המבחנה, ויוצרים תנודה מהירה, כדי להפריע והשהה מחדש בגדר תא (לעתים נקרא "ארון תקשורת וגרף").
הערה: הימנע משימוש מערבל מערבולת לבצע שלב זה. כוחות הכבידה שנוצרו על-ידי מערבולת מיקסרים לחרוג תא g-force ספי והוא יכול לגרום lysing. כאשר הושלמה כראוי, הפתרון הסלולרי החדש יופיע תערובת מעונן עם אין גלולה הנותרים. בדיקות נאותות ביצוע שלב זה תיצור לרוב השעיה תא בודד, שמוביל דיוק רב יותר בעת ספירת תאים. - להוסיף 2 מ"ל של מדיה תא מניות או resuspension. Pipet התאים בעדינות במורד הצד של הצינור 20 פעמים כדי לשבור את כל הגושים. נפח התאים הכולל ההשעיה ולהקליט להפריש בקצרה.
- Pipet 20 µL של מניות Trypan Blue (0.4%) לבאר הריק של צלחת 96-ובכן באמצעות pipet סטרילי.
- מערבבים הפתרון תא מניות ליצירת השעיה תא אחיד לפני ההעברה. השתמש טיפ pipet סטרילי כדי להסיר µL 20 מניות תא (הימנעות לגעת בקירות הצינור). הוסף µL 20 בפתרון Trypan Blue בצלחת 96-ובכן.
- Pipet בעדינות כדי לערבב תוכן. Pipet 10 µL של תערובת בין coverslip את ספירת קאמרית על hemocytometer.
- לבחון את התאים ואת הרשת תחת מטרה X 10. להתבונן תשעה ריבועים גדולים בתוך שדה הראייה. לספור תאים רק ב המרכז, פינה 4 ריבועים (סה כ 5 ריבועים).
הערה: חפש התפלגות אחידה של תאים ברחבי הרשת כולה כדי להבטיח ספירה מדויקת. - לספור את כל התאים (שקוף וכחול) המשבצות מזוהה 5 של הרשת. ספירה בנפרד, רק התאים (כחול) nonviable ב 5 ריבועים אותו.
- לחשב באמצעות ספירת התאים קיימא:
איפה x = ספירת התאים קיימא, = סה כ תאי, b = תאים כלכלית - לחשב את צפיפות התאים קיימא באמצעות:
איפה x = צפיפות התאים קיימא ו- y = סכום הכולל התאים קיימא. - לחשב את התאים קיימא הכולל:
איפה x = סך התאים קיימא, y = צפיפות התאים קיימא, f = נפח התאים ההשעיה (מ"ל). - חישוב הכדאיות תא %:
איפה x = תא אחוז הכדאיות, y = התאים קיימא לסמוך על רשת, f = הכולל תאים לסמוך על רשת.
- לסמן קו אופקי לרוחב החלק התחתון של הלוח 12-טוב כדי לשמש סימוני הפניה במהלך דימות.
- להשתמש את צפיפות התאים קיימא (המחושב 3.3.7) לחישוב הנפח של המדיה כדי לדלל תא מניות עבור זריעה צלחת תרביות רקמה 12-. טוב.
הערה: תא אופטימלית זריעה צפיפות של תאים hDFn היא תאים/ס מ 5,0002. - לדלל המניה תאים תאים למ"ל 19,000 באמצעות מדיה, כל טוב עם 1 מ"ל של מניות תא זרע. מערבבים תא מניות מעת לעת כדי להבטיח אפילו תא זריעה על פני כל בארות 12.
- תווית כל צלחת עם סוג התא, שושלת היוחסין, משתמש ראשי התיבות של המטרה. מקום צלחות החממה נקבע ל- CO 37 ° C ו- 5.0%2. מאפשרים לתאים לגדול עד 100% הנהרות מושגת עבור assay מאפס.
- להשתמש את צפיפות התאים קיימא (המחושב 3.3.7) לחישוב הנפח של המדיה כדי לדלל תא מניות עבור זריעה צלחת תרביות רקמה 12-. טוב.
4. ארסן (As) פתרונות מניות וחישובים
- לדלל נתרן arsenite (NaAsO2) ישירות לתוך התא מדיה תרבות עם 10% FBS בריכוזים עבודה של 10, 1.0, 0.1 מיקרומטר 0.01 בתור.
- בשביל זה, הפוך של המניות הראשונית 1 מ"מ כפתרון על ידי דילול 3.9 מ ג נתרן arsenite לתוך 30 מ של מדיה. באופן סדרתי לדלל את המניה 1 מ"מ עבור שאר כפתרונות.
| 1000 מיקרומטר כמו מניות חישובים | ארסן עובד ריכוזים מניות | 1V M1=2V M2 | נפח של פתרון ארסן הקודם | נפח של המדיה | הנפח הכולל של ארסן עובד המניות |
| משקל מולקולרי של NaAsO2 : 129.9 גר'/מול | 10 מיקרומטר כמו | (x מ"ל) (1,000 מיקרומטר) = (30 מ ל)(10 µM) x = 0.3 mL | mL 0.3 = 300 µL של 1 מ מ כפתרון | מ. ל 29.7 מדיה | 30 |
| .03 L x.001 מול/ליטר x 130 גרם/מול... = 3.9 מ ג של ארסן | מיקרומטר 1.0 כמו | (x מ"ל) (10 מיקרומטר) = (30 מ ל)(1 µM) x = 3 מ ל | 3 מיליליטר 10 מיקרומטר כפתרון | 27 מ"ל של מדיה | 30 |
| לדלל 3.9 מ ג נתרן arsenite לתוך המדיה 30 מ | מיקרומטר 0.1 כמו | (x מ"ל) (1 מיקרומטר) = (30 מ ל)(0.1 µM) x = 3 מ ל | 3 מ ל 1 מיקרומטר כמו | 27 מ"ל של מדיה | 30 |
| מיקרומטר 0.01 כמו | (x מ"ל) (0.1 מיקרומטר) = (30 מ ל)(0.01 µM) x = 3 מ ל | 3 מ"ל של 0.1 מיקרומטר כמו | 27 מ"ל של מדיה | 30 |
טבלה 1. מניות ארסן, דילולים טורי. השולחן הזה מסביר את החישובים המשמש ליצירת הפתרונות מניות כמו ועבודה מלאי פתרונות עבור קבוצות הטיפול.
5. לגרד Assay טכניקה וזיהום ארסן
- להשיג צלחת 12-ובכן עם תאים של החממה. להציג תאים 10 X הגדלה אובייקטיבית (100 X הגדלה סה כ). לקבוע תא זרימה בתוך כל טוב.
הערה: כל בודדים טוב חייב להגיע למפגש 100% לפני גירוד. שלב קריטי זה מבטיח עקביות בתוך וזמינותו ומסייעת לתקנן assay פרוטוקולים לאורך ניסויים. אם כל בארות לא הגיעו למפגש 100%, מאפשרים לתאים תקופת דגירה של זמן נוסף עד כל בארות הגיעו למפגש 100%. צמיחה נוספים פעם הבארות שכבר הגיעו למפגש 100% לא יושפעו. תאים confluent בדרך כלל הופכים הצמיחה נעצרה ולהישאר כתרבות טפט, תוך מתן אפשרות תת confluent בארות להגיע למפגש 100%. - להרכיב pipettor אוטומטית עם טיפ פיפטה של 10 מ"ל. האחות התקשורת צמיחה מתוך כל בארות. השלך את עוצמת הקול של פסולת נוזלית, הטיפ פיפטה בסל הנגועים.
- להרכיב את pipettor p200 עם טיפ סטרילי של µL 1-200. כל היטב, לייצר שריטה "הפצע מעושה" מאת דאייה הטיפ פני תא מ-בשעה 12 למיקום-שעה 6.
הערה: שלושה גורמים שישפיעו באופן משמעותי על עקביות הן מהירות, לחץ והזווית עצה. השריטה צריכה להתבצע במהירות, ובלחץ קבוע, בעת היותו מודע הזווית עצה נשאר מאונך לבסיס של הצלחת. גירוד לאט מדי יגרום קווים עקומים, לחץ עודף יכול לצמיתות ציון תא הקפדה משטחים, זווית עצה של פחות מ- 90° תצמצם את רוחב מאפס. כל אלה טעויות נפוצות יכול לגרום ההעברה שינו מחירים ודוגמאות. - ברור משם גושים פסולת ותא עודף על ידי שטיפה עם 1 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן לכל טוב. רוק צלחת--לצד כדי להקל על הכביסה. הסר את תמיסת מלח מאוזנת מבארות והיפטרו במיכל אשפה. השלך הטיפ פיפטה 5 מ"ל לפח הנגועים.
- להרכיב את pipettor p200 עם טיפ סטרילי של µL 1-200. כל היטב, לייצר שריטה "הפצע מעושה" מאת דאייה הטיפ פני תא מ-בשעה 12 למיקום-שעה 6.
איור 1: ייצוג סכמטי של גירוד וזמינותו. כל העבודה נעשית בתוך שדה aseptic כדי להקטין את הסיכוי לזיהום. תאים נזרע על צפיפות הרצוי בתרביות רקמה מבחנות, גדל באינקובטור להגדיר תנאים הפיזיולוגיות אנושיים (5% CO2, 37 ° C). כשמגיעים זרימה הרצוי, תאים גילוח ורחיצה כירורגית תת מתורבתים תרביות רקמה. ובכן 12 לוחות-צפיפות זריעה הרצוי. התאים גדלים הנהרות 100% כל היטב של לוח 12-ובכן שרוט באמצעות טיפ pipet סטרילי. זה "שריטה" יוצר במבחנה מעושה פצע (מסומן על ידי חץ נוסעים כפול), שבו תאים באופן טבעי להגר לסגור את שטח פתוח. כל אחד גם יכול להיות ייחודי מותנה, הגירה הסלולר המחירים ניתן להקליט ולצפות במעשיהם לכמת בתגובה לתנאי טיפול שונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
- להשתמש pipettor p1000 עם טיפ 1,000 µL pipet 1,000 µL של ארסן מניות לתוך בארות שהוקצו באופן אקראי עם קבוצת הטיפול. השתמש טיפ pipet חדש עבור כל טוב למניעת זיהום לחצות. רשום את הזמן כאשר טיפולים נוספים. מקום טוב 12 צלחות אינקובטור להגדיר ב- CO 37 ° C ו- 5.0%2.
6. הדמיה
- לכידת תמונות של כל אחד טוב-10 X הגדלה אובייקטיבית כל 4 שעות במשך 24 שעות ביממה (0, 4, 8, 12, 16, 20, ו-24 שעות). להפנות קו שצויר בעבר על החלק התחתון של צלחת לשיקוף באותו המיקום לאורך השריטה בתוך מכל קידוח בנקודות זמן עוקבות.
הערה: זה הכרחי כי באותם מיקומים מצטלמים בכל נקודה בזמן כדי לאפשר ניתוח מדויק תמונות וכדי לקבל נתונים נציג.
7. ניתוח תמונות
- להעלות תמונות שנתפסו על מיקרוסקופ אור הפוך למחשב ולשמור כתמונת JPEG עם שם קובץ מפורט.
- פתח ImageJ.
- להעלות תמונה של מיקרומטר הבמה עם מרחקים מוכרות התוכנה כדי להמיר פיקסלים מילימטר (מ מ) כאשר לוקחים מידות התמונה על-ידי גרירה ושחרור של הקובץ לתוך חלון התוכנה.
הערה: מיקרומטר צריך יש קווים התוחם באורך ידוע 1 מ מ, יש לקחת את התמונה בהגדלה אותו להשתמש כדי ללכוד תמונות של תאים. לדוגמה, במחקר זה התמונות צולמו ב 100 X הגדלה הכולל, ובכך התמונה של מיקרומטר הבמה נלקח ב- 100 X הגדלה הכולל.- לחץ על האפשרויות ישר, Segmentedאו קווים חופשיים .
- למתוח קו של מרחק ידוע על התמונה מיקרומטר באמצעות השנתות-באורך משויך לכל שנתות סימני. כדי לצייר קו ישר: לחץ על העכבר, להחזיק, גרור את הסמן במיקום הרצוי, ואז שחרר העכבר.
- בחר נתח ולאחר מכן בחר לקבוע קנה מידה.
- הגדר מרחק ידוע ידוע אורך קו שצויר בשלב הקודם.
- הגדר אורך מ מ.
- סמן את התיבה גלובלית.
- בחר אישור כדי לצאת מתוך התפריט.
- לסגור התמונה מיקרומטר הבמה.
- להעלות תמונה assay שריטה אחת לתוך ImageJ על-ידי גרירה של יורד קובץ תמונה לתוך החלון.
- לצייר קו ישר לרוחב השריטה (מתוך הקצה המוביל שמאלה אל הקצה המוביל ימינה).
- הקש על האות M במקלדת כדי להקליט את המדידה של קו ישר שצויר. חלון תוצאות קטן יופיע מיד לאחר הקלדת האות M. . זה איפה תהיה מדידת רוחב.
- חזור על שלב 7.4 סך של 10 פעמים כדי לקבל 10 מדידות לאורכו של השריטה.
הערה: חשוב ליצור ערכי רוחב הייצוגי ביותר למטה לכל אורכה של השריטה. הקפד מרחף את מידות רוחב 10 שווה לאורכו של השריטה מלמעלה עד למטה. - צור קובץ הגיליון האלקטרוני assay מאפס כדי להעתיק ולהדביק את המידות.
- העתק והדבק את מידות רוחב 10 מתוך חלון תוצאות העמודות המתאימות בקובץ הגיליון האלקטרוני (טבלה 2).
הערה: כאשר המידות מועתקות מתוך חלון תוצאות ומודבקות לתוך הגיליון, יהיו עמודות מיותר של ערכים; ערכים אלה יש למחוק, לשמר רק את מידות רוחב 10.
- העתק והדבק את מידות רוחב 10 מתוך חלון תוצאות העמודות המתאימות בקובץ הגיליון האלקטרוני (טבלה 2).
| מידות רוחב אקראי 10 | הו | 4 שעות | 8 שעות | 12 שעות | 16 h | 20 h | h 24 שעות ביממה |
| 1 | |||||||
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | |||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | |||||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
| 10 | |||||||
| ממוצע של מדידות 10 |
בטבלה 2. מידות רוחב raw שולחן עיצוב. טבלה זו מראה המבנה הארגוני על המדידות raw שהושג.
- חזור על השלב הנ ל למשך שאר הדימויים assay מאפס.
- לחשב את הממוצע של המדידות 10 בכל נקודה בזמן (0-24 h) עבור כל טוב.
- לקבוע אחוז סגירת חישובים באמצעות ערכים משלב 7.8.
- יצירת טבלה בתחתית הגיליון האלקטרוני שכותרתו "רוחב מדידה ממוצעים" (טבלה 3).
- העתק והדבק שורת ממוצע של מדידות 10 מחושבת באופן צעד 7.8 לתוך הטבלה "מדידת הרוחב הממוצע".
- צור טבלה אחרת ליד השולחן רוחב מדידה ממוצעים . כותרת זו טבלת אחוזים פצע הסגר (טבלה 4).
הערה: הערך בעמודה 0 h עבור כל טוב צריך להיות 0 כי השריטה היא 0% סגר ב התמונה הראשונית h 0 עבור כל בארות. - נווט לעמודה הבאה מעל (4 שעות).
- לחשב הסגר אחוז עבור 4, 8, 12, 16, 20 ו- 24 h נקודות זמן:
איפה, x = אחוז סגירת מעגל, אני = רוחב הטיוטה הראשונית (0 h רוחב), f = רוחב הטיוטה הסופית (4, 8, 12, 16, 20 או 24 h רוחב).
| ובכן רוחב ממוצעים | הו | 4 שעות | 8 שעות | 12 שעות | 16 h | 20 h | h 24 שעות ביממה |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3 א | |||||||
| 4a | |||||||
| 1b | |||||||
| 2b | |||||||
| 3b | |||||||
| 4b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2 ג | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
בטבלה 3. מדידת הרוחב הממוצע בתבנית טבלה. טבלה זו מציגה את המבנה הארגוני הממוצעים מדידת רוחב מחושב באמצעות המדידות raw רוחב בטבלה מס ' 2.
| . טוב | הו | 4 שעות | 8 שעות | 12 שעות | 16 h | 20 h | h 24 שעות ביממה |
| 1a | 0 | ||||||
| 2a | 0 | ||||||
| 3 א | 0 | ||||||
| 4a | 0 | ||||||
| 1b | 0 | ||||||
| 2b | 0 | ||||||
| 3b | 0 | ||||||
| 4b | 0 | ||||||
| 1c | 0 | ||||||
| 2 ג | 0 | ||||||
| 3c | 0 | ||||||
| 4c | 0 |
בטבלה 4. אחוז פצע בתבנית טבלה הסגר. טבלה זו מציגה את המבנה הארגוני עבור הערכים סגירת הפצע אחוז מחושב באמצעות מדידת הרוחב הממוצע בטבלה3.
- צור טבלה אחרת ליד השולחן אחוז סגירת הפצע . כותרת זו טבלה חאן (טבלה 5).
- לחשב את 0-4 אזור h תחת הערך העקומה (AUC) ב- 0-4 העמודה h עבור כל טוב:
איפה x = 0-4 h חאן אל הערך, = % ערך סגירת מעגל עבור 0 h, b = % ערך הסגר במשך 4 שעות, h = הזמן בין האמצעים שני (4 h במחקר זה). - לחשב את השטח 4-8 h תחת הערך העקומה (AUC) בעמודה h 4-8 עבור כל טוב:
איפה x = 4-8 h חאן אל הערך, = % ערך הסגר במשך 4 שעות, b = % ערך סגירת מעגל עבור 8 שעות, h = הזמן בין האמצעים שני (4 h במחקר זה).
הערה: ערך חאן אל אחד יש לחשב עבור כל מרווח זמן של 4 שעות על התקופה 24 שעות ביממה במשך כל. - לסכם את כל הערכים חאן אל מ h 0-24 (המחושב צעדים 7.10.1-7.10.2) כדי לקבל ערך חאן אל מסוכם עבור כל טוב. ודא שערכים אלה נשמרים כראוי לשם ניתוח סטטיסטי.
- לחשב את 0-4 אזור h תחת הערך העקומה (AUC) ב- 0-4 העמודה h עבור כל טוב:
| . טוב | 0-4 h | 4-8 h | 8-12 h | 12-16 h | 16-20 h | 20-24 h | חאן אל מסוכם |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3 א | |||||||
| 4a | |||||||
| 1b | |||||||
| 2b | |||||||
| 3b | |||||||
| 4b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2 ג | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
טבלה 5. חאן אל תבנית טבלה. טבלה זו מציגה את המבנה הארגוני עבור הערכים חאן אל מחושב באמצעות האחוזים פצע הסגר ערכים בטבלה4.
8. ניתוח סטטיסטי
- לקבוע את שיטת ניתוח סטטיסטי המתאימה ביותר עיצוב ניסיוני והן מסוכם חאן אל הערכים שהתקבלו במהלך וזמינותו.
Representative Results
גודל מדגם (n) עבור כל קבוצות טיפול היה n = 28. היו תאים בתרבית בהצלחה טכניקות aseptic הבאים ופרוטוקולים מעבדה (איור 1). שריטות אחיד נצפו על פני כל קבוצות טיפול עם הרוחב הממוצע מאפס מדידה 0.8 מ מ 0.4 מ מ (איור 2). קבוצות הבקרה היה שטח מסוכם הממוצע תחת הערך העקומה של 1,355.83; מיקרומטר 0.01 כקבוצות הטיפול היה ממוצע מסוכם תחת הערך העקומה של 1,366.21; מיקרומטר 0.1 כקבוצות טיפול ממוצע היה מסוכם תחת הערך העקומה של 1,326.24, מיקרומטר 1.0 כקבוצת טיפול היה ממוצע מסוכם תחת הערך העקומה של 1,295.10; סוף סוף 10 מיקרומטר קבוצת הטיפול היה שטח מסוכם הממוצע תחת הערך העקומה של 535.12, אשר היה נמוך מבחינה סטטיסטית לעומת כל קבוצות אחרות (p < 0.05) (איור 3). R-תוכנית לניתוח סטטיסטי שימש כדי להפעיל חד-כיווני אנובה עם התאמה פוסט הוק Tukey כדי לקבוע סטטיסטי הבדלים בין קבוצות הטיפול (p < 0.05).
איור 2: שריטה נציג assay תמונות על פני תקופה 20 h. תמונות A-D מייצגים הסלולר נדידה של תאים שליטה; תמונות E-H מייצג את ההעברה הסלולר של תאים מזוהם עם מיקרומטר 1.0 כמו; תמונות-L מייצגים הסלולר נדידה של תאים מזוהם עם 10 מיקרומטר בתור. מתמונות אלה, ברור כי ההעברה הסלולר מואטת בנוכחות ארסן. הדימויים שליטה מציגים לחלוטין "נרפא" שריטה לאחר 20 h, בעוד שתי הקבוצות כמו טיפול אחרים לא "נרפא". 10 מיקרומטר כטיפול עכבות סגר מוחלט לגמרי לאחר ה 24 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: זרניך מאט את ההעברה הסלולר ב וזמינותו מאפס. תמונות נלכדו במשך 24 שעות ביממה לבחון שינויים תעריפי הסלולר ההעברה בנוכחות ריכוזים שונים של ארסן. תמונות raw נותחו באמצעות תוכנה אוטומטיות (למשל, ב- MATLAB), איזה רוחב הפצע נמדד בתחילה, ואז מחושב אחוז הסגר, ולבסוף השטח מתחת לעקומה (AUC). קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע. 10 מיקרומטר כקבוצת טיפול סטטיסטית האטה ההגירה הסלולר של האדם עורי fibroblasts neonatal (hDFn), המוצגת על-ידי ערך חאן אל נמוך סטטיסטית, בהשוואה כל קבוצות טיפול אחרות באמצעות חד-כיווני אנובה Tukey פוסט הוק התאמה (p < 0.05). הבדלים סטטיסטיים מיוצגים על ידי האותיות "A" ו- "B", אשר התקבלו באמצעות שימוש בשיטת להציג מכתב קומפקטי זמינות בתוכנית-R. טיפולים שאינם שותפים מכתב משותף הם משמעותיים מבחינה סטטיסטית אחד מהשני (p < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
היישום של זה וזמינותו מספק הערכה תפוקה גבוהה ומתוזמן של הגירה הסלולר, ייתכן לתרגם ישירות למערכות פיזיולוגיות מורכבות5,6,7. מסיבה זו, המודל המוצע ספסל-העליון היה מכוון, מתורגלת כדי להעריך את ההשפעות של סוכני טיפולית רעלנים סביבתיים שונים על6ריפוי הפצע. הריכוזים של ארסן משמש במחקר הנוכחי שנמצאו רלוונטיים לסביבה באמצעות חיפוש ספרות נרחבת של רמות חשיפה מוכרות, ובסיסים של סקירה רטרוספקטיבית של נתונים שונים14,15, 16,17,18,19,20,21. שימוש זה במבחנה מאפס assay הדגימו כי החשיפה ריכוז ארסן בתוך הגבוהה, אבל טווח הרלוונטיות. לסביבה, נדחתה סגירת הפצע (העברה הסלולר).
ספסל זה הטופ מודל הועסק גם לבודד וללמוד קו תא בודד (פיברובלסט) להבין יותר איך פיברובלסט ההעברה תורמת פצע תוצאות הריפוי. יתר על כן, קשה ללמוד את הפונקציות של קו תא בודד במערכות מורכבות ויוו עם רבים אחרים תאים ורקמות הנוכחי יכול להפריע הניתוח. בנוסף, וזמינותו מספק אמצעי להשגת נתונים סגירת הפצע אחוז הכמותיים למחצה יכול לשמש למטרה ספציפית המנגנונים התאיים שדרכו תרכובות עשויים להשפיע ריפוי הפצע. לדוגמה, תאים המשמשים וזמינותו גירוד יכול להיות, המאוחסן ריאגנט הרצוי ונשתמש בהם בביטוי הגנים (אות ה-mRNA) או ביטוי חלבון מבחני22. מידע זה יכול להיות שימושי לחוקר אם הם מבקשים להבין מה אותות או חלבונים עשוי ברובו תורמים לשינויים ההעברה הסלולר בנוכחות טיפולים (קרי, ארסן) משתנות22.
האדם fibroblasts עורי neonatal נבחרו לעבודה זו על בסיס תפקידם בולטים בריפוי הפצע. עם זאת, פרוטוקול assay גירוד זה יושם באמצעות סוגי תאים שונים עבור מגוון של מטרות המחקר. לדוגמה, אומץ וזמינותו מאפס לתוך השדה לאונקולוגיה ללמוד עיכוב העברה של תרופות כימותרפיה23; נדידת תאים שרירי השלד, התפשטות של דיפוזיה24; כדי לחקור את ההשפעה של תמציות צמחים על ההעברה הסלולר25; כדי להבין כיצד תקין ההגירה והתפשטות לתרום פצע ריפוי9. בנוסף, עיתון הקודם על-ידי. פינטו ואח להעריך את ההשפעות של אורניום (U), טסיות דם עשיר פלזמה (PRP) על העברה hDFn שימוש assay מאפס6. מטרת עבודה זו היתה כדי להבין את היקף אשר assay הזה יכול לבחון את ההשפעה של סוכן חשבתי כדי להאט את הסלולר ההעברה (U), כמו גם סוכן חשבתי כדי להאיץ את הסלולר ההעברה (PRP). וכפי שניתן לראות את העבודה הנ ל, מחקר על ידי חוקרים אחרים, היישום של גירוד וזמינותו יש פוטנציאל גבוה לשימוש ניסיוני מודלים שונים26. למרות הפרטים שרשמת את השיטות השונות אמור להיות צפוי בין חוקרים ניסויים. לדוגמה, תעריפי הסלולר ההעברה סביר משתנים בהתבסס על הקו תא בשימוש, בנוסף יסודות קורט הנדרשים לצורך סוגי תאים ייחודיים. רבים מן התצפיות חשוב כדי לסייע תא התשואה הכדאיות מפורטים כהערות לאורך כל פרוטוקול זה. עם זאת, מומלץ מאוד כי החוקרים ההמלצות של היצרן תנאי הגידול האופטימלית, וכדי להשתמש בשיטה זו כמו הוראה משלים עבור תא כללי תרבות עבודה.
אמנם וזמינותו מאפס רב-תכליתי במיוחד עבור חקר פעילות תאית; הטיות בלתי צפויים שעלולים להתעורר במדידת טכניקות. לדוגמה, בעת שימוש ImageJ לעקיבה ידנית תא העברה חזיתות, וריאציה יכולים להתקיים בין משתמשים, אשר יכול להגביל איסוף נתונים נציג ודיוק. יש גם לציין כי ההעברה חזיתות יש לקרוא עיוורים לטיפול כדי למזער את המשתמש הטיה. יתר על כן, זיהוי ידני העברה חזיתות עלול לגרום טעות בחישוב של המרחק הממוצע בשל היווצרות pseudopod על ידי התאים ואת היכולת שלהם להגיע adhesions מוקד טופס, אשר יכול להיות חזותי מטעה. באופן דומה, השימוש של פלורסנט "תא גשש" צבענים במשטח תא או חלבונים גרעיניים כדי לזהות ההעברה עשוי שלא במתכוון לתקן תאי וכתוצאה מכך אי דיוקים כאשר מודדים את ההעברה הסלולר לאורך זמן. מומלץ הפקדים המתאימים חיובי או שלילי להיות רשום בתוך הניסוי ועד ישבנים לגמרי ההשפעה של הטיפול על הקווים התא. המנהג הזה assay יש להשלים כהוקרה על מגבלותיו. Assay הזה אינו מבטיח תוצאות ההעברה הסלולר המתקבל חוץ גופית בתוך ניסויים יהיה לתרגם ישירות לתוצאות ויוו . פצע ריפוי וסלולריות ההעברה במערכת החיים מורכבים מערבת מספר רב של סוגי תאים, אותות מולקולריים; שלכל אחד מהם יש פוטנציאל להשפיע על תגובות ריפוי.
לסיכום, וזמינותו מאפס נמצאה לספק תפוקה גבוהה ההקרנה של הגירה הסלולר בתגובה שינוי סביבות6,25. אנו במיוחד מנוצל פרוטוקול זה בהצלחה לזהות שינויים בהעברה הסלולר בעקבות חשיפה ארסן במינונים שונים הרלוונטיים לסביבה. נתונים אלה סיפקו הצדקה לשימוש וזמינותו מאפס כדי לקדם מחקר והערכה של המסלולים מכניסטית של הגירה הסלולר assay הזה, איך המסלולים הללו שונו על ידי חשיפה ארסן.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי על מיעוט בריאות פערים בשרותי בריאות של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר U54MD012388. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
| Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
| Water Bath | Precision | Model 182 | |
| Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
| CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
| Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
| Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
| Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
| p200 Pipette | Gilson | ||
| p20 Pipette | Gilson | ||
| Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
| T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
| 15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
| 50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
| 5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Tissue Marker | Securline | 92167 | |
| Wipes | Kintech | 34155 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
| Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
| Bleach | Great Value | 220-04 | |
| 96-well | Falcon | 353915 | |
| Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
| Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
| Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
| 12-well plate | Corning | 3598 | |
| Waste Beaker | n/a | n/a | |
| 1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
| Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
| Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
| Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
| Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |
References
- Diegelmann, R., Evans, M. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing. Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).
- Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. Novel insights into wound healing sequence of events. Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).
- Michelson, A. Platelets. , 3rd edition, Waltham, Massachusetts. (2013).
- Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations. American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).
- Liang, C., Park, A., Guan, J. In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. , 329-333 (2007).
- Pinto, B., et al. A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied. In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).
- Pinto, B., et al. Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model. Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).
- Roubelakis, M., et al. Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).
- Shibata, S., et al. Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway. Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).
- Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. Cellular aspects of wound healing. Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).
- Gentry, P. R., Clewell, H. J. III, Greene, T. B., et al. The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).
- Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media. International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).
- Robertson, F. N. Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States. Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).
- Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA. Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).
- Uhlman, K. Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics. , The University of Arizona. Tucson, AZ. Arizona Cooperative Extension, AZ 1453 (2008).
- Agusa, T., et al. Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam. Science of the Total Environment. , 488-489, 562-569 (2014).
- Ayotte, J. D., et al. Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States. Science of the Total Environment. , (2014).
- Dummer, T. J., et al. Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada. Science of the Total Environment. , (2014).
- Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations. Water Research. 48, 156-169 (2014).
- Beamer, P. I., et al. Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).
- Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).
- Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. Optimization of cell motility evaluation in scratch assay. Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).
- Harishkumar, M., et al. Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract. BioMed Research International. 13, Article ID 963457, 8 pages (2013).
- Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay? Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).
