Summary
Denna studie fokuserar på en in vitro- modell av såret helande (scratch assay) som en mekanism för att fastställa hur miljögifter såsom arsenik inflytande cellulära migration. Resultaten visar att denna in vitro -analys ger snabba och tidiga indikationer på förändringar i cellulära migration före in-vivo -experiment.
Abstract
Förstå de fysiologiska mekanismerna bakom sårläkning har varit i fokus för pågående forskning i många år. Denna forskning översätter direkt till förändringar i kliniska standarder som används för att behandla sår och minska sjuklighet och dödlighet för patienter. Sårläkning är en komplex process som kräver strategiska cell och vävnad interaktion och funktion. En av de många kritiskt viktiga funktionerna i sårläkning är individuella och kollektiva cellulära migration. Vid skada migrera olika celler från blodet, omgivande bindväv och epitelial vävnader snabbt till sårområdet genom kemiska eller fysiska stimuli. Denna migration svar kan till stor del diktera resultaten och framgång av ett läkande sår. Förstå detta särskilda cellulär funktion är viktigt för translationell medicin som kan leda till förbättrad sårläkning utfall. Här beskriver vi ett protokoll som används för att bättre förstå cellulära migration den avser sårläkning och hur förändringar till den cellulära miljön kan markant ändra denna process. I detta exempel studie odlades dermal fibroblaster i media kompletteras med fetalt bovint serum (FBS) som enskiktslager kulturer i vävnadsodling kolvar. Cellerna var aseptiskt överförs i vävnadsodling behandlas 12-bra plattor och vuxit till 100% sammanflödet. När du når sammanflödet, var cellerna i enskiktslager vertikalt kliade användande en p200 Pipettera spets. Arsenik som utspädd i kultur media kompletteras med FBS lades till enskilda brunnar på miljömässigt relevanta doser 0,1-10 M. bilder fångades var 4 timmar (h) under en 24 h period med ett inverterat ljusmikroskop att iaktta cellulära migration (sår stängning). Bilder individuellt analyserade med bild analys programvara, och procent såret stängning beräknades. Resultaten visar att arsenik långsammare sårläkning. Denna teknik ger en snabb och billig första skärm för utvärdering av effekterna av föroreningar på sårläkning.
Introduction
Sårläkning består av en komplex serie överlappande steg som involverar olika celltyper, signalmolekyler och extracellulär matrix komponenter1. Tillsammans arbetar dessa komponenter i samförstånd för att uppnå såret upplösning eller reparation, som i slutändan leder till bildandet av ett skyddande fibrotisk ärr beroende på graden av trauma1. För att fånga de enskilda processer och funktioner för såret är läka i ett experiment svårt; enskilda steg inom sårläkningsprocessen behöver identifieras och testas separat. Bland de många stegen av sårläkning, har processen för cellulära migration ansetts vara kritisk när du utvärderar helande priser2. Cellulära migration kan observeras i alla faser av sårläkning, och således kräver ytterligare förståelse för hur förändringar av cellmigration kan påverka sårslutning. Cellulära migration ses exempelvis i både tidiga och sena fas inflammation, med blod koagulation och trombocyter aggregering på såret plats3. Dessa händelser förhindra kraftig blodförlust genom att bilda en tillfällig blockering för att fylla sårade områden saknar vävnad3. Trombocyter i omlopp kommer att syntetisera och utsöndrar vasoaktiv medlare tillsammans med kemotaktiska faktorer, vilka tillsammans signal för inflammatoriska leukocytmigration (vita blodkroppar) på den skadade vävnaden för reparera4. Återepitelisation uppstår inom timmar efter vävnadsskada och innebär som täcker såret webbplatsen genom aktivitet och migrering av epitelial keratinocyter att förhindra ytterligare förorening eller invasion av främmande partiklar i såret plats2. Dessa exempel fånga bara några av de många cellmigration funktioner är associerad med sårläkning.
Scratch analysen har beskrivits och används för att bättre förstå cellmigration och dess många roller i sårläkning5,6. Denna analys anses förenklade, ger hög genomströmning och gör det möjligt för utredaren att samla in representativa cell migration uppgifter. Migration-analyser har framgångsrikt visat att vissa föreningar kan accelerera eller bromsa av cellulära migration6. Dessutom ger dessa analysens resultat translationell fysiologisk information som kan användas för att formulera mål behandlingar, dosering koncentrationer och gener av intresse före in-vivo -experiment. Analysen kräver grundläggande cell kultur tekniker och leveranser, en cell fodrar av val, och bildteknik för att fånga rörelse över tid eller rörelse som svar på behandlingar.
Analysen kan lätt manipuleras eller skräddarsydda för att passa behoven hos utredaren. Men finns det fyra grundläggande frågor att överväga innan experiment. Vilka allmänna eller specifika fråga är den försöksledarna som samtliga försöker besvara? Detta gäller för de flesta hypoteser driven forskning; Det är dock kritisk till denna analys eftersom det kommer avgöra många av parametrarna som behövs för att korrekt och fullständigt besvara frågan/frågorna. Vad cellinje eller cellinjer (om flera) ska användas att representera den fysiologiska system studeras? Till exempel i en kutan sår helande studie, en dermal fibroblast5,6,7, stem cell8eller epidermala keratinocyter9 kan anses representera cellpopulationer som normalt finns i överflöd på huden vävnad10. Alternativt, neutrofiler, makrofager eller andra inflammatoriska celler kunde utvärderas i detta system att representera cellmigration av andra beståndsdelar i sårläkning inom hud vävnad10. Dessutom hjälper identifierar den specifika cellen fodrar utvärderas till att identifiera vilka reagenser är optimala att använda att främja cellernas metaboliska aktivitet. Hur blir cellmigration spåras/avbildas? Det finns ett antal tekniker som används för att observera cellmigration inom en tallrik eller kolv. Till exempel ger färgning eller fluorescently taggning celler och använder fluorescens eller confocal imaging för att spåra celler en stark kontrast, vilket gör att utredaren att tydligt definiera cellulära vs. icke-cellulär platser och cellulära rörelse11 . En annan vanlig teknik, beskrivs i denna studie är att utnyttja inverterat ljusmikroskop med fas kontrast6,7. Detta alternativ till cell färgämnen och fluorescens tillåter användaren att live spår celler utan fixar obotligt celler före imaging och möjliggör också att fånga bilder av samma enskilda brunnar innehållande sårade enskiktslager av celler över tidpunkter. Vad resultatet åtgärder kommer att användas för analys? Med hjälp av bilderna samlades under hela studien, data kan skapas där förändringar i cellulära migration priser kan förstås. I vårt labb mikroskopiska bilder som tagits på den inverterat ljusmikroskop överförs till bild analys programvara och beräknas den procentuella sårslutning och summerade arean under kurvan (AUC).
Vi kommer att belysa den specifika användningen av denna analys att belysa förändringar av dermal fibroblast migration i närvaro av en känd miljö förorening, arsenik. Arsenik är en naturligt förekommande metalloid finns inom jordskorpan. Olika platser har hittats med förhöjda halter av arsenik, som utgör en risk för personer som bor nära dessa platser. Som ett resultat, har mat och vatten källor visat sig ha förhöjda halter av arsenik föroreningar, vilket ökar risken för individer att bli exponerad för arsenik. Miljömässiga arsenikexponering har visat sig ha långsiktiga hälsokonsekvenser i mänskliga populationer över eller ens nedanför nuvarande USA Environmental Protection Agency (USEPA) Max föroreningars nivå (MCL) 10 ppb (10 µg/L)12, 13. även om den amerikanska MILJÖVÅRDSMYNDIGHETEN har satt denna MCL och anses det säkert att dricka gränser, arsenik koncentrationer som överskrider denna gräns är inte ovanliga i vattenkällor över hela världen. I sydvästra USA, har många grundvatten, brunnsvatten och fjädrar dokumenterats för att innehålla när det gäller halter av arsenik14. Till exempel i Verde Valley, AZ innehåller Montezuma väl 210 µg/L arsenik15. Grundvattnet runt floden Verde, AZ innehåller 16 µg/L arsenik i genomsnitt med toppvärden når 1,3 mg/L15,16. Noterbart överstiger i många brunnar i Verde River vatten Boden koncentrationerna av arsenik 50 µg/L15,16. Med denna kunskap, miljömässigt relevanta arsenik koncentrationer var markerat intervallet underifrån MCL på 0,1 µM (7,5 ppb), ovanför MCL på 10 µM (750 ppb) i aktuellt studera14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Den information som samlats in från dessa experiment kommer att användas som en tidig indikator på potentiella ändringar av cellulära migration priser i en in-vivo sår förorenad med arsenik. Efteråt, signaling molekyler kan väljas baserat på deras roll för att underlätta sårläkning och cellulära migration och framtida kvantitativa polymerasen kedjar reaktion (qPCR) baserat gen uttryck experiment kan inrättas vid slutförandet av nuvarande studier. Om migration priser i denna analys ändrar i närvaro av arsenik, specifik gen mål inblandning i cellulära migration kan vara målet för skadliga effekterna av arsenik, och kan således vara mekanismen av störningar.
Protocol
1. beredning av en biosäkerhet II skåp (BSC)
Obs: De metoder som beskrivs i detta protokoll bör utföras med personlig skyddsutrustning, medan du använder god laboratoriepraxis för att uppnå aseptisk teknik.
- Lyfta BSC skyddande glaset till operativa höjd och aktivera laminärt flöde fans.
- Använd 70% isopropanol vattenlösning för att utföra en sanering torka av arbetsområdet. Torka BSC från bakre väggen och sidoväggarna och arbeta ner till bottenplattan.
- Torka alla material som kommer att användas i analysen med 70% alkohol (isopropanol eller EtOH) och placera dem inuti BSC.
2. mänskliga Dermal fibroblaster sådd i en T75 kolv
- Erhålla injektionsflaskor med önskad frysförvarade cell linje (neonatal mänskliga dermal fibroblaster [hDFn], vid cell koncentration av 500 000 celler/injektionsflaska och vid passagen p3 – p5).
- Placera en injektionsflaska med celler i en 1.0-cm-djupt vattenbad vid 37 ° C att tillåta upptining. Tina injektionsflaskan tills ungefär 70% av cell lösning är flytande. Torka av injektionsflaskan med 70% alkohol och placera injektionsflaskan i injektionsflaska rack inuti BSC.
Anmärkning: Se till att vatten inte kommer i kontakt med trådar eller locket på injektionsflaskan för att förhindra potentiella föroreningar under cell sådd. Förhindra komplett upptining av celler i vatten bad eftersom underlåtenhet att göra detta kan orsaka oavsiktlig celldöd.
- Placera en injektionsflaska med celler i en 1.0-cm-djupt vattenbad vid 37 ° C att tillåta upptining. Tina injektionsflaskan tills ungefär 70% av cell lösning är flytande. Torka av injektionsflaskan med 70% alkohol och placera injektionsflaskan i injektionsflaska rack inuti BSC.
- Dra ut 10 mL av media kompletteras med 10% fetalt bovint Serum (FBS). Använda en automatisk vi rekommenderar och 10 mL pipettspetsen som aspirerar till T75 vävnadsodling kolv. Låt media helt mätta basen av kolven genom att försiktigt skaka kolven fram och tillbaka.
- Öppna injektionsflaskan med cell-lager och aspirera lösning från injektionsflaskan, att vara uppmärksam på pipettering hastighet, som cellmembran blir sårbara från frysförvaring.
- Flytta celler till en T75 vävnad mätkolv med media. Mata ut tinade cell till vävnad kolv, igen att vara mindful av pipettering hastighet.
Obs: Sådd densitet av celler i vävnad kolv approximeras vara 6.600 celler/cm2. Seedning densitet kan ändras för att passa användaren och önskad tidpunkt för experimenterande. - Mäta ut 1 mL av media från T75 vävnad kolv och överföra volymen tillbaka in i injektionsflaskan. Överföra volym från injektionsflaskan tillbaka i T75 kolven.
Obs: Detta steg hjälper till att maximera cell avkastning från injektionsflaskan. - Dra åt vävnadsodling kolv locket och skaka försiktigt för att skingra celler i suspension jämnt över hela ytan. Kontrollera om jämn fördelning av celler med ett inverterat Mikroskop.
- Etikett-kolv med celltyp, datum, initialer, härstamning och syfte (t.ex., hDFn, 07/11/2018, NDC, Passage 4, arsenik Scratch Assay). Placera vävnadsodling kolven i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5,0% CO2 för 72 h.
Obs: Odlingsmedium bör ändrade 12-24 h efter initial sådd för att ta bort spårmängder av dimetyl sulfoxid (DMSO) cryopreservative och ändrade då varje 48 h efter det att säkerställa celler är korrekt näring. Ruvning och tillväxt perioden beror på det beräknade antalet celler behövs för scratch analysen. Dubblera tiden för hDFn celler är vanligtvis 16-24 h under normala förhållanden. Dock fördubbling kan ändras på grund av höjd, pH, temperatur, luftfuktighet, medellång typ, etc., och måste redovisas när du planerar experiment.
3. cell räknar och subkultur in 12-väl vävnaden kultur plattan
- Hämta T75 vävnadsodling kolven från inkubator. Observera klibbade celler med ett inverterat Mikroskop vid 10 X objektiv förstoring (100 X total förstoring) och fastställa ungefärlig cell sammanflödet.
- Skanna majoriteten av vävnadsodling kolven när observerar sammanflödet att säkerställa mest representativa procentandelen approximeras. Utvärdera enskilda Cellmorfologi för eventuella avvikelser eller bakterie eller svamp kontaminering.
- Montera den automatiska vi rekommenderar med en 10 mL pipettspetsen. Använd vi rekommenderar för att aspirera på full volym av media från T75 och överför lösningen till en avfallsbehållare. Förhindra att Pipettera tipset att kontakta vidhängande cellytan. Kassera pipettspetsen i en biohazard bin.
- Montera den automatiska vi rekommenderar med en 5 mL pipettspetsen. Aspirera 5 mL av den balanserad saltlösningen, fördela i kolven och skaka kolven för att spola överskott media, döda celler och avfallsprodukter.
- Rita volymen från T75 och fördela i avfallsbehållaren. Kassera pipettspetsen i biohazard bin.
- Montera den automatiska vi rekommenderar med en 5 mL pipett adapter. Aspirera 2 mL av trypsin från lager, fördela i kolven och skaka kolven för att skingra enzymet över de klibbade cellerna. Säkerställa fullständig mättnad av vidhäftande ytan. Placera kolven vävnad i inkubatorn för 2-3 minuter (min).
Obs: Den maximala enzym-substrat reaktionen bör inte överstiga 10 min. - Iaktta vävnad kolven under en inverterade Mikroskop på en 10 X objektiv förstoring (100 X total förstoring). Tillämpa skonsam vibrationer för att underlätta cell avlossning.
- Torka T75 kolven med 70% alkohol och plats inuti BSC.
- Montera den automatiska vi rekommenderar med en 5 mL pipettspetsen. Aspirera 5 mL av media från lager och lägga till T75 vävnad kolven att stoppa reaktionen enzym-substrat. Media: trypsin förhållandet bör vara 3:1. Pipettera upp och ner basen av kolven 2 - 3 gånger att skölja och säkerställa att reaktionen har slutat. Aspirera komplett volymen av vätska från kolven och överföring till en steril 15 mL koniska rör.
- Fyll ett andra 15 mL koniska rör med en identisk volym av media.
- Placera båda 15 mL koniska rör i en antipodiska position till en annan. Applicera 200 g av centrifugalkraften för 5 min vid 25° C genom att ange utrustningens löpande parametrar.
- Torka 15 mL koniska röret med pelleterat celler med 70% alkohol och placera inuti BSC.
- Använd den automatiska vi rekommenderar med en 5 mL anknytning till Pipettera av media, lämnar bakom cirka 250 µL vätska och cell pellet. Uppmärksamma platsen för Pipettera tipset, eftersom cellpelleten bör förbli opåverkade. Fördela den volym som samlas i en behållare och kassera spetsen i en biohazard bin.
- Använda en mikrocentrifug rör rack köra botten av koniska röret över injektionsflaskan slots, skapa en snabba vibrationer, för att störa och åter centrifugerade cell (kallas ibland ”rack kratta”).
Obs: Undvik att använda en vortex mixer för att utföra det här steget. Gravitation styrkor skapad av vortex blandare överskrider cell g-force tröskelvärden och kan orsaka lyseringslösning. När slutförts korrekt, visas den nya cell lösningen som en grumlig blandning med ingen kvarvarande pellet. Diligence utföra det här steget kommer ofta att skapa en enda cellsuspension, vilket leder till ökad noggrannhet när räknar celler. - Tillsätt 2 mL av media till cell lager eller resuspension. Pipettera cellerna försiktigt ner sidan av röret 20 gånger för att bryta upp eventuella klumpar. Spela in den totala cellvolym fjädring och avsätta kort.
- Pipettera 20 µL av Trypan blå lager (0,4%) använda en steril Pipettera till en tom brunn av en plattan med 96 brunnar.
- Blanda lager cell lösningen för att skapa en enhetlig cellsuspension före överföringen. Använd en steril Pipettera tips att ta bort 20 µL av cell lager (Undvik att vidröra röret väggarna). Lägga till de 20 µL av Trypan blå lösning i plattan med 96 brunnar.
- Pipettera försiktigt för att blanda innehållet. Pipettera 10 µL av blandningen mellan täckglaset och räkna avdelningen på hemocytometer.
- Iaktta cellerna och rutnätet under ett 10 X-objektiv. Följ nio stora rutor inom synfältet. Räkna celler endast i mitten och 4 hörn rutor (totalt 5 rutor).
Obs: Leta efter en jämn fördelning av celler över hela nätet för att säkerställa en korrekt räkna. - Stämmer alla celler (transparent och blå) i 5 identifierade rutorna i rutnätet. Separat, tally endast icke (blå) celler i samma 5 rutor.
- Beräkna livskraftig cell count använder:
där x = livskraftig celltal, en = totala celler, b = icke-viabla celler - Beräkna den livskraftiga cell densiteten med:
där x = livskraftig cell densiteten och y = summan av viabla celler. - Beräkna totalt viabla celler:
där x = totala viabla celler, y = livskraftig cell densiteten, f = cell suspension volym (mL). - Beräkna % cellviabilitet:
där x = procent cellernas viabilitet, y = viabla celler räknas på nätet, f = totala celler räknas på nätet.
- Markera en horisontell linje över botten av 12-väl plattan skall utgöra referenspunkter under imaging.
- Använd livskraftig cell densiteten (beräknat i 3.3.7) för att beräkna volymen av media att späda cell lager i för sådd en 12-väl vävnadsodling tallrik.
Obs: Cellen optimal sådd täthet för hDFn celler är 5 000 celler/cm2. - Späd cell lager till 19 000 celler/mL med hjälp av media och utsäde varje brunn med 1 mL av cell lager. Blanda cell lager regelbundet för att säkerställa jämn cell sådd över alla 12 brunnar.
- Märka varje platta med celltypen, härstamning, användaren initialer och syftet. Placera tallrikar i inkubator inställd på 37 ° C och 5,0% CO2. Tillåta celler att växa tills 100% sammanflödet uppnås för scratch assay.
- Använd livskraftig cell densiteten (beräknat i 3.3.7) för att beräkna volymen av media att späda cell lager i för sådd en 12-väl vävnadsodling tallrik.
4. arsenik (As) stamlösningar och beräkningar
- Späd natrium arsenite (NaAsO2) direkt i cell kultur media med 10% FBS vid arbetande koncentrationer av 10, 1,0, 0,1 och 0,01 µM som.
- För detta, göra en inledande 1 mM lager som lösning genom att späda ut 3,9 mg natrium arsenite till 30 mL av media. Seriellt späd 1 mM lager för de återstående som lösningar.
| 1000 µM som lager Beräkningar | Arsenik arbetar lager koncentrationer | M1V1= M2V2 | Volymen av tidigare arsenik lösning | Volymen av Media | Totala mängden arsenik arbetar lager |
| NaAsO2 molekylvikt: 129,9 g/mol | 10 µM som | (x mL) (1000 µM) = (30 mL)(10 µM) x = 0,3 mL | 0,3 mL = 300 µL av 1mM som lösning | 29,7 mL media | 30 |
| .03 L x.001 mol/L x 130 g/mol = 3,9 mg arsenik | 1,0 µM som | (x mL) (10 µM) = (30 mL)(1 µM) x = 3 mL | 3 mL 10 µM som lösning | 27 mL av media | 30 |
| Späd 3,9 mg natrium arsenite i 30 mL media | 0.1 µM som | (x mL) (1 µM) = (30 mL)(0.1 µM) x = 3 mL | 3 mL 1 µM som | 27 mL av media | 30 |
| 0,01 µM som | (x mL) (0.1 µM) = (30 mL)(0.01 µM) x = 3 mL | 3 mL 0,1 µM som | 27 mL av media | 30 |
Tabell 1. Arsenik bestånd och seriespädningar. Denna tabell förklarar de beräkningar som används för att skapa de As lagerföra lösningarna och arbetar stamlösningar för behandlingsgrupperna.
5. skrapa Assay teknik och arsenik föroreningar
- Skaffa en 12-well platta med celler från inkubatorn. Visa celler på en 10 X objektiv förstoring (100 X total förstoring). Bestämma cell sammanflödet inom varje brunn.
Obs: Varje enskild väl måste nå 100% sammanflödet före repor. Detta kritiska steg säkerställer enhetlighet inom analysen och hjälper standardisera test protokoll i experiment. Om eventuella brunnar inte har nått 100% sammanflödet, tillåta celler att Inkubera under ytterligare tid tills alla brunnar har nått 100% sammanflödet. Ytterligare tillväxt tid i brunnar som redan har nått 100% sammanflödet påverkas inte. Konfluenta celler kommer vanligtvis bli tillväxt greps och förbli som en enskiktslager kultur, samtidigt som sub konfluenta wells att nå 100% sammanflödet. - Montera en automatisk vi rekommenderar med en 10 mL pipettspetsen. Aspirera tillväxt medier ur alla brunnar. Släng volymen i flytande avfall och pipettspetsen i biologiska bin.
- Montera en p200 vi rekommenderar med en 1-200 µL sterilt spets. I varje brunn, producera en skråma ”mock sår” av glider spetsen över cellens yta från en 12-klockan till 6 klockan-plats.
Obs: Tre faktorer som kommer att kraftigt påverka konsistens är hastighet, trycket och spets vinkel. Scratch bör utföras snabbt, med ett konstant tryck, medan att vara mindful av tip vinkeln bor vinkelrät mot basen av plattan. Skrapa för långsamt kommer att orsaka krokiga linjer, övertryck kan permanent poäng cell vidhäftande ytor och en spets vinkel mindre än 90° kommer smala scratch bredd. Någon av dessa vanliga misstag kan resultera i ändrade migration priser och mönster. - Rensa bort överflödigt skräp och cell klumpar av sköljning med 1 mL av balanserad saltlösning per brunn. Rock den plattan till sidan-att underlätta tvätt. Ta bort den balanserad saltlösningen från brunnar och släng i en avfallsbehållare. Släng av 5 mL pipettspetsen i den biologiska bin.
- Montera en p200 vi rekommenderar med en 1-200 µL sterilt spets. I varje brunn, producera en skråma ”mock sår” av glider spetsen över cellens yta från en 12-klockan till 6 klockan-plats.
Figur 1: Schematisk bild av scratch analysens. Allt arbete sker inom en aseptiska fältet för att minska risken för kontaminering. Celler är seedade på en önskad täthet i vävnadsodling kolvar och odlas i en inkubator inställd på människans fysiologiska tillstånd (5% CO2, 37 ° C). På att nå en önskad sammanflödet, odlas celler aseptiskt sub i 12-väl vävnadsodling plattor på en önskad sådd densitet. Celler odlas 100% sammanflödet i varje brunn av 12-väl plattan och repade med hjälp av en steril Pipettera spets. Denna ”scratch” skapar ett in vitro- mock sår (betecknas med rubriken dubbelpil), där celler naturligt migrera för att stänga den öppna ytan. Vart väl kan vara unikt konditionerat och cellulära migration priser kan observeras och kvantifierade svar på olika behandling villkor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Använd vi rekommenderar att en p1000 med 1000 µL spets att Pipettera 1000 µL från arsenik bestånd i brunnar som har tilldelats slumpmässigt med en behandlingsgrupp. Använd ett nytt Pipettera tips för varje brunn för att förhindra korskontaminering. Registrera den tid när behandlingar läggs. Placera 12 brunnar i en inkubator inställd på 37 ° C och 5,0% CO2.
6. imaging
- Fånga bilder av varje brunn 10 X objektiv förstoring varje 4 h under 24 h (0, 4, 8, 12, 16, 20 och 24 h). Referera till den tidigare linje på botten av plattan till bild på samma plats längs scratch inom varje brunn på efterföljande tidpunkter.
Obs: Det är absolut nödvändigt att på samma platser är fotograferade vid varje tidpunkt att möjliggöra korrekta bildanalys och att erhålla representativa uppgifter.
7. bildanalys
- Ladda upp bilder som tagits på den inverterat ljusmikroskop till en dator och spara som en JPEG-bild med en detaljerad filnamn.
- Öppna ImageJ.
- Ladda upp en bild av en objektmikrometern med kända avstånd till programvara för att konvertera pixlar till millimeter (mm) när du tar bilden mätningar genom att dra och släppa filen i fönstret programvara.
Obs: Mikrometern bör ha linjer som avgränsar en känd 1 mm längd och bilden ska tas vid samma förstoring används för att fånga bilder av celler. Till exempel i denna studie bilder togs på 100 X total förstoring, togs alltså bilden av objektmikrometern på 100 X total förstoring.- Klicka på rak, segmenteradeeller Frihandslinjer alternativen.
- Rita en linje av känd distans på mikrometer bilden med en längd som är associerade till varje tick skalstrecken-märken. Rita en rak linje: Klicka musen, håll, dra markören till önskad plats och sedan släppa mus.
- Välj analysera sedan Ange skala.
- Ställa in Känt avstånd till kända längden av linjen dras i föregående steg.
- Ställa in längd mm.
- Globala kryssrutan.
- Välj OK för att avsluta menyn.
- Stäng av scenen mikrometer bilden.
- Ladda upp en repa test bild i ImageJ genom att dra och släppa bildfilen till fönstret.
- Rita en rak linje tvärs över scratch (från vänster framkant till höger framkant).
- Tryck på bokstaven M på tangentbordet för att spela in mätningen av den räta linje som dras. En liten resultatfönstret visas omedelbart efter att skriva bokstaven M. Detta är där bredd mätningen kommer att vara.
- Upprepa steg 7,4 sammanlagt 10 gånger för att få 10 mätningar längs längden av scratch.
Obs: Det är viktigt att generera mest representativt bredd värdena ner hela längden av scratch. Se till att rymden mätningar av 10 bredd lika längs längden av scratch från topp till botten. - Skapa en scratch assay kalkylbladsfil för att kopiera och klistra in mätningarna.
- Kopiera och klistra in de 10 Breddmätning från fönstret resultat i rätt kolumn i en kalkylbladsfil (tabell 2).
Obs: När mätningarna kopieras från fönstret resultat och klistras in i kalkylbladet, det kommer finnas främmande kolumner med värden. dessa värden bör utgå, bevara endast de 10 bredd mätningarna.
- Kopiera och klistra in de 10 Breddmätning från fönstret resultat i rätt kolumn i en kalkylbladsfil (tabell 2).
| 10 slumpmässiga bredd mätningar | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1 | |||||||
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | |||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | |||||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
| 10 | |||||||
| Genomsnitt av 10 mätningar |
Tabell 2. Ungefärlig bredd mått tabell format. Den här tabellen visar organisationsstrukturen för de råa mätningar som erhållits.
- Upprepa stegen ovan för resten av scratch test bilder.
- Beräkna medelvärdet för de 10 mätningarna vid varje tidpunkt (0-24 h) för varje brunn.
- Fastställa procent stängning beräkningar med hjälp av värden från steg 7,8.
- Skapa en tabell längst ned i kalkylbladet med titeln ”bredd mätning medelvärden” (tabell 3).
- Kopiera och klistra in raden Genomsnitt av 10 mätningar beräknas i steg 7,8 in tabellen ”Breddmätning genomsnitt”.
- Skapa en ny tabell bredvid tabellen Bredd mätning medelvärden . Titeln detta tabell Procent sår stängning (tabell 4).
Obs: Värdet i kolumnen 0 h för varje brunn bör vara 0 eftersom scratch är 0% stängd vid den inledande 0 h foton för alla brunnar. - Navigera till kolumnen Nästa över (4 h).
- Beräkna procent stängningen för 4, 8, 12, 16, 20 och 24 h tidpunkter:
där x = procent stängning, jag = inledande scratch bredd (0 h bredd), f = final scratch bredd (4, 8, 12, 16, 20 eller 24 h bredd).
| Bra bredd medelvärden | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3a | |||||||
| 4a | |||||||
| 1b | |||||||
| 2b | |||||||
| 3b | |||||||
| 4b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tabell 3. Breddmätning genomsnitt tabellformat. Den här tabellen visar organisationsstrukturen för de bredd mätning medelvärden beräknas med ungefärlig bredd mätningarna i tabell 2.
| Väl | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | 0 | ||||||
| 2a | 0 | ||||||
| 3a | 0 | ||||||
| 4a | 0 | ||||||
| 1b | 0 | ||||||
| 2b | 0 | ||||||
| 3b | 0 | ||||||
| 4b | 0 | ||||||
| 1c | 0 | ||||||
| 2c | 0 | ||||||
| 3c | 0 | ||||||
| 4c | 0 |
Tabell 4. Procent såret stängning tabellformat. Den här tabellen visar den organisatoriska strukturen för procent såret stängning värdena beräknas med hjälp av Breddmätning medelvärden i tabell 3.
- Skapa en ny tabell bredvid tabellen Procent sår stängning . Titeln detta tabell AUC (tabell 5).
- Beräkna den 0-4 h arean under kurvan (AUC) värde i 0-4 h kolumn för varje brunn:
där x = 0-4 h AUC-värdet, en = % stängning värde för 0 h, b = % stängning värde för 4 h, h = tiden mellan de två åtgärderna (4 h i denna studie). - Beräkna området 4-8 h under kurvan (AUC) värdet i kolumnen 4-8 h för varje brunn:
Där x = 4-8 h AUC-värde, en = % stängning värde för 4 h, b = % stängning värde för 8 h, h = tiden mellan de två åtgärderna (4 h i denna studie).
Obs: En AUC-värdet ska beräknas för varje 4 h tidsintervall under perioden 24 h för varje brunn. - Summera alla AUC värden från 0-24 h (beräknat i steg 7.10.1-7.10.2) för att få en sammanfattade AUC-värdet för varje brunn. Se till att dessa värden är ordentligt sparas för statistisk analys.
- Beräkna den 0-4 h arean under kurvan (AUC) värde i 0-4 h kolumn för varje brunn:
| Väl | 0-4 h | 4-8 h | 8-12 h | 12-16 h | 16-20 h | 20-24 h | Summerade AUC |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3a | |||||||
| 4a | |||||||
| 1b | |||||||
| 2b | |||||||
| 3b | |||||||
| 4b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tabell 5. AUC tabellformat. Den här tabellen visar den organisatoriska strukturen för AUC-värden beräknas med hjälp av procent sår stängning värdena i tabell 4.
8. statistisk analys
- Fastställa vilken statistisk analysmetod som bäst passar både experimentell design och summerade AUC-värden som erhålls under analysen.
Representative Results
Urvalsstorleken (n) för alla behandlingsgrupper var n = 28. Cellerna var framgångsrikt odlade följande aseptiska tekniker och lab protokoll (figur 1). Enhetlig repor observerades över alla behandlingsgrupper med genomsnittlig scratch bredden mäter 0.8 mm 0,4 mm (figur 2). Kontrollgruppen hade en genomsnittlig summerade arean under kurvan värdet av 1,355.83; 0,01 µM som behandlingsgrupperna hade i genomsnitt summerade arean under kurvan värdet av 1,366.21; 0.1 µM som behandlingsgrupperna 1,0 µM som behandlingsgrupp hade en genomsnittlig summerade arean under kurvan värdet av 1,326.24, och hade en genomsnittlig summerade arean under kurvan värdet av 1,295.10; och slutligen den 10 µM som behandlingsgrupp hade en genomsnittlig summerade arean under kurvan värdet av 535.12, som var statistiskt lägre jämfört med alla andra grupper (p < 0,05) (figur 3). R-program för statistisk analys användes för att köra en envägs ANOVA med en Tukey post hoc justering att fastställa statistiska skillnader mellan behandlingsgrupperna (p < 0,05).
Figur 2: representativa scratch test bilder under 20 h. Bilder A-D representerar cellulära migration control Cells; bilder E-H representerar cellulära migration av celler som smittats med 1,0 µM som; bilder jag-L representerar cellulära migration av celler som smittats med 10 µM som. Från dessa bilder är det klart att cellulära migration är långsammare i närvaro av arsenik. Kontroll bilderna visar en helt ”botad” repa efter 20 h, medan de andra två som-behandlingsgrupperna inte var ”läkt”. De 10 µM som behandling hämmas totalstopp alldeles efter 24 h. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: arsenik saktar cellulära migration i scratch analysens. Bilder fångades under 24 h att iaktta förändringar till cellulära migration priser i närvaro av varierande koncentrationer av arsenik. RAW-bilder analyserades med hjälp av en automatiserad programvara (t.ex., i MATLAB), som ursprungligen uppmätta såret bredd, därefter beräknas procent stängning och slutligen area under kurvan (AUC). Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet. Den 10 µM som behandlingsgrupperna statistiskt saktade cellulära migration av mänskliga dermal fibroblaster neonatal (hDFn), visar en statistiskt lägre AUC-värdet, jämfört med alla andra behandlingsgrupperna med en envägs ANOVA med en Tukey post hoc justering (p) < 0,05). Statistiska skillnader representeras av bokstäverna ”A” och ”B”, som erhölls genom att använda kompakta brev visningsmetoden tillgänglig i R-program. Behandlingar som inte delar ett gemensamt brev är statistiskt signifikant från varandra (p < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Tillämpningen av denna analys ger en hög genomströmning och snabb utvärdering av cellulära migration och direkt kan översätta till komplexa fysiologiska system5,6,7. Av denna anledning har den föreslagna bänk modellen trimmad och övade för att utvärdera effekterna av olika terapeutiska medel och miljögifter på sårläkning6. Koncentrationerna av arsenik som används i den aktuella studien ansågs miljörelevanta genom omfattande litteratursökning kända exponeringsnivåer och från retrospektiv genomgång av olika data baser14,15, 16,17,18,19,20,21. Användningen av denna i vitro scratch analys visat att exponering för en arsenik koncentrationen inom höga, men miljömässigt relevanta utbud, försenad sårslutning (cellular migration).
Denna bänk topp modell var också anställd att isolera och studera en enskild cell linje (fibroblast) för att ytterligare förstå hur fibroblast migration bidrar till att såret helande utfall. Dessutom är det svårt att studera funktionerna i en enskild cell linje i komplexa i vivo system med många andra celler och vävnader närvarande som kan störa analysen. Dessutom ger analysen ett medel att uppnå semikvantitativt procent såret stängning data som kan användas för att rikta specifika cellulära mekanismer genom vilka föreningar kan påverka sårläkningen. Till exempel celler används i scratch analysen kan samlas och lagras i en önskad reagens och används i genuttryck (signal mRNA) eller proteinuttryck analyser22. Denna information kan vara användbar till utredaren om de försöker förstå vad signaler eller proteiner kan i hög grad bidra till förändringar i cellulära migration i närvaro av varierande behandlingar (dvs, arsenik)22.
Mänskliga neonatal dermal fibroblaster valdes för detta arbete utifrån deras framträdande roll i sårläkning. Dock detta scratch test protokoll har genomförts med hjälp av olika celltyper och för en rad forskningsändamål. Till exempel har scratch analysen antagits inom området onkologi för att studera migration hämning av kemoterapi droger23; för skelettmuskulaturen cellmigration, proliferation och diffusion24; att studera effekten av växtextrakt på cellulära migration25; och för att förstå hur keratinocyter migration och spridning bidra till såret helande9. Dessutom utvärderat en tidigare papper av Pinto o.a. effekterna av uran (U) och trombocyter-rich plasma (PRP) på hDFn migrering med scratch test6. Syftet med detta arbete var att förstå den utsträckning som denna analys kunde testa effekten av en agent som trodde att sakta cellulära migration (U), liksom en agent som tros påskynda cellulära migration (PRP). Som kan ses i ovannämnda arbete och forskning av andra utredare, tillämpningen av scratch analysen har hög potential för användning i olika experimentella modeller26. Trots den detalj som tillhandahålls inom metoderna, bör det förväntas variansen mellan utredare och experiment. Till exempel varierar cellulära migration priser sannolikt baserat på raden cell används, förutom de nödvändiga mikronäringsämnen behövs för unika celltyper. Många av de viktiga yttranden till stöd i cell avkastning och lönsamhet är listade som anteckningar i hela detta protokoll. Det rekommenderas dock starkt att utredarna följer tillverkarens rekommendationer för optimal tillväxt villkorar, och att använda denna metod som kompletterande anvisning för allmänna cell kulturarbete.
Även om scratch analysen är extremt mångsidig för studie av cellulär aktivitet; oförutsedda fel kan uppstå i mätteknik. Till exempel när du använder ImageJ att manuellt spåra cell migration fronter, kan variation finnas bland användare, vilket kan begränsa noggrannhet och representativa datainsamling. Det bör också noteras att migration fronter ska läsas dubbelblind behandling att minimera användaren bias. Dessutom kan manuellt identifiera migration fronter resultera i felberäkning av genomsnittliga körsträcka på grund av pseudopod bildandet av celler och deras förmåga att nå ut till formuläret fokal sammanväxningar, som kan vara visuellt vilseledande. På samma sätt, användning av fluorescerande ”cell tracker” färgämnen på cellens yta eller nukleära proteiner att upptäcka migration kan oavsiktligt fixa celler vilket leder till felaktigheter vid mätning av cellulära migration över tid. Det rekommenderas att lämpliga positiva och negativa kontroller vara inskrivna inom experimentet att helt bedöma effekten av behandling på cell linjer. Bruket av denna analys måste slutföras som ett erkännande av dess begränsningar. Denna analys garanterar inte att cellulära migration resultat från in vitro experiment kommer att direkt översätta till i vivo resultat. Såret helande och cellulära migration i ett komplex levande system innebär en mängd celltyper och molekylära signaler. som alla har potential att påverka helande svar.
Sammanfattningsvis, har scratch analysen visat sig ge hög genomströmning screening av cellulära migration som svar på förändrade miljöer6,25. Vi utnyttjade specifikt detta protokoll för att identifiera förändringar i cellulära migration till följd av arsenikexponering vid olika miljömässigt relevanta doser. Dessa data har motiverat att använda scratch analysen vidare studium och utvärdera de mekanistiska vägarna i cellulära migration i denna analys och hur dessa vägar ändras med arsenikexponering.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Institute on minoritet hälsa och hälsa skillnader av det nationella Institutes of Health under Award nummer U54MD012388. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
| Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
| Water Bath | Precision | Model 182 | |
| Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
| CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
| Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
| Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
| Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
| p200 Pipette | Gilson | ||
| p20 Pipette | Gilson | ||
| Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
| T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
| 15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
| 50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
| 5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Tissue Marker | Securline | 92167 | |
| Wipes | Kintech | 34155 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
| Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
| Bleach | Great Value | 220-04 | |
| 96-well | Falcon | 353915 | |
| Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
| Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
| Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
| 12-well plate | Corning | 3598 | |
| Waste Beaker | n/a | n/a | |
| 1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
| Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
| Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
| Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
| Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |
References
- Diegelmann, R., Evans, M. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing. Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).
- Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. Novel insights into wound healing sequence of events. Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).
- Michelson, A. Platelets. , 3rd edition, Waltham, Massachusetts. (2013).
- Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations. American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).
- Liang, C., Park, A., Guan, J. In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. , 329-333 (2007).
- Pinto, B., et al. A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied. In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).
- Pinto, B., et al. Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model. Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).
- Roubelakis, M., et al. Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).
- Shibata, S., et al. Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway. Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).
- Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. Cellular aspects of wound healing. Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).
- Gentry, P. R., Clewell, H. J. III, Greene, T. B., et al. The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).
- Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media. International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).
- Robertson, F. N. Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States. Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).
- Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA. Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).
- Uhlman, K. Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics. , The University of Arizona. Tucson, AZ. Arizona Cooperative Extension, AZ 1453 (2008).
- Agusa, T., et al. Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam. Science of the Total Environment. , 488-489, 562-569 (2014).
- Ayotte, J. D., et al. Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States. Science of the Total Environment. , (2014).
- Dummer, T. J., et al. Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada. Science of the Total Environment. , (2014).
- Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations. Water Research. 48, 156-169 (2014).
- Beamer, P. I., et al. Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).
- Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).
- Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. Optimization of cell motility evaluation in scratch assay. Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).
- Harishkumar, M., et al. Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract. BioMed Research International. 13, Article ID 963457, 8 pages (2013).
- Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay? Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).
