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Chemistry

पाली की तैयारी (pentafluorophenyl acrylate) कार्यात्मक सिइओ2 मोती प्रोटीन शुद्धि के लिए

Published: November 19, 2018 doi: 10.3791/58843
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2KI for Health Science and Technology (KIHST), Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

ERRATUM NOTICE

Summary

पाली (pentafluorophenyl acrylate) की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल (पाली (PFPA)) भ्रष्टाचारी सिलिका मोती प्रस्तुत किया है । पाली (PFPA) कार्यात्मक सतह तो एंटीबॉडी के साथ मैटीरियल है और immunoprecipitation के माध्यम से प्रोटीन जुदाई के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया ।

Abstract

हम पाली (pentafluorophenyl acrylate) (पाली (PFPA)) एंटीबॉडी स्थिरीकरण और बाद में immunoprecipitation (आईपी) आवेदन के लिए भ्रष्टाचारी सिलिका मोतियों तैयार करने के लिए एक सरल विधि का प्रदर्शन । पाली (PFPA) भ्रष्टाचार सतह एक सरल दो कदम प्रक्रिया के माध्यम से तैयार किया जाता है । पहले चरण में, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) सिलिका की सतह पर एक linker अणु के रूप में जमा किया जाता है । दूसरे चरण में, पाली (PFPA) homopolymer, प्रतिवर्ती अतिरिक्त और विखंडन श्रृंखला हस्तांतरण (बेड़ा) बहुलकीकरण के माध्यम से संश्लेषित, पर pentafluorophenyl (PFP) इकाइयों के बीच विनिमय प्रतिक्रिया के माध्यम से लिंकर अणु को भ्रष्टाचारी है बहुलक और APTES पर अमीन समूहों । सिलिका कणों पर APTES और पाली (PFPA) का जमाव एक्स-रे photoelectron स्पेक्ट्रोस्कोपी (XPS) द्वारा पुष्टि कर रहे हैं, साथ ही साथ गतिशील प्रकाश कैटरिंग (DLS) के माध्यम से मापा कण आकार परिवर्तन द्वारा निगरानी की । मोतियों की सतह hydrophilicity में सुधार करने के लिए, अमीन-कार्यात्मक पाली (ईथीलीन ग्लाइकोल) (अमीनो-खूंटी) के साथ पाली (PFPA) के आंशिक प्रतिस्थापन भी किया जाता है । खूंटी के स्थानापन्ना पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी सिलिका मनका तो आईपी आवेदन के लिए एंटीबॉडी के साथ मैटीरियल हैं. प्रदर्शन के लिए, एक एंटीबॉडी के खिलाफ प्रोटीन कळेनासे आरएनए-सक्रिय (PKR) कार्यरत है, और आईपी दक्षता पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित किया जाता है । विश्लेषण परिणाम बताते है कि एंटीबॉडी मैटीरियल मोती वास्तव में PKR को समृद्ध किया जा सकता है, जबकि गैर विशिष्ट प्रोटीन बातचीत कम कर रहे हैं ।

Introduction

प्रतिक्रियाशील बहुलक ब्रश हाल के वर्षों में बहुत रुचि प्राप्त की है । वे जैविक या अकार्बनिक पदार्थों पर कार्यात्मक अणुओं को स्थिर बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जैसे पता लगाने और जुदाई1,2,3,4के रूप में क्षेत्रों में आवेदनों के साथ सतहों सक्रिय, 5. प्रतिक्रियाशील पॉलिमर के अलावा, उन pentafluorophenyl एस्टर इकाइयों युक्त विशेष रूप से hydrolysis6की ओर अमीन और प्रतिरोध के साथ अपने उच्च जेट के कारण उपयोगी होते हैं । ऐसा ही एक बहुलक पाली (PFPA) है, और यह आसानी से कार्यात्मक हो सकता है के बाद प्राथमिक या माध्यमिक अमीन से युक्त अणुओं के साथ बहुलकीकरण7,8,9,10। एक उदाहरण में, पाली (PFPA) ब्रश एमिनो-spiropyrans के साथ प्रकाश उत्तरदायी सतहों7बनाने के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की गई ।

पाली (PFPA) की तैयारी और इसके आवेदनों में पिछले प्रकाशनों की संख्या6,7,8,9,10,11,12 बताई गई है ,13,14,15,16,17। विशेष रूप से, Theato और सह कार्यकर्ताओं पाली के संश्लेषण की सूचना (PFPA) दोनों "के लिए भ्रष्टाचार" और "से" तरीकों7,8,10,11,12 के माध्यम से कलम बांधने की ब्रश . "" के दृष्टिकोण को भ्रष्टाचार में, एक पाली (methylsilsesquioxane)-पाली (pentafluorophenyl acrylate) (पाली (MSSQ-PFPA)) संकर बहुलक8,10,11,12संश्लेषित किया गया था । पाली (MSSQ) घटक विभिन्न कार्बनिक और अकार्बनिक सतहों के एक नंबर के साथ मजबूत आसंजन के रूप में सक्षम था, इस प्रकार पाली (PFPA) घटक लेपित सामग्री सतह पर एक ब्रश परत बनाने के लिए अनुमति । "से" दृष्टिकोण में भ्रष्टाचार, सतह प्रतिवर्ती इसके अलावा शुरू की और विखंडन श्रृंखला हस्तांतरण (SI-बेड़ा) बहुलकीकरण पाली (PFPA)7ब्रश तैयार करने के लिए कार्यरत था । इस मामले में, एक सतह मैटीरियल चेन स्थानांतरण एजेंट (SI-CTA) पहले सिलिका-silane प्रतिक्रिया के माध्यम से सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न covalently था । इसके बाद मैटीरियल एसआई-CTA ने PFPA मोनोमर के एसआई-बेड़ा बहुलकीकरण में भाग लिया, जो सब्सट्रेट को स्थिर PFPA लिंकेज के साथ घनी खचाखच पाली (आबंध) ब्रश पैदा करते हैं ।

पाली (PFPA) SI-बेड़ा बहुलकीकरण के माध्यम से संश्लेषित ब्रश का उपयोग करके, हम हाल ही में पाली पर एंटीबॉडी के स्थिरीकरण का प्रदर्शन (PFPA) भ्रष्टाचारी सिलिका कणों और उनके प्रोटीन शुद्धिकरण में बाद में आवेदन18. पाली (PFPA) एंटीबॉडी के लिए ब्रश का उपयोग आईपी के माध्यम से वर्तमान प्रोटीन जुदाई से जुड़े मुद्दों की एक संख्या को हल करने के लिए पाया गया था । पारंपरिक आईपी एंटीबॉडी स्थिरीकरण के लिए एक लिंकर के रूप में प्रोटीन ए/जी के उपयोग पर निर्भर करता है19,20,21। प्रोटीन के उपयोग के बाद से एक/जी एंटीबॉडी एक विशिष्ट अभिविंयास के साथ संलग्न करने के लिए अनुमति देता है, उच्च लक्ष्य प्रतिजन वसूली दक्षता हासिल की है । हालांकि, प्रोटीन का उपयोग एक/जी गैर विशिष्ट प्रोटीन बातचीत से ग्रस्त है और साथ ही प्रोटीन वसूली के दौरान एंटीबॉडी के नुकसान, दोनों जिनमें से पृष्ठभूमि शोर के एक उच्च स्तर पर योगदान करते हैं । इन कमियों को हल करने के लिए एक ठोस समर्थन के लिए एंटीबॉडी के प्रत्यक्ष crosslinking22,23,24का पता लगाया गया है । इस तरह की तकनीक की दक्षता आमतौर पर crosslinked एंटीबॉडी के यादृच्छिक अभिविन्यास के कारण कम है. पाली (PFPA) के लिए भ्रष्टाचार सब्सट्रेट, एंटीबॉडी के स्थिरीकरण, PFP इकाइयों और एंटीबॉडी पर अमीन कार्यक्षमताओं के बीच विनिमय प्रतिक्रिया के माध्यम से प्राप्त की स्थायी है । हालांकि एंटीबॉडी उंमुखीकरण अभी भी यादृच्छिक है, कई प्रतिक्रियाशील PFP साइटों होने से प्रणाली लाभ, बहुलकीकरण की डिग्री के द्वारा नियंत्रित । इसके अलावा, हमने दिखाया है कि अमीनो के साथ PFP इकाइयों के आंशिक प्रतिस्थापन से खूंटी, सतह hydrophilicity, देखते जा सकता है और18प्रणाली के प्रोटीन रिकवरी दक्षता में सुधार । कुल मिलाकर, पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी सिलिका कणों उचित दक्षता के साथ ही बहुत क्लीनर पृष्ठभूमि के साथ पारंपरिक आईपी के लिए एक प्रभावी विकल्प होने के लिए दिखाए गए थे.

इस योगदान में, हम एंटीबॉडी स्थिरीकरण और आईपी आवेदन के लिए पाली (PFPA) भ्रष्टाचार सतह तैयार करने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति की रिपोर्ट । एक सरल दो कदम प्रक्रिया में, के रूप में चित्रा 1में सचित्र, एक APTES linker अणु पहले सिलिका सतह पर जमा है, तो पाली (PFPA) बहुलक पर PFP इकाइयों के बीच प्रतिक्रिया के माध्यम से लिंकर अणु से जुड़ी covalently है बहुलक और APTES पर अमीन कार्य करता है । इस तैयारी विधि एक सब्सट्रेट सतह करने के लिए पाली (PFPA) के स्थायी crosslinking के लिए अनुमति देता है, लेकिन एसआई-CTA संश्लेषण और पाली (PFPA) ब्रश के एसआई-बेड़ा बहुलकीकरण के साथ जुड़े कई जटिलताओं से बचा जाता है । अमीनो-खूंटी के साथ PFP इकाइयों के आंशिक प्रतिस्थापन अभी भी प्रदर्शन किया जा सकता है, की अनुमति ठीक बहुलक ब्रश सतह संपत्तियों की ट्यूनिंग । हम पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी सिलिका मोती इस प्रकार तैयार एंटीबॉडी के साथ स्थिर किया जा सकता है और आईपी के माध्यम से प्रोटीन संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया दिखा । विस्तृत मनका तैयारी प्रक्रिया, एंटीबॉडी स्थिरीकरण, और आईपी परीक्षण इस लेख में प्रलेखित हैं, पारंपरिक प्रोटीन के लिए एक विकल्प की मांग में रुचि पाठकों के लिए एक/

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Protocol

1. पॉली (PFPA) Homopolymer की तैयारी

  1. AIBN का पुनर्क्रिस्टलीकरण
    1. एक २५० मिलीलीटर चोंच में मेथनॉल के 25 मिलीलीटर के साथ 2, 2 '-azobis (2-methylpropionitrile) (AIBN) के 5 जी गठबंधन । एक ६० ° c तेल स्नान में चोंच विसर्जित कर दिया, तो तेजी से एक बार हलचल के साथ मिश्रण हलचल जब तक AIBN पूरी तरह से भंग है ।
    2. फिल्टर कागज (5-8 माइक्रोन कण प्रतिधारण) के माध्यम से गर्म समाधान फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर छानने का स्टोर करने के लिए क्रिस्टल धीरे फार्म की अनुमति है ।
    3. निस्पंदन द्वारा क्रिस्टलीय AIBN ले लीजिए । ताजा मेथनॉल के 25 मिलीलीटर के साथ एकत्र उत्पाद को संयोजित करें और फिर से क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया दोहराएं ।
    4. सूखी एक वैक्यूम ओवन में कमरे के तापमान (आरटी) रातोंरात में 2x recrystalliz । उत्पाद को <-10 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत करना ।
  2. benzyl dithiobenzoate का संश्लेषण25
    1. एक ५०० मिलीलीटर तीन गर्दन गोल नीचे एक चुंबकीय हलचल बार, एक भाटा संघनित्र, एक छोड़ने कीप, और एक रबर पट से सुसज्जित कुप्पी तैयार करें । भाटा संघनित्र के माध्यम से नाइट्रोजन गैस लाइन के लिए कुप्पी कनेक्ट और नाइट्रोजन के साथ अंदर हवा बाहर फ्लश । पट के माध्यम से एक थर्मामीटर डालें । एक ही पट के माध्यम से एक सिरिंज के माध्यम से tetrahydrofuran (THF) में phenylmagnesium ब्रोमाइड के 1 मीटर समाधान के ४१ मिलीलीटर (०.०४१ मॉल) जोड़ें ।
    2. एक तेल स्नान में ४० ° c के लिए phenylmagnesium ब्रोमाइड समाधान गर्म । फिर गिराने कीप धीरे के माध्यम से कार्बन डाइसल्फ़ाइड के ३.१ जी (०.०४१ मॉल) जोड़ें, ४० डिग्री सेल्सियस पर समाधान तापमान बनाए रखने.
    3. 15 मिनट से अधिक छोड़ने कीप के माध्यम से परिणामी मिश्रण करने के लिए benzyl ब्रोमाइड के ७.१ जी (०.०४२ मॉल) जोड़ें. ५० डिग्री सेल्सियस के लिए प्रतिक्रिया तापमान बढ़ाएँ. ४५ मिनट के लिए इस तापमान पर सरगर्मी जारी रखें ।
    4. एक विभाजक कीप में प्रतिक्रिया मिश्रण हस्तांतरण और बर्फ के ठंडे पानी की 15 मिलीलीटर के साथ पतला । diethyl ईथर के 15 मिलीलीटर जोड़ने और कम पानी परत को हटाने के द्वारा उत्पाद निकालें । diethyl ईथर के साथ निष्कर्षण दो बार दोहराएं ।
    5. पानी की प्रचुर मात्रा के साथ संयुक्त कार्बनिक चरणों धो, तो नमकीन पानी (५०% (डब्ल्यू/वी) NaCl के समाधान) और निर्जल मैग्नीशियम सल्फेट पर उत्पाद सूखी ।
    6. ३५ डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम में विलायक निकालें एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग कर ।
    7. सिलिका जेल (ताकना आकार ६० Å, 63-200 मेष कण आकार) और eluent के रूप में पेट्रोलियम ईथर के ४०० मिलीलीटर का उपयोग कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा उत्पाद शुद्ध, लाल तेल के रूप में benzyl dithiobenzoate (BDB) के 5 जी उपज । 1 एच एनएमआर (४०० मेगाहर्ट्ज, CDCl3) द्वारा उत्पाद शुद्धता की पुष्टि करें: δ 8.02-7.99 (2H, एम), 7.55-7.50 ( १, एम), 7.41-7.29 (7H, एम), ४.६० (2H, एस).
  3. पाली का संश्लेषण (PFPA) वाया बेड़ा बहुलकीकरण9,26
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध PFPA मोनोमर अवरोधकों की छोटी राशि शामिल हैं । बहुलकीकरण से पहले, बुनियादी एल्यूमिना के साथ पैक एक डिस्पोजेबल सिरिंज के माध्यम से मोनोमर गुजर द्वारा अवरोधकों को हटा दें ।
    2. जोड़ें ०.४ मिलीग्राम (०.००२४ mmol) के पुनः क्रिस्टलीय AIBN, ४.३ मिलीग्राम (०.०१८ mmol) के BDB, १०१२ मिलीग्राम (४.२५ mmol) के अवरोधक मुक्त PFPA, और निर्जल anisole के ०.७ मिलीलीटर एक 20 मिलीलीटर Schlenk कुप्पी के लिए ।
    3. कुप्पी को Schlenk लाइन से कनेक्ट करें और degas के साथ मिश्रण को कम से तीन फ्रीज-पम्प-गल चक्र में जोड़ें । संक्षेप में, एक तरल नाइट्रोजन स्नान में प्रतिक्रिया मिश्रण फ्रीज । headspace में गैस को निकालने के लिए वैक्यूम लागू करें । कुप्पी सील तो तरल नाइट्रोजन से दूर आरटी पर गल सामग्री की अनुमति के लिए ।
    4. एक ७० डिग्री सेल्सियस तेल स्नान में कुप्पी प्लेस, और 4 N के तहत एच2 पर्ज करें के लिए प्रतिक्रिया ।
    5. प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए, तेल स्नान से कुप्पी हटाने और प्रतिक्रिया सामग्री हवा को बेनकाब ।
    6. ठंड मेथनॉल में बहुलक हाला, तो एक निर्वात ओवन में ४० डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बरामद बहुलक सूखी ।
    7. बहुलक आणविक वजन को मापने के लिए, जेल permeation क्रोमैटोग्राफी (GPC) का उपयोग करें । एक 1 मिलीलीटर/न्यूनतम प्रवाह दर के साथ ३५ ° c पर मोबाइल चरण के रूप में THF का उपयोग करें और monodisperse polystyrene मानकों का उपयोग अंशांकन वक्र का निर्माण । GPC माप प्राप्त करने के लिए, THF में बहुलक भंग (1-2 मिलीग्राम/एमएल) और ०.२ माइक्रोन डिस्पोजेबल polytetrafluoroethylene (PTFE) फिल्टर के माध्यम से फिल्टर । GPC साधन में नमूने के १०० μL सुई । polystyrene अंशांकन वक्र का उपयोग कर आणविक वजन के लिए मापा नमूना प्रतिधारण समय कन्वर्ट ।

2. पाली की तैयारी (PFPA) कार्यात्मक सिइओ2 मोती

  1. APTES के साथ सिइओ2 मोतियों का उपचार
    1. सिइओ2 कणों एक 5% के रूप में उपलब्ध है (w/v) जलीय निलंबन । सिइओ2 के ०.८ मिलीलीटर का मिश्रण के साथ ४० मिलीग्राम APTES और मेथनॉल के 8 मिलीलीटर एक 20 मिलीलीटर में एक बार हलचल के साथ सुसज्जित शीशी ।
    2. जोरदार सरगर्मी के साथ 5 एच के लिए आर टी पर आगे बढ़ने के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति दें ।
    3. एक शंकु ट्यूब के लिए समाधान स्थानांतरण । APTES कार्यात्मक सिइओ2 मोतियों को अलग करने के लिए, 5 मिनट के लिए १०,००० x g पर समाधान केंद्रापसारक, तो supernatant हटा दें । ताजा मेथनॉल के ३ मिलीलीटर में पुनः फैलाकर मोतियों को धोकर सुखा लें. मिश्रण के लिए हाथ से ट्यूब शेक, लेकिन यदि आवश्यक हो, कुछ सेकंड के लिए एक पानी के स्नान में sonication द्वारा फैलाव में सुधार होगा । 5 मिनट के लिए १०,००० x g पर मोतियों की supernatant निकालें और एक बार धोने कदम दोहराएं ।
    4. dimethyl sulfoxide (DMSO) के 3 मिलीलीटर के साथ मेथनॉल धोया सिइओ2 मोतियों का मिश्रण । मिश्रण हाथ से हिला, या यदि कुछ सेकंड के लिए आवश्यक sonicate, जब तक मोती पूरी तरह से DMSO में फैला रहे हैं । 5 मिनट के लिए १०,००० x g पर मोती केंद्रापसारक, तो supernatant निकालें । मेथनॉल से DMSO को पूरा विलायक विनिमय सुनिश्चित करने के लिए कदम दोहराएं ।
      नोट: अंतिम निलंबन APTES कार्यात्मक सिइओ2 DMSO के 4 मिलीलीटर में फैलाया मोती शामिल हैं ।
    5. कण आकार वितरण की जांच करने के लिए, DLS विश्लेषण निष्पादित करें । एक डिस्पोजेबल यूवी cuvette में कदम 2.1.4 और जगह में तैयार निलंबन की एक बूंद ले लो । ताजा DMSO के साथ cuvette भरने जब तक यह 2/3 भरा है नमूना द्वारा पतला । डेटा प्राप्ति शुरू करने के लिए सेल धारक में नमूना डालें । कण आकार माप के लिए, निम्न सेटअप पैरामीटर का उपयोग करें: तापमान: 25 ° c; Equilibration समय: १२० s; मापन अवधि: स्वचालित ।
    6. सतह संरचना की जांच करने के लिए, XPS विश्लेषण निष्पादित करें । रात में ४० डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम ओवन में स्टेप 2.1.4 में तैयार सस्पेंशन से एक छोटा सा नमूना सुखा लें । सूखे बहुलक ले लो और एक ०.५ cm x ०.५ सेमी नमूना धारक पर समान रूप से पैक । उच्च वैक्यूम चैंबर (10-8 torr) में नमूना लोड और डेटा अधिग्रहण शुरू करते हैं । विशेष XPS साधन के लिए इस्तेमाल किया, 15 केवी और ६.७ mA में संचालित एक रंग अल Kα एक्स-रे का उपयोग कर photoelectrons उत्पन्न, और उच्च संकल्प स्पेक्ट्रा के लिए एक ५० ev दर्रा ऊर्जा पर विश्लेषक के साथ संकर मोड आवर्धन का उपयोग कर इकट्ठा, और एक १०० ev पास ऊर्जा मौलिक सर्वेक्षण के लिए ।
  2. APTES कार्यात्मक सिइओ2 मोतियों की पाली (PFPA) भ्रष्टाचार
    1. पाली (PFPA) के 20 मिलीग्राम को भंग करके पाली (PFPA) समाधान तैयार करें DMSO के 2 मिलीलीटर में एक 20 मिलीलीटर की शीशी में ।
      नोट: इस अध्ययन में, एक अपेक्षाकृत कम आणविक वजन पाली (PFPA) (20 किलो/ इस प्रकार, उच्च बहुलक एकाग्रता के बावजूद (10 मिलीग्राम/एमएल), बहुलक crosslinking का कोई सबूत नहीं मनाया जाता है । यदि एक उच्च आणविक वजन बहुलक का उपयोग किया जाता है, तो बहुलक समाधान एकाग्रता संभव crosslinking से बचने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
    2. पाली (PFPA) समाधान करने के लिए DMSO (चरण 2.1.4 से) में निलंबित APTES कार्यात्मक सिइओ2 मोतियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें । जोरदार सरगर्मी के साथ 1 एच के लिए आरटी पर प्रतिक्रिया ।
    3. अलग पाली (PFPA) सिइओ 5 मिनट के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा2 मोतियों की कलम, supernatant के हटाने के बाद । या तो हाथ या sonication के कुछ सेकंड के साथ मिलाते हुए DMSO और मिश्रण के 3 मिलीलीटर जोड़कर मोतियों को धो लें । 5 मिनट के लिए १०,००० x g पर मोती केंद्रापसारक, तो supernatant निकालें । पाली की धुलाई दोहराएं (PFPA) दो बार DMSO के साथ सिइओ2 मोतियों की कलम ।
    4. मोतियों को दो गुना अधिक बार ट्रिपल आसुत जल (TDW) से धोएं । इस चरण में, TDW के 3 मिलीलीटर के साथ मोती गठबंधन है, तो हाथ या sonication के कुछ सेकंड के साथ मिलाते हुए मिश्रण से । 5 मिनट के लिए १०,००० x g पर मोती केंद्रापसारक, तो supernatant निकालें ।
    5. कण आकार वितरण की जांच करने के लिए, चरण 2.1.5 में वर्णित कार्यविधि का पालन DLS करें । सतह रसायन विज्ञान की जांच करने के लिए, चरण 2.1.6 में वर्णित कार्यविधि के बाद XPS निष्पादित करें ।

3. सिइओ2 मोतियों की तैयारी खूंटी के साथ भ्रष्टाचारी-स्थानापन्न पाली (PFPA)

  1. पाली (PFPA) समाधान तैयार करने के लिए, एक 20 मिलीलीटर की शीशी में DMSO के 2 मिलीलीटर में पाली (PFPA) के 20 मिलीग्राम भंग ।
  2. खूंटी समाधान तैयार करने के लिए, DMSO के 1 मिलीलीटर में अमीन-कार्यात्मक खूंटी भंग । इस्तेमाल किया खूंटी की सटीक राशि PFP प्रतिस्थापन के वांछित डिग्री, नीचे दिखाए गए समीकरण द्वारा निर्धारित द्वारा निर्धारित होता है:
    अमीनों की राशि-खूंटी (g/g-पाली (PFPA)) = (N_poly (PFPA) x% खूंटी-उप) x (MW_PEG/MW_poly (PFPA))
    जहाँ N_poly (PFPA) = पाली (PFPA) बहुलकीकरण की उपाधि
    % खूंटी-उप = प्रतिशत खूंटी प्रतिस्थापन
    MW_PEG = अमीनों का आणविक भार-खूंटी
    MW_ पाली (PFPA) = पाली का आणविक भार (PFPA)
  3. पाली (PFPA) समाधान के लिए खूंटी समाधान स्थानांतरण । जोरदार सरगर्मी के साथ 1 एच के लिए आरटी पर प्रतिक्रिया ।
  4. APTES कार्यात्मक सिइओ2 मोतियों DMSO में निलंबित तैयार करने के लिए, चरण २.१ में दिखाए गए एक ही चरणों का पालन करें । चरण ३.३ में तैयार खूंटी प्रतिस्थापित पाली (PFPA) समाधान में मनका निलंबन के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण । पाली के बीच भ्रष्टाचार की अनुमति दें (PFPA) और APTES कार्यात्मक सिइओ2 मोतियों जोरदार सरगर्मी के साथ 1 एच के लिए आर टी पर आगे बढ़ना ।
  5. 5 मिनट के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा मोतियों को अलग, supernatant के हटाने के द्वारा पीछा किया । या तो हाथ या sonication के कुछ सेकंड के साथ मिलाते हुए DMSO और मिश्रण के 3 मिलीलीटर जोड़कर मोतियों को धो लें । 5 मिनट के लिए १०,००० x g पर मोती केंद्रापसारक, तो supernatant निकालें । DMSO धो दो बार दोहराएं ।
  6. मोतियों को धोकर दो गुना अधिक TDW के साथ लें. इस चरण में, 3 मिलीलीटर TDW के साथ मोती गठबंधन है, तो हाथ या sonication के कुछ सेकंड के साथ मिलाते हुए मिश्रण से । 5 मिनट के लिए १०,००० x g पर मोती केंद्रापसारक, तो supernatant निकालें ।
  7. एक वैक्यूम ओवन में ४० ° c पर मोती रात भर सूखी ।

4. पाली (PFPA) पर एंटीबॉडी स्थिरीकरण सिइओ2 मोती

नोट: एक ही प्रक्रिया पाली (PFPA) पर प्रतिशत खूंटी प्रतिस्थापन की परवाह किए बिना किया जाता है । TDW में पंजाबियों गोली भंग करके फास्फेट बफर खारा (पंजाब) तैयार करें. तैयार ०.१% (v/v) फॉस्फेट के बीच के साथ खारा बफर-20 (PBST) के बीच के 1/1000 जोड़कर-पंजाब के लिए 20 ।

  1. जोड़ें 5 पाली के एमजी (PFPA) एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए सिइओ2 मोतियों की कलम की ।
  2. पंजाब के ८०० µ l को जोड़कर मोतियों को धोकर अच्छी तरह से भंवर करके मिक्स कर लीजिए. 1 मिनट के लिए आर टी में १०,००० x g पर मोती केंद्रापसारक । supernatant निकालें और तीन बार धो चरण दोहराएं ।
  3. ताजा पंजाब के ३५० µ l को जोड़ें, ५० µ l ०.१% (v/v) PBST, और एंटीबॉडी के ६.६७ µ g । 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर ~ 20 एच मशीन ।
  4. मनका धो असीम एंटीबॉडी को दूर करने के लिए । 1 मिनट के लिए ४०० x g और 4 ° c पर मोती केंद्रापसारक । supernatant निकालें और lysis बफ़र के ४०० µ l को सावधानीपूर्वक जोड़ें । धीरे से pipetting ऊपर और पांच बार के लिए नीचे से मोतियों को फिर से निलंबित ।
    नोट: Lysis के मोतियों को धोने के लिए इस्तेमाल किया बफर एक ही सेल Lysis और आईपी के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए, सिवाय इसके कि dithiothreitol के अलावा और चिढ़ाना अवरोधक वैकल्पिक हैं, (चरण 5 देखें) ।
  5. इस वॉश स्टेप को तीन बार दोहराएं । अंतिम धोने के बाद जितना हो सके supernatant निकाल लें ।

5. सेल Lysis और Immunoprecipitation

  1. lysis बफर और वॉश बफर की तैयारी
    1. lysis बफ़र तैयार करें (५० mm Tris-HCl (pH ८.०), १०० mm KCl, ०.५% (v/v) NP-४०, 10% (v/v) ग्लिसरॉल, 1 mm dithiothreitol (डीटीटी), और चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल) ।
    2. वाश बफ़र (५० mm Tris-HCl (pH ८.०), १०० mm KCl, ०.१% (v/v) NP-४०, और 10% (v/v) ग्लिसरॉल) तैयार करें ।
    3. बफ़र समाधान 4 ° c पर संग्रहीत है ।
  2. कक्षों की तैयारी
    1. एक या दो दिनों के आईपी प्रयोग से पहले कोशिकाओं (हेला कोशिकाओं) बीज, और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर कोशिकाओं को विकसित ।
    2. एक सेल खुरचनी के साथ के बारे में १.४ x 107 कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थानांतरण । 3 मिनट के लिए आरटी पर ३८० x जी में कोशिकाओं के केंद्रापसारक । supernatant को हटा दें और 1 मिलीलीटर के साथ फिर से सस्पेंड करें और एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरण ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर १०,००० x g पर कोशिकाओं के लिए 30 एस के लिए supernatant को साफ-सुथरा निकालें । supernatant को हटाने के बाद-८० ° c पर सेल छर्रों संग्रहित किया जा सकता है ।
  3. सेल lysates की तैयारी
    1. पुनः निलंबित सेल गोली के साथ ४०० µ lysis बफर के एल । किसी ultrasonicator का उपयोग करके कक्षों को Sonicate ।
    2. sonication के बाद, भंवर संक्षेप में और 10 मिनट के लिए 4 ° c पर २०,००० x g पर lysate केंद्रापसारक ।
    3. एक नया १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए supernatant स्थानांतरण ।
  4. Immunoprecipitation
    1. स्थानांतरण ३०० सेल lysate के µ एल पहले से तैयार एंटीबॉडी गर्मी पाली (PFPA) सिइओ2 मोतियों को बांधा । एक नई microcentrifuge ट्यूब में इनपुट नमूना के रूप में सेल lysate के 30 µ एल बनाए रखें । 4 डिग्री सेल्सियस पर इनपुट नमूना स्टोर ।
      नोट: सेल lysate में प्रोटीन की कुल मात्रा लगभग 4 मिलीग्राम होनी चाहिए.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर 3 घंटे के लिए lysate/
    3. 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ४०० x g में मिश्रण केंद्रापसारक । supernatant निकालें और धो बफर के ४०० µ l को ध्यान से जोड़ें । धीरे से फिर से pipetting द्वारा मोतियों को निलंबित और नीचे के बारे में पांच बार ।
    4. इस वॉश स्टेप को तीन बार दोहराएं । अंतिम धोने के बाद जितना हो सके supernatant निकाल लें ।
    5. तैयार 2x सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) लोड हो रहा है डाई (25% (वी/वी) ग्लिसरॉल, ०.१% (w/v) ब्रोमो phenol नीला (BPB), ६० mm Tris-HCl (pH ६.८), 2% (w/v) एसडीएस, और २.७५ mm 2-mercaptoethanol) । स्टोर 2x एसडीएस-20 डिग्री सेल्सियस पर डाई लोड हो रहा है । मोती और संग्रहीत इनपुट नमूने के लिए 2x एसडीएस लोडिंग डाई के 30 µ एल जोड़ें, और ९५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए उन्हें गर्मी ।
    6. हीटिंग के बाद, पश्चिमी सोख्ता27का उपयोग कर नमूना का विश्लेषण, या-20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना की दुकान.

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Representative Results

पाली (PFPA) की तैयारी के लिए एक योजनाबद्ध सिइओ2 मोतियों, के साथ या बिना खूंटी प्रतिस्थापन 1 चित्रामें दिखाया गया है । APTES और पाली (PFPA) की प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए, नंगे सिइओ2 मोती, APTES कार्यात्मक सिइओ2 मोती, और पाली (PFPA) भ्रष्टाचार सिइओ2 मोती दोनों DLS (चित्रा 2) और XPS (चित्रा 3) की विशेषता है । मोतियों की आईपी क्षमता पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित कर रहे हैं । चित्रा 4 आईपी के लिए पश्चिमी सोख्ता परिणाम से पता चलता है 1% खूंटी-स्थानापन्न पाली (PFPA) कलम बांधने का प्रयोग, जहां मोतियों की कोई एंटीबॉडी, एक गैर विशिष्ट एंटीबॉडी, या विरोधी PKR एंटीबॉडी के साथ कर रहे हैं । चित्रा 5 आईपी के लिए पश्चिमी सोख्ता परिणाम से पता चलता है 0% खूंटी-प्रतिस्थापित पाली (PFPA) कलम बांधा और 1% खूंटी-स्थानापन्न पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी मोती, दोनों विरोधी PKR एंटीबॉडी के साथ मशीन का उपयोग कर ।

Figure 1
चित्रा 1: पाली (PFPA) की तैयारी के लिए योजनाबद्ध सिइओ2 मोती एक linker अणु के रूप में APTES का उपयोग कर । (क) पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी मोती. (ख) आंशिक रूप से खूंटी-स्थानापन्न पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी मोती. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: के लिए DLS माप (एक) नंगे सिइओ2 मोती (सिइओ2), (ख) APTES कार्यात्मक सिइओ२ मोतियों की माला (APTES-सिइओ२), और (ग) पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी सिइओ२ मोतियों (पाली (PFPA)-सिइओ२), DMSO में फैलाई. प्रत्येक नमूने का Z-औसत व्यास (d) और polydispersity index (PDI) बताया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: नंगे सिइओ2 मोतियों के लिए XPS स्पेक्ट्रा (सिइओ2), APTES कार्यात्मक सिइओ2 मोती (APTES-सिइओ2), और पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी सिइओ2 मोती (पाली (PFPA)-सिइओ2). चोटियों की जांच करने के लिए संगत (a) Si 2p, (b) O 1s, (c) N 1s, और (d) F 1s. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: आईपी के लिए पश्चिमी सोख्ता परिणाम 1% खूंटी-स्थानापन्न पाली (PFPA) कलम बांधने का उपयोग, कोई एंटीबॉडी (लेन 2), एक गैर विशिष्ट एंटीबॉडी मिश्रण, सामांय खरगोश आईजीजी (लेन 3), या विरोधी PKR एंटीबॉडी (लेन 4) के साथ इलाज किया । लेन 1 आईपी से पहले इनपुट प्रोटीन मिश्रण से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: आईपी के लिए पश्चिमी सोख्ता परिणाम 0% खूंटी-स्थानापन्न पाली (PFPA) कलम (लेन 2) और 1% खूंटी-प्रतिस्थापित पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी मोती (लेन 3) का उपयोग, दोनों विरोधी PKR एंटीबॉडी के साथ इलाज कर रहे हैं । लेन 1 आईपी से पहले इनपुट प्रोटीन मिश्रण से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

पाली (PFPA) के संश्लेषण सिइओ2 मोतियों की माला 1 चित्रामें सचित्र है । एक linker अणु के रूप में APTES को रोजगार से, पाली (PFPA) ब्रश covalently सिइओ2 सब्सट्रेट करने के लिए भ्रष्टाचारी एक सरल दो कदम प्रक्रिया के माध्यम से तैयार किया जा सकता है । हालांकि PFP इकाइयों के कुछ APTES के साथ प्रतिक्रिया के लिए बलिदान कर रहे हैं, PFP इकाइयों की एक बड़ी संख्या में या तो अमीनो-खूंटी या एंटीबॉडी के साथ बाद में प्रतिक्रिया के लिए उपलब्ध रहने की उंमीद कर रहे हैं । PFP समूहों को कम ऊर्जा सतहों के रूप में जाना जाता है तो पाली (PFPA) ब्रश पानी में अच्छी तरह से solvate नहीं28। आईपी आवेदन के लिए, एंटीबॉडी को पाली (PFPA) ब्रश पर मैटीरियल की जरूरत है, और इस विनिमय प्रतिक्रिया जलीय बफर समाधान में किया जाता है ताकि एंटीबॉडी की गतिविधि को बनाए रखने के लिए । के रूप में हमारे पिछले प्रकाशन, ऐसे अमीन के रूप में हाइड्रोफिलिक अणुओं के साथ PFP इकाइयों के आंशिक प्रतिस्थापन-कार्यात्मक खूंटी सतह hydrophilicity में सुधार कर सकते हैं, वृद्धि हुई एंटीबॉडी स्थिरीकरण दक्षता18के लिए अग्रणी । इस अध्ययन में, आंशिक रूप से खूंटी स्थानापन्न पाली (PFPA) भी तैयार है, तो सिइओ2 सतह एक ही APTES linker अणु का उपयोग करने के लिए भ्रष्टाचार. कुल मिलाकर, 1 चित्र में सचित्र तरीके पाली (PFPA) की तैयारी खूंटी प्रतिस्थापन के विभिंन डिग्री के साथ सतहों भ्रष्टाचार अनुमति देते हैं । स्वरित्र सतह गुणों के साथ इन बहुलक ब्रश एंटीबॉडी स्थिरीकरण और बाद में आईपी आवेदन के लिए एक आदर्श मंच प्रदान करते हैं ।

मनका तैयारी प्रक्रिया दोनों DLS और XPS द्वारा निगरानी की है । DMSO में विभिंन कार्यात्मक सिइओ2 मोतियों के लिए DLS परिणाम चित्रा 2में संक्षेप हैं । नंगे सिइओ2 मोती ६६६ एनएम के प्रदर्शन hydrodynamic व्यास, निर्माता के साथ समझौते में मनका आकार (०.६७६ माइक्रोन की रिपोर्ट; SD = ०.०३ माइक्रोन). APTES उपचार के बाद, मनका व्यास ७४० एनएम के लिए बढ़ जाती है; और पाली (PFPA) उपचार के साथ, मनका व्यास आगे १८८९ एनएम के लिए बढ़ जाती है । यह कहना महत्वपूर्ण है कि पाली (PFPA) के लिए polydispersity सूचकांक (PDI) कलम नहीं बल्कि बड़ी है (PDI = ०.७६) है, जो गरीब गुणवत्ता नमूना बड़े समुच्चय युक्त का संकेत है । हालांकि DLS वक्र केवल एक नैनो-आकार चोटी से पता चलता है, समुच्चय की छोटी राशि निलंबन में मौजूद हो सकता है । कार्यात्मक सिइओ2 मोतियों की सतह संरचना (चित्रा 3) का निर्धारण करने के लिए XPS द्वारा भी जांच की जाती है । निम्न APTES उपचार, एन 1s पीक APTES पर अमीन समूहों के साथ जुड़े पता चला है. और, निंनलिखित पाली (PFPA) उपचार, F 1s चोटी बहुलक पर PFP इकाइयों के साथ जुड़े पता चला है । एक साथ इन आंकड़ों सिइओ2 सतह के सफल functionalization, APTES के साथ पहले, फिर पाली (PFPA) के साथ दिखा ।

दिखाने के लिए कि पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी मोती आईपी के माध्यम से प्रोटीन संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हम 1% खूंटी-प्रतिस्थापित पाली (PFPA) कलम बांधने का इस्तेमाल किया, और उंहें कोई एंटीबॉडी, एक गैर विशिष्ट खरगोश आईजीजी एंटीबॉडी मिश्रण, या विरोधी PKR एंटीबॉडी के साथ गर्मी । सेल लक्ष्य pkr युक्त lysate सेल से निकाला गया था, और pkr संवर्धन तो आईपी के माध्यम से प्रदर्शन किया था मोतियों के तीन प्रकार का उपयोग कर । आईपी दक्षता का निर्धारण करने के लिए, eluted प्रोटीन नमूने पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से दो अलग एंटीबॉडी के खिलाफ विश्लेषण किया गया । विरोधी pkr एंटीबॉडी को बरामद pkr की राशि कल्पना करते थे । और, विरोधी GAPDH (glyceraldehyde-3 फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज) एंटीबॉडी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में GAPDH एक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन है कि PKR के साथ बातचीत नहीं करता है के रूप में इस्तेमाल किया गया था । के रूप में 4 चित्रा, मोती कोई एंटीबॉडी या गैर कोई PKR वसूली में विशिष्ट एंटीबॉडी मिश्रण परिणाम के साथ मैटीरियल में दिखाया गया है । इसके विपरीत, मोती विरोधी के साथ मशीन pkr एंटीबॉडी सफलतापूर्वक pkr को समृद्ध कर सकते हैं, के रूप में एक मजबूत PKR बैंड की उपस्थिति और GAPDH बैंड की अनुपस्थिति ने संकेत दिया । इन परिणामों का सुझाव खूंटी-स्थानापन्न पाली (PFPA) ब्रश वास्तव में एंटीबॉडी के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है और लक्ष्य प्रोटीन के चयनात्मक संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया. नोट जब प्रोटीन रिकवरी क्षमता अलग मनका प्रणालियों की तुलना कर रहे हैं, आईपी प्रयोगों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बाद में पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण एक साथ किया जाना चाहिए. इन प्रयोगों को करने में निहित विविधताओं के कारण, अलग परीक्षणों पर प्राप्त डेटा की तुलना सीधे नहीं की जानी चाहिए.

पहले रिपोर्ट की गई के रूप में, सतह hydrophilicity पाली (PFPA) ब्रश IP दक्षता18में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । चित्रा 5 आईपी के लिए पश्चिमी सोख्ता डेटा से पता चलता है बरामद प्रोटीन के नमूने 0% खूंटी-स्थानापन्न पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी मोती और 1% खूंटी-स्थानापन्न पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी मोती का उपयोग कर । दोनों ही मामलों में, मनका विरोधी PKR एंटीबॉडी के साथ मैटीरियल थे । जबकि 0% खूंटी के उपयोग कम PKR वसूली दक्षता में पाली (PFPA) परिणाम प्रतिस्थापित, 1% खूंटी पाली (PFPA) प्रतिस्थापित महत्वपूर्ण सुधार, लक्ष्य PKR के चयनात्मक संवर्धन द्वारा संकेत से पता चलता है पर गैर लक्ष्य GAPDH । हमारे पिछले प्रकाशन18के साथ समझौते में, खूंटी उपचार पाली (PFPA) ब्रश की सतह hydrophilicity वृद्धि हुई, और अधिक PFP इकाइयों एंटीबॉडी स्थिरीकरण के लिए सुलभ होने की अनुमति, आईपी दक्षता में मनाया सुधार के लिए अग्रणी । ध्यान दें, प्रतिशत खूंटी प्रतिस्थापन इस अध्ययन में सूचना दी है कि हमारे पिछले अध्ययन जो एसआई बेड़ा संश्लेषित पाली (PFPA) ब्रश इस्तेमाल में रिपोर्ट की तुलना में सीधे नहीं हो सकता । दो मामलों बहुत अलग बहुलक ब्रश तैयारी तरीकों को रोजगार, तो बराबर खूंटी लदान के साथ उपलब्ध PFP इकाइयों की राशि के लिए बहुत अलग होने की उंमीद है । हालांकि, दो अध्ययनों से टिप्पणियों गुणात्मक सहमत हैं, दोनों उच्च आईपी दक्षता प्राप्त करने के लिए एक प्रमुख नियंत्रण पैरामीटर के रूप में सतह hydrophilicity की ओर इशारा करते ।

जबकि भूतल hydrophilicity पाली (PFPA) ब्रश एंटीबॉडी लगाव की मात्रा को प्रभावित करता है, यह भी आईपी गैर विशिष्ट संवर्धन के कारण पृष्ठभूमि पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है । एक ठेठ आईपी प्रयोग में, कई धोने कदम असीम प्रोटीन को दूर करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं । जब मोती बहुत hydrophobic हैं, जैसे कि 0% खूंटी प्रतिस्थापन के साथ लोगों के रूप में, वे बड़े समुच्चय है कि अलग तोड़ मुश्किल कर रहे है फार्म करते हैं । इस मामले में, गैर विशिष्ट प्रोटीन समग्र संरचनाओं के अंदर फंस जा सकता है, और धोने पर्याप्त रूप से उंहें नहीं हटा सकते हैं, पृष्ठभूमि में वृद्धि करने के लिए अग्रणी । इसलिए, जब आईपी प्रदर्शन, यह महत्वपूर्ण है मनका सतह संपत्ति का अनुकूलन, और ध्यान सुनिश्चित करने के लिए मोती यथोचित फैलाया जाता है भुगतान किया जाना चाहिए ।

कुल मिलाकर, हम एक साधारण दो कदम प्रक्रिया का प्रदर्शन करने पाली (PFPA) सिइओ2 मोतियों की कलम तैयार है, और पता चला कि मोतियों की सतह hydrophilicity ठीक हो सकता है-एमिनो के साथ PFP इकाइयों के आंशिक प्रतिस्थापन के साथ देखते-खूंटी । इन बहुलक ब्रश सफलतापूर्वक आईपी के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया गया, खुद को पारंपरिक प्रोटीन ए के लिए एक विकल्प के रूप में पेश/ हम पाली (PFPA) ब्रश की उंमीद कई अंय क्षेत्रों में आवेदन खोजने के लिए परमाणु स्थिरीकरण की आवश्यकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम एजेंसी फॉर डिफेंस डेवलपमेंट (ग्रांट नो. UD170039ID) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% Daejung Chemicals 1102-4405
Methyl alcohol for HPLC, 99.9% Duksan Pure Chemicals d62
Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF Sigma-Aldrich 331376
Carbon disulfide anhydrous, ≥99% Sigma-Aldrich 335266
Benzyl bromide, 98% Sigma-Aldrich B17905
Petroleum ether, 90% Samchun Chemicals P0220
Ethyl ether, 99% Daejung Chemicals 4025-4404
Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% Daejung Chemicals 5514-4405
Pentafluorophenyl acrylate Santa Cruz Biotechnology sc-264001 contains inhibitor
Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I Sigma-Aldrich 199443
Sodium Chloride (NaCl) Daejung Chemicals 7548-4400
Anisole anhydrous, 99.7% Sigma-Aldrich 296295
Silica nanoparticle Microparticles GmbH SiO2-R-0.7 5% w/v aqueous suspension
3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% Tokyo Chemical Industry T1255
Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% Sigma-Aldrich 34869
Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether Polymer Source P16082-EGOCH3NH2
Phosphate buffered saline tablet Takara T9181
Tween-20 Calbiochem 9480
Tris-HCl (pH 8.0) Invitrogen AM9855G
KCl Invitrogen AM9640G
NP-40 VWR E109-50ML
Glycerol Invitrogen 15514-011
Dithiothreitol Biosesang D1037
Protease inhibitor Merck 535140-1MLCN
Bromo phenol blue Sigma-Aldrich B5525-5G
Tris-HCl (pH 6.8) Biosolution BT033
Sodium dodecyl sulfate Biosolution BS003
2-Mercaptoethanol Gibco 21985-023
PKR Antibody Cell Signaling Technology 12297S
GAPDH Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-32233
Normal Rabbit IgG Cell Signaling Technology 2729S
HeLa Korea Cell Line Bank 10002
Sonicator DAIHAN Scientific WUC-D10H
Ultrasonicator BMBio BR2006A
Centrifuge I Eppendorf 5424 R
Centrifuge II LABOGENE 1736R
Rotator FINEPCR ROTATOR/AG
Vacuum oven DAIHAN Scientific ThermoStable OV-30
Gel permeation chromatography (THF) Agilent Technologies 1260 Infinity II
X-ray photoelectron spectrometer Thermo VG Scientific Sigma Probe
Dynamic light scattering Malvern Instruments ZEN 3690

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References

  1. Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G. Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).
  2. Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films. Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).
  3. You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors. Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).
  4. Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules. Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).
  5. Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. On-chip immunoprecipitation for protein purification. Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).
  6. Das, A., Theato, P. Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules. Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).
  7. Choi, J., et al. Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).
  8. Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).
  9. Son, H., et al. Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films. Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).
  10. Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization. Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).
  11. Kessler, D., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability. Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).
  12. Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox. Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).
  13. Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials. European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).
  14. Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates. Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).
  15. Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification. Reactive & Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).
  16. He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers. Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).
  17. Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification. Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).
  18. Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification. Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).
  19. Cullen, S. E., Schwartz, B. D. An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci. The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).
  20. Sisson, T. H., Castor, C. W. An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose. Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).
  21. Peritz, T., et al. Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes. Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).
  22. Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization. Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).
  23. Yao, Y., et al. NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).
  24. Ma, J., et al. Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays. Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).
  25. Chong, Y., et al. Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S− R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R). Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).
  26. Jochum, F. D., Theato, P. Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers. Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).
  27. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2018).
  28. Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues. Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).

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रसायन विज्ञान अंक १४१ पाली (pentafluorophenyl acrylate) 3-aminopropyltriethoxysilane प्रतिक्रियाशील बहुलक ब्रश पद-बहुलकीकरण functionalization एंटीबॉडी स्थिरीकरण immunoprecipitation

Erratum

Formal Correction: Erratum: Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification
Posted by JoVE Editors on 04/30/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification.  Throughout the article, the term "3-aminopropyltriethoxysilane" has been replaced with "3-aminopropyltrimethoxysilane", and "APTES" with "APTMS".

The Keywords were updated from:

Poly(pentafluorophenyl acrylate), 3-aminopropyltriethoxysilane, reactive polymer brush, post-polymerization functionalization, antibody immobilization, immunoprecipitation

to:

Poly(pentafluorophenyl acrylate), 3-aminopropyltrimethoxysilane, reactive polymer brush, post-polymerization functionalization, antibody immobilization, immunoprecipitation

The Abstract was updated from:

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent immunoprecipitation (IP) application. The poly(PFPA) grafted surface is prepared via a simple two-step process. In the first step, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited as a linker molecule onto the silica surface. In the second step, poly(PFPA) homopolymer, synthesized via the reversible addition and fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization, is grafted to the linker molecule through the exchange reaction between the pentafluorophenyl (PFP) units on the polymer and the amine groups on APTES. The deposition of APTES and poly(PFPA) on the silica particles are confirmed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), as well as monitored by the particle size change measured via dynamic light scattering (DLS). To improve the surface hydrophilicity of the beads, partial substitution of poly(PFPA) with amine-functionalized poly(ethylene glycol) (amino-PEG) is also performed. The PEG-substituted poly(PFPA) grafted silica beads are then immobilized with antibodies for IP application. For demonstration, an antibody against protein kinase RNA-activated (PKR) is employed, and IP efficiency is determined by Western blotting. The analysis results show that the antibody immobilized beads can indeed be used to enrich PKR while non-specific protein interactions are minimal.

to:

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent immunoprecipitation (IP) application. The poly(PFPA) grafted surface is prepared via a simple two-step process. In the first step, 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) is deposited as a linker molecule onto the silica surface. In the second step, poly(PFPA) homopolymer, synthesized via the reversible addition and fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization, is grafted to the linker molecule through the exchange reaction between the pentafluorophenyl (PFP) units on the polymer and the amine groups on APTMS. The deposition of APTMS and poly(PFPA) on the silica particles are confirmed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), as well as monitored by the particle size change measured via dynamic light scattering (DLS). To improve the surface hydrophilicity of the beads, partial substitution of poly(PFPA) with amine-functionalized poly(ethylene glycol) (amino-PEG) is also performed. The PEG-substituted poly(PFPA) grafted silica beads are then immobilized with antibodies for IP application. For demonstration, an antibody against protein kinase RNA-activated (PKR) is employed, and IP efficiency is determined by Western blotting. The analysis results show that the antibody immobilized beads can indeed be used to enrich PKR while non-specific protein interactions are minimal.

The fourth paragraph of the Introduction was updated from:

In this contribution, we report an alternative method to prepare poly(PFPA) grafted surface for antibody immobilization and IP application. In a simple two-step process, as illustrated in Figure 1, an APTES linker molecule is first deposited onto the silica surface, then the poly(PFPA) polymer is covalently attached to the linker molecule through the reaction between the PFP units on the polymer and the amine functions on APTES. This preparation method allows for the permanent crosslinking of poly(PFPA) to a substrate surface, but avoids the many complications associated with SI-CTA synthesis and SI-RAFT polymerization of poly(PFPA) brushes. Partial substitution of the PFP units with amino-PEG can still be performed, allowing fine-tuning of the polymer brush surface properties. We show the poly(PFPA) grafted silica beads thus prepared can be immobilized with antibodies and used for protein enrichment via IP. The detailed bead preparation procedure, antibody immobilization, and IP testing are documented in this article, for readers interested in seeking an alternative to conventional Protein A/G based IP.

to:

In this contribution, we report an alternative method to prepare poly(PFPA) grafted surface for antibody immobilization and IP application. In a simple two-step process, as illustrated in Figure 1, an APTMS linker molecule is first deposited onto the silica surface, then the poly(PFPA) polymer is covalently attached to the linker molecule through the reaction between the PFP units on the polymer and the amine functions on APTMS. This preparation method allows for the permanent crosslinking of poly(PFPA) to a substrate surface, but avoids the many complications associated with SI-CTA synthesis and SI-RAFT polymerization of poly(PFPA) brushes. Partial substitution of the PFP units with amino-PEG can still be performed, allowing fine-tuning of the polymer brush surface properties. We show the poly(PFPA) grafted silica beads thus prepared can be immobilized with antibodies and used for protein enrichment via IP. The detailed bead preparation procedure, antibody immobilization, and IP testing are documented in this article, for readers interested in seeking an alternative to conventional Protein A/G based IP.

Step 2.1 of the Protocol was updated from:

Treatment of SiO2 beads with APTES

to:

Treatment of SiO2 beads with APTMS

Step 2.1.1 of the Protocol was updated from:

SiO2 particles are available in the form of a 5% (w/v) aqueous suspension. Combine 0.8 mL of SiO2 suspension with 40 mg of APTES and 8 mL of methanol in a 20 mL scintillation vial equipped with a stir bar.

to:

SiO2 particles are available in the form of a 5% (w/v) aqueous suspension. Combine 0.8 mL of SiO2 suspension with 40 mg of APTMS and 8 mL of methanol in a 20 mL scintillation vial equipped with a stir bar.

Step 2.1.3 of the Protocol was updated from:

Transfer the solution to a conical tube. To isolate the APTES functionalized SiO2 beads, centrifuge the solution at 10,000 x g for 5 min, then remove the supernatant. Wash the beads by re-dispersing them in 3 mL of fresh methanol. Shake the tube by hand for mixing, but if necessary, improve the dispersion by sonication in a water bath for a few seconds. Centrifuge the beads at 10,000 x g for 5 min. Remove the supernatant and repeat the wash step one more time.

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Transfer the solution to a conical tube. To isolate the APTMS functionalized SiO2 beads, centrifuge the solution at 10,000 x g for 5 min, then remove the supernatant. Wash the beads by re-dispersing them in 3 mL of fresh methanol. Shake the tube by hand for mixing, but if necessary, improve the dispersion by sonication in a water bath for a few seconds. Centrifuge the beads at 10,000 x g for 5 min. Remove the supernatant and repeat the wash step one more time.

Step 2.1.4 of the Protocol was updated from:

Combine the methanol washed SiO2 beads with 3 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO). Shake the mixture by hand, or if necessary sonicate for a few seconds, until the beads are fully dispersed in DMSO. Centrifuge the beads at 10,000 x g for 5 min, then remove the supernatant. Repeat the step to ensure complete solvent exchange from methanol to DMSO.
NOTE: The final suspension contains the APTES functionalized SiO2 beads dispersed in 4 mL of DMSO.

to:

Combine the methanol washed SiO2 beads with 3 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO). Shake the mixture by hand, or if necessary sonicate for a few seconds, until the beads are fully dispersed in DMSO. Centrifuge the beads at 10,000 x g for 5 min, then remove the supernatant. Repeat the step to ensure complete solvent exchange from methanol to DMSO.
NOTE: The final suspension contains the APTMS functionalized SiO2 beads dispersed in 4 mL of DMSO.

Step 2.2 of the Protocol was updated from:

Grafting poly(PFPA) to APTES functionalized SiO2 beads

to:

Grafting poly(PFPA) to APTMS functionalized SiO2 beads

Step 2.2.2 of the Protocol was updated from:

Add 1 mL of APTES functionalized SiO2 beads suspended in DMSO (from Step 2.1.4) to the poly(PFPA) solution. React at RT for 1 h with vigorous stirring.

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Add 1 mL of APTMS functionalized SiO2 beads suspended in DMSO (from Step 2.1.4) to the poly(PFPA) solution. React at RT for 1 h with vigorous stirring.

Step 3.4 of the Protocol was updated from:

To prepare APTES functionalized SiO2 beads suspended in DMSO, follow the same steps shown in Step 2.1. Transfer 1 mL of the bead suspension into the PEG-substituted poly(PFPA) solution prepared in Step 3.3. Allow the grafting between poly(PFPA) and APTES functionalized SiO2 beads to proceed at RT for 1 h with vigorous stirring.

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To prepare APTMS functionalized SiO2 beads suspended in DMSO, follow the same steps shown in Step 2.1. Transfer 1 mL of the bead suspension into the PEG-substituted poly(PFPA) solution prepared in Step 3.3. Allow the grafting between poly(PFPA) and APTMS functionalized SiO2 beads to proceed at RT for 1 h with vigorous stirring.

The first paragraph of the Representative Results was updated from:

A schematic for the preparation of poly(PFPA) grafted SiO2 beads, with or without PEG substitution is shown in Figure 1. To monitor the APTES and poly(PFPA) grafting process, bare SiO2 beads, APTES functionalized SiO2 beads, and poly(PFPA) grafted SiO2 beads are characterized by both DLS (Figure 2) and XPS (Figure 3). IP efficiencies of the beads are determined by Western blotting. Figure 4 shows the Western blotting results for IP using 1% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads, where the beads are incubated with no antibody, a non-specific antibody, or anti-PKR antibody. Figure 5 shows the Western blotting results for IP using 0% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads and 1% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads, both incubated with anti-PKR antibodies.

to:

A schematic for the preparation of poly(PFPA) grafted SiO2 beads, with or without PEG substitution is shown in Figure 1. To monitor the APTMS and poly(PFPA) grafting process, bare SiO2 beads, APTMS functionalized SiO2 beads, and poly(PFPA) grafted SiO2 beads are characterized by both DLS (Figure 2) and XPS (Figure 3). IP efficiencies of the beads are determined by Western blotting. Figure 4 shows the Western blotting results for IP using 1% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads, where the beads are incubated with no antibody, a non-specific antibody, or anti-PKR antibody. Figure 5 shows the Western blotting results for IP using 0% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads and 1% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads, both incubated with anti-PKR antibodies.

Figure 1 was updated from:

Figure 1

Figure 1: Schematic for the preparation of poly(PFPA) grafted SiO2 beads using APTES as a linker molecule. (a) Poly(PFPA) grafted beads. (b) Partially PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads.

to:

Figure 1

Figure 1: Schematic for the preparation of poly(PFPA) grafted SiO2 beads using APTMS as a linker molecule. (a) Poly(PFPA) grafted beads. (b) Partially PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads.

Figure 2 was updated from:

Figure 2

Figure 2: DLS measurements for (a) bare SiO2 beads (SiO2), (b) APTES functionalized SiO2 beads (APTES-SiO2), and (c) poly(PFPA) grafted SiO2 beads (poly(PFPA)-SiO2), dispersed in DMSO. The Z-average diameter (d) and polydispersity index (PDI) of each sample are reported.

to:

Figure 2

Figure 2: DLS measurements for (a) bare SiO2 beads (SiO2), (b) APTMS functionalized SiO2 beads (APTMS-SiO2), and (c) poly(PFPA) grafted SiO2 beads (poly(PFPA)-SiO2), dispersed in DMSO. The Z-average diameter (d) and polydispersity index (PDI) of each sample are reported.

Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3: XPS spectra for bare SiO2 beads (SiO2), APTES functionalized SiO2 beads (APTES-SiO2), and poly(PFPA) grafted SiO2 beads (poly(PFPA)-SiO2). The peaks examined correspond to (a) Si 2p, (b) O 1s, (c) N 1s, and (d) F 1s.

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Figure 3
Figure 3: XPS spectra for bare SiO2 beads (SiO2), APTMS functionalized SiO2 beads (APTMS-SiO2), and poly(PFPA) grafted SiO2 beads (poly(PFPA)-SiO2). The peaks examined correspond to (a) Si 2p, (b) O 1s, (c) N 1s, and (d) F 1s.

The first and second paragraphs of the Discussion were updated from:

The synthesis of poly(PFPA) grafted SiO2 beads is illustrated in Figure 1. By employing APTES as a linker molecule, poly(PFPA) brushes covalently grafted to SiO2 substrate can be prepared via a simple two-step process. Although some of the PFP units are sacrificed for the reaction with APTES, a large number of the PFP units are expected to remain available for later reaction with either amino-PEG or antibodies. The PFP groups are known to form low energy surfaces so poly(PFPA) brushes do not solvate well in water28. For IP application, the antibodies need to be immobilized on the poly(PFPA) brushes, and this exchange reaction is done in aqueous buffer solution in order to preserve the activity of the antibodies. As reported in our previous publication, partial substitution of the PFP units with hydrophilic molecules such as amine-functionalized PEG can improve surface hydrophilicity, leading to increased antibody immobilization efficiency18. In this study, partially PEG substituted poly(PFPA) is also prepared, then grafted to the SiO2 surface using the same APTES linker molecule. Overall, the methods illustrated in Figure 1 allow the preparation of poly(PFPA) grafted surfaces with different degrees of PEG substitution. These polymer brushes with tunable surface properties provide an ideal platform for antibody immobilization and subsequent IP application.

The bead preparation process is monitored by both DLS and XPS. The DLS results for various functionalized SiO2 beads in DMSO are summarized in Figure 2. The bare SiO2 beads exhibit hydrodynamic diameter of 666 nm, in agreement with the manufacturer reported bead size (0.676 μm; SD = 0.03 μm). After APTES treatment, the bead diameter increases to 740 nm; and with poly(PFPA) treatment, the bead diameter further increases to 1889 nm. It is important to point out that the polydispersity index (PDI) for the poly(PFPA) grafted beads is rather large (PDI = 0.76), which is indicative of poor quality sample containing large aggregates. Although the DLS curve only shows one nano-sized peak, small amount of aggregates may be present in the suspension. The functionalized SiO2 beads are also examined by XPS to determine surface composition (Figure 3). Following APTES treatment, N 1s peak associated with the amine groups on APTES is detected. And, following poly(PFPA) treatment, F 1s peak associated with the PFP units on the polymer is detected. Together these data show the successful functionalization of the SiO2 surface, first with APTES, then with poly(PFPA).

to:

The synthesis of poly(PFPA) grafted SiO2 beads is illustrated in Figure 1. By employing APTMS as a linker molecule, poly(PFPA) brushes covalently grafted to SiO2 substrate can be prepared via a simple two-step process. Although some of the PFP units are sacrificed for the reaction with APTMS, a large number of the PFP units are expected to remain available for later reaction with either amino-PEG or antibodies. The PFP groups are known to form low energy surfaces so poly(PFPA) brushes do not solvate well in water28. For IP application, the antibodies need to be immobilized on the poly(PFPA) brushes, and this exchange reaction is done in aqueous buffer solution in order to preserve the activity of the antibodies. As reported in our previous publication, partial substitution of the PFP units with hydrophilic molecules such as amine-functionalized PEG can improve surface hydrophilicity, leading to increased antibody immobilization efficiency18. In this study, partially PEG substituted poly(PFPA) is also prepared, then grafted to the SiO2 surface using the same APTMS linker molecule. Overall, the methods illustrated in Figure 1 allow the preparation of poly(PFPA) grafted surfaces with different degrees of PEG substitution. These polymer brushes with tunable surface properties provide an ideal platform for antibody immobilization and subsequent IP application.

The bead preparation process is monitored by both DLS and XPS. The DLS results for various functionalized SiO2 beads in DMSO are summarized in Figure 2. The bare SiO2 beads exhibit hydrodynamic diameter of 666 nm, in agreement with the manufacturer reported bead size (0.676 μm; SD = 0.03 μm). After APTMS treatment, the bead diameter increases to 740 nm; and with poly(PFPA) treatment, the bead diameter further increases to 1889 nm. It is important to point out that the polydispersity index (PDI) for the poly(PFPA) grafted beads is rather large (PDI = 0.76), which is indicative of poor quality sample containing large aggregates. Although the DLS curve only shows one nano-sized peak, small amount of aggregates may be present in the suspension. The functionalized SiO2 beads are also examined by XPS to determine surface composition (Figure 3). Following APTMS treatment, N 1s peak associated with the amine groups on APTMS is detected. And, following poly(PFPA) treatment, F 1s peak associated with the PFP units on the polymer is detected. Together these data show the successful functionalization of the SiO2 surface, first with APTMS, then with poly(PFPA).
पाली की तैयारी (pentafluorophenyl acrylate) कार्यात्मक सिइओ<sub>2</sub> मोती प्रोटीन शुद्धि के लिए
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Kim, S., Ku, J., Park, J., Kharbash, … More

Kim, S., Ku, J., Park, J., Kharbash, R., Li, S. Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification. J. Vis. Exp. (141), e58843, doi:10.3791/58843 (2018).

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