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Chemistry

Preparação de Poly(pentafluorophenyl acrylate) acrescida SiO2 grânulos para purificação de proteínas

Published: November 19, 2018 doi: 10.3791/58843
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2KI for Health Science and Technology (KIHST), Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

ERRATUM NOTICE

Summary

Um protocolo para a preparação de poli (acrilato de pentafluorophenyl) (poly(PFPA)) enxertados grânulos de sílica é apresentado. A superfície funcionalizados poly(PFPA) é então imobilizada com anticorpos e usada com sucesso para a separação de proteínas através da imunoprecipitação.

Abstract

Vamos demonstrar um método simples para preparar poli (acrilato de pentafluorophenyl) (poly(PFPA)) enxertados grânulos de sílica para imobilização de anticorpo e aplicação subsequente da imunoprecipitação (IP). A superfície enxertados poly(PFPA) é preparada através de um processo de duas etapas simples. Na primeira etapa, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) é depositado como uma molécula de vinculador na superfície da sílica. Na segunda etapa, poly(PFPA) homopolímero, sintetizado através da adição reversível e polimerização de transferência (balsa) de cadeia de fragmentação, é enxertado à molécula de vinculador através da reação de troca entre as unidades de pentafluorophenyl (PFP) sobre o polímero e os grupos amina na APTES. A deposição de APTES e poly(PFPA) sobre a sílica, partículas são confirmadas por espectroscopia de fotoelétron de raios x (XPS), bem como monitoradas pela alteração de tamanho de partículas medido através de difusão dinâmica da luz (DLS). Para melhorar a superfície Hidrofilia dos grânulos, substituição parcial de poly(PFPA) com poly(ethylene glycol) acrescida de amina (amino-PEG) também é executada. O PEG-substituídos poly(PFPA) enxertados sílica grânulos então são imobilizados com anticorpos para aplicação de IP. Para demonstração, um anticorpo contra uma proteína quinase RNA-ativado (PKR) é empregado, e eficiência IP é determinada pela mancha ocidental. Os resultados da análise mostram que os grânulos de anticorpo imobilizado na verdade podem ser usados para enriquecer PKR enquanto interações não específicas da proteína são mínimas.

Introduction

Escovas de polímero reativo tem recebido muito interesse nos últimos anos. Eles podem ser usados para imobilizar moléculas funcionais em materiais orgânicos ou inorgânicos para criar superfícies registradas com aplicações em áreas como a deteção e a separação1,2,3,4, 5. Entre os polímeros reativos relatados, aqueles que contêm unidades de éster de pentafluorophenyl são particularmente útil devido a sua alta reatividade com aminas e resistência em direção a hidrólise6. Um tal polímero é poly(PFPA), e pode ser prontamente funcionalizado pós-polimerização com moléculas contendo aminas primárias ou secundárias7,8,9,10. Em um exemplo, escovas de poly(PFPA) foram reagiu com amino-spiropyrans para criar superfícies luz-responsivo7.

A preparação do poly(PFPA) e suas aplicações têm sido descritos em algumas das anteriores Publicações6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. Em particular, Theato e colaboradores relataram a síntese de escovas poly(PFPA) via tanto "enxertia para" e "enxertia de" métodos7,8,10,11,12 . Na "enxertia para" abordagem, um poli (methylsilsesquioxane)-poli (acrilato de pentafluorophenyl) (polímero híbrido de poly(MSSQ-PFPA)) foi sintetizado8,10,11,12. O componente de poly(MSSQ) foi capaz de adesão forte de formulário com um número de diferentes superfícies orgânicas e inorgânicas, permitindo assim o componente poly(PFPA) formar uma camada de pincel sobre a superfície revestida de material. Na "enxertia de" abordagem, superfície iniciada adição reversível e polimerização de transferência (SI-JANGADA) fragmentação da cadeia foi empregada para preparar poly(PFPA) pincéis7. Neste caso, um agente de transferência de corrente da superfície de imobilizado (SI-CTA) primeiro era ligado covalentemente ao substrato através de reação sílica-silano. SI-CTA imobilizado em seguida, participou a polimerização de SI-JANGADA de monômeros de espionagem, gerando densamente poly(PFPA) escovas com ligação covalente estável ao substrato.

Utilizando as escovas poly(PFPA) sintetizadas através da polimerização de SI-JANGADA, recentemente Demonstramos a imobilização dos anticorpos sobre partículas de sílica poly(PFPA) enxertados e sua subsequente aplicação na purificação de proteína18. O uso de escovas de poly(PFPA) para a imobilização de anticorpo foi encontrado para resolver uma série de problemas associados a atual separação de proteínas através de IP. IP convencional baseia-se na utilização de proteína A/G como um vinculador para anticorpo imobilização19,20,21. Desde que o uso de proteína A/G permite que os anticorpos ser anexado com uma orientação específica, eficiência de recuperação de antígeno alvo alto é alcançada. No entanto, o uso de proteína A/G sofre de interação de proteínas não específicas, bem como a perda de anticorpos durante a recuperação de proteína, os quais contribuem para um elevado nível de ruído de fundo. Para resolver essas deficiências, ligando direto dos anticorpos a um sólido apoio tem sido explorada22,23,24. A eficiência dessas técnicas é geralmente baixa devido a orientação aleatória dos anticorpos quitosana. Para o substrato poly(PFPA) enxertadas, a imobilização de anticorpos é permanente, conseguida através da reação de troca entre unidades PFP e funcionalidades de amina em anticorpos. Embora a orientação de anticorpo é ainda aleatória, o sistema beneficia-se de ter muitos sites PFP reativas, controláveis pelo grau de polimerização. Além disso, mostramos que, por substituição parcial das unidades PFP com amino-PEG, Hidrofilia superfície pode ser ajustada, melhorando assim a eficiência de recuperação de proteínas do sistema18. Em geral, as partículas de sílica poly(PFPA) enxertadas foram mostradas para ser uma alternativa eficaz ao IP tradicional com razoável eficiência, bem como a experiência mais limpa.

Esta contribuição, nós relatamos um método alternativo para preparar poly(PFPA) superfície enxertados para imobilização de anticorpo e aplicação de IP. Em um processo de duas etapas simples, conforme ilustrado na Figura 1, uma molécula de vinculador APTES é primeiro depositada na superfície da sílica, em seguida, o polímero de poly(PFPA) está covalentemente ligado à molécula de vinculador através da reação entre as unidades PFP a polímero e as funções Amina na APTES. Esse método de preparação permite a reticulação permanente de poly(PFPA) a uma superfície de substrato, mas evita as muitas complicações associadas à síntese de SI-CTA e polimerização de SI-JANGADA de escovas poly(PFPA). Substituição parcial das unidades com amino-PEG PFP ainda pode ser executada, permitindo o ajuste fino de propriedades escova da superfície do polímero. Mostramos que os grânulos de sílica poly(PFPA) enxertado assim preparados podem ser imobilizados com anticorpos e utilizados para o enriquecimento da proteína através do IP. O procedimento de preparação detalhada do grânulo, imobilização do anticorpo e teste de IP estão documentadas neste artigo, para os leitores interessados na busca de uma alternativa à convencional proteína A/G com base em IP.

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Protocol

1. preparação de homopolímero de Poly(PFPA)

  1. Recristalização de AIBN
    1. Combine 5 g de 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) com 25 mL de metanol em um copo de 250 mL. Mergulhe o béquer em banho de óleo 60 ° C e, em seguida, agitar vigorosamente a mistura com uma barra de agitação até AIBN é totalmente dissolvido.
    2. Filtrar a solução quente através de papel de filtro (5-8 μm retenção de partículas) e armazene o filtrado a 4 ° C, para permitir que os cristais de forma lenta.
    3. Recolha o AIBN recrystallized por filtração. Combinar o produto coletado com 25 mL de metanol fresco e repetir o processo de recristalização.
    4. O 2 x recrystallized AIBN em um forno a vácuo à temperatura ambiente (RT) seca durante a noite. Armazenar o produto no escuro a <-10 ° C.
  2. Síntese de benzil dithiobenzoate25
    1. Prepare um balão de fundo redondo 500 mL três-pescoço equipado com uma barra de agitação magnética, um condensador de refluxo, um funil e um septo de borracha. Ligar o balão para a linha de gás nitrogênio através do condensador de refluxo e expulsar o interior ar com nitrogênio. Inserir um termômetro através do septo. Adicione 41 mL (0,041 mol) de uma solução 1 M de brometo de fenilmagnésio em tetrahidrofurano (THF) através de uma seringa através do septo mesmo.
    2. Aquecer a solução de brometo de fenilmagnésio a 40 ° C em banho de óleo. Em seguida, adicione 3,1 g (0,041 mol) de dissulfeto de carbono através do funil caindo lentamente, mantendo a temperatura da solução a 40 ° C.
    3. Adicione 7,1 g (0.042 mol) de brometo de benzila à mistura resultante através do funil mais 15 min. aumento da temperatura de reação de 50 ° C. Continue mexendo a esta temperatura durante 45 min.
    4. Transferir a mistura reacional para um funil de separação e diluir com 15 mL de água gelada. Extrair o produto adicionando-se 15 mL de éter dietílico e remover a camada inferior de água. Repita a extração com éter dietílico mais duas vezes.
    5. Lave as fases orgânicas combinadas com abundante quantidade de água e, em seguida, salmoura (solução de 50% (p/v) NaCl em água) e secagem do produto sobre o sulfato de magnésio anidro.
    6. Remova o solvente no vácuo a 35 ° C, usando um evaporador rotativo.
    7. Purifica o produto por cromatografia em coluna utilizando 400 mL de gel de silicone (tamanho do pore 60 Å, tamanho de partícula de malha de 63-200) e éter de petróleo como o eluente, rendendo 5 g de benzil dithiobenzoate (BDB) como óleo vermelho. Confirmar a pureza do produto por 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.02-7.99 (2 H, m), 7,55-7,50 (1h, m), 7,41-7.29 (7 H, m), 4,60 (2 H, s).
  3. Síntese de poly(PFPA) via balsa polimerização9,26
    1. Monômero de espionagem disponível comercialmente contém pequena quantidade de inibidores. Antes de polimerização, retire os inibidores, passando o monômero, através de uma seringa descartável, embalada com alumina básica.
    2. Adicione 0,4 mg (0.0024 mmol) de AIBN recrystallized, 4,3 mg (0,018 mmol) de BDB, 1012 mg (4,25 mmol) de espionagem livre de inibidor e 0,7 mL de anidro anisole de Schlenk de 20 mL.
    3. Ligar o balão ao Schlenk linha e desgaseificar a mistura pelo menos três ciclos de gelo-degelo-bomba. Brevemente, congele a mistura reacional em um banho de nitrogênio líquido. Aplica o vácuo para remover o gás no headspace. Selo do frasco, em seguida, remover longe de nitrogênio líquido para permitir que o conteúdo descongelar no RT
    4. Colocar o balão em banho de óleo de 70 ° C e reagir durante 4 h sob expurgo de2 N.
    5. Para finalizar a reação, retirar o frasco do banho de óleo e expor o conteúdo de reação ao ar.
    6. Precipitar o polímero em metanol a frio e, em seguida, secar o polímero recuperado em um forno de vácuo a 40 ° C durante a noite.
    7. Para medir o peso molecular do polímero, use cromatografia de permeação de gel (GPC). Use o THF como taxa de fluxo da fase móvel a 35 ° C, com um 1 mL/min e construir a curva de calibração usando padrões de poliestireno monodisperso. Para adquirir a medição do GPC, dissolva o polímero em THF (1-2 mg/mL) e filtro através de filtro de descartáveis politetrafluoretileno (PTFE) 0,2 μm. Injete 100 μL da amostra dentro do instrumento do GPC. Converta o tempo de retenção de amostra medido em peso molecular utilizando a curva de calibração de poliestireno.

2. preparação de Poly(PFPA) acrescida de SiO2 grânulos

  1. Tratamento de SiO2 contas com APTES
    1. SiO2 partículas estão disponíveis sob a forma de uma suspensão aquosa de 5% (p/v). Combine a 0,8 mL de SiO2 suspensão com 40 mg de APTES e 8 mL de metanol em um frasco de 20 mL cintilação equipado com uma barra de agitação.
    2. Permitir que a reação prosseguir no RT para 5 h com agitação vigorosa.
    3. Transferi a solução para um tubo cônico. Para isolar o APTES acrescida SiO2 grânulos, centrifugar a solução a 10.000 x g por 5 min e, em seguida, remover o sobrenadante. Lave os grânulos re-dispersando-os em 3 mL de metanol fresco. Agitar o tubo com a mão para a mistura, mas se necessário, melhorar a dispersão pelo sonication em banho-maria por alguns segundos. Centrifugue os grânulos a 10.000 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante e repetir a etapa de lavagem mais uma vez.
    4. Combine o metanol lavado SiO2 grânulos com 3 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO). Agitar a mistura com a mão, ou se necessário proceda à sonicação durante alguns segundos, até que os grânulos são totalmente dispersos em DMSO. Centrifugue os grânulos a 10.000 x g por 5 min e, em seguida, remover o sobrenadante. Repita a etapa para assegurar a completa troca solvente metanol de DMSO.
      Nota: A suspensão final contém os APTES acrescida SiO2 grânulos dispersaram em 4 mL de DMSO.
    5. Para verificar a distribuição de tamanho de partícula, realizar análise DLS. Tome uma gota da suspensão preparada no passo 2.1.4 e lugar em uma cubeta UV descartável. Diluir a amostra preenchendo a cubeta com DMSO fresco até que é 2/3 cheio. Introduza a amostra no suporte de célula para começar a aquisição de dados. Para medição de tamanho de partícula, use os seguintes parâmetros de configuração: temperatura: 25 ° C; Tempo da equilibração: 120 s; Duração da medição: automático.
    6. Para verificar a composição da superfície, realizar análise XPS. Seca uma pequena amostra da suspensão preparada na etapa 2.1.4 na estufa de vácuo a 40 ° C durante a noite. Pegue o polímero seco e pacote uniformente um titular de amostra de 0,5 x 0,5 cm. Carregar a amostra na câmara de alto vácuo (10-8 torr) e começar a aquisição de dados. Para o instrumento XPS particular usado, gerar os photoelectrons usando um monocromático Al Kα raios-x operado em 15 kV e mA 6,7 e coletar usando ampliação de modo híbrido com o analisador em um eV 50 passam energia para espectros de alta resolução e um eV 100 passar energia para inquéritos elementares.
  2. Enxertia de poly(PFPA) para APTES acrescida de SiO2 grânulos
    1. Prepare a solução de poly(PFPA) dissolvendo-se 20 mg de poly(PFPA) em 2 mL de DMSO em um frasco de cintilação de 20 mL.
      Nota: Neste estudo, é usado um poly(PFPA) relativamente baixo peso molecular (20 kg/mol). Assim, apesar da concentração do polímero elevado (10 mg/mL), sem evidência de reticulação do polímero é observada. Se for usado um polímero de peso molecular mais elevado, concentração da solução de polímero pode precisar ser ajustada para evitar possível reticulação.
    2. Adicione 1 mL de APTES acrescida de SiO2 grânulos suspendidos em DMSO (da etapa 2.1.4) para a solução de poly(PFPA). Reagem na RT para 1 h com agitação vigorosa.
    3. Isole os grânulos de2 SiO poly(PFPA) enxertados por centrifugação a 10.000 x g durante 5 min, seguido pela remoção do sobrenadante. Lave os grânulos adicionando-se 3 mL de DMSO e misturar ou agitando com a mão ou alguns segundos de sonication. Centrifugue os grânulos a 10.000 x g por 5 min e, em seguida, remover o sobrenadante. Repeti a lavagem dos poly(PFPA) enxertados SiO2 grânulos com DMSO duas vezes.
    4. Lave os grânulos mais duas vezes com água destilada triplo (TDW). Nesta etapa, combine os grânulos com 3 mL de TDW e, em seguida, misturar por agitação com a mão ou alguns segundos de sonication. Centrifugue os grânulos a 10.000 x g por 5 min e, em seguida, remover o sobrenadante.
    5. Para verificar a distribuição de tamanho de partícula, execute DLS seguindo o procedimento descrito na etapa 2.1.5. Para verificar a química de superfície, execute XPS seguindo o procedimento descrito na etapa 2.1.6.

3. preparação de SiO2 grânulos enxertado com Poly(PFPA) PEG-substituídos

  1. Para preparar a solução de poly(PFPA), dissolva 20 mg de poly(PFPA) em 2 mL de DMSO em um frasco de cintilação de 20 mL.
  2. Para preparar a solução de PEG, dissolva PEG amina acrescida em 1 mL de DMSO. A quantidade exata de PEG usado é determinado pelo grau desejado de substituição de PFP, determinada pela equação mostrada abaixo:
    Quantidade de amino-PEG (g/g-poly(PFPA)) = (N_poly(PFPA) x % PEG-Sub) x (MW_PEG / MW_poly(PFPA))
    onde N_poly(PFPA) = poly(PFPA) grau de polimerização
    % De PEG-Sub = porcentagem PEG de substituição
    MW_PEG = peso molecular do amino-PEG
    MW_ poly(PFPA) = peso molecular de poly(PFPA)
  3. Transferi a solução de PEG para a solução de poly(PFPA). Reagem na RT para 1 h com agitação vigorosa.
  4. Para preparar APTES acrescida SiO2 grânulos suspensos em DMSO, siga os mesmos passos mostrados no passo 2.1. Transferi 1 mL da suspensão do grânulo para a solução de PEG-substituídos poly(PFPA) preparada no passo 3.3. Permitir que a enxertia entre poly(PFPA) e APTES acrescida de SiO2 grânulos para prosseguir na RT para 1 h com agitação vigorosa.
  5. Isole os grânulos por centrifugação a 10.000 x g durante 5 min, seguido pela remoção do sobrenadante. Lave os grânulos adicionando-se 3 mL de DMSO e misturar ou agitando com a mão ou alguns segundos de sonication. Centrifugue os grânulos a 10.000 x g por 5 min e, em seguida, remover o sobrenadante. Repita a lavagem de DMSO duas vezes.
  6. Lave os grânulos duas vezes mais com TDW. Nesta etapa, combine os grânulos com 3ml TDW e, em seguida, misturar por agitação com a mão ou alguns segundos de sonication. Centrifugue os grânulos a 10.000 x g por 5 min e, em seguida, remover o sobrenadante.
  7. Os grânulos a 40 ° C em um forno a vácuo seca durante a noite.

4. anticorpo imobilização na Poly(PFPA) enxertados SiO2 grânulos

Nota: O mesmo procedimento é usado independentemente de substituição de PEG por cento na poly(PFPA). Prepare salina tamponada fosfato (PBS), dissolvendo o tablet de PBS em TDW. Prepare o soro de tampão fosfato 0,1% (v/v) com Tween-20 (PBST) adicionando 1/1000 de Tween-20 a PBS.

  1. Adicione 5 mg de poly(PFPA) enxertados SiO2 grânulos para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
  2. Lave os grânulos adicionando 800 µ l de PBS e misture bem vortexing. Centrifugue os grânulos a 10.000 x g em RT para 1 min. Retire o sobrenadante e repetir a etapa de lavagem três vezes.
  3. Adicione 350 µ l de PBS fresco e 50 µ l 0,1% (v/v) PBST µ g 6,67 do anticorpo. Incube ~ 20 h em rotacao a 4 ° C.
  4. Lave os grânulos para remover anticorpos não acoplados. Centrifugue os grânulos a 400 x g e 4 ° C, durante 1 min. Retire o sobrenadante e adicionar 400 µ l de tampão de Lise cuidadosamente. Delicadamente, re-suspenda os grânulos pipetando para cima e para baixo por cinco vezes.
    Nota: Tampão de Lise costumava lavar os grânulos deve ser o mesmo usado durante a lise celular e IP, exceto que a adição de ditiotreitol, inibidor de protease são opcionais, (Veja passo 5).
  5. Repita essa etapa de lavagem três vezes. Após a lavagem final, remova o máximo possível de sobrenadante.

5. pilha Lysis e imunoprecipitação

  1. Preparação de Lise e tampão de lavagem
    1. Prepare a lise (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM KCl, 0,5% (v/v) NP-40, 10% (v/v) glicerol, 1mm ditiotreitol (DTT) e protease inibidor cocktail).
    2. Prepare o tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM KCl, 0,1% (v/v) NP-40 e 10% (v/v) glicerol).
    3. Armazenar as soluções-tampão a 4 ° C.
  2. Preparação das células
    1. As células (células HeLa) de sementes de um ou dois dias antes do experimento IP e crescem as células a 37 ° C e 5% de CO2.
    2. Colete cerca de 1.4 x 107 células com um raspador de célula e transferência em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugação, as células a 380 x g em RT por 3 min. Retire o sobrenadante e ressuspender com 1 mL de frio PBS e transferir para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
    3. Centrifugar as células a 10.000 x g a 4 ° C durante 30 s. remover o sobrenadante limpo. Aglomerados de células podem ser armazenados a-80 ° C depois de retirar o sobrenadante.
  3. Preparação de lisados celulares
    1. Ressuspender o centrifugado com 400 µ l da lise. Proceda à sonicação as células usando um ultrasonicator.
    2. Após o sonication, vórtice brevemente e centrifugar o lisado a 20.000 x g a 4 ° C por 10 min.
    3. Transferi o sobrenadante para um novo tubo de centrifugação de 1,5 mL.
  4. Imunoprecipitação
    1. Transferência de 300 µ l de lisado celular anticorpo previamente preparado incubado poly(PFPA) enxertados SiO2 talões. Reter 30 µ l da célula lisada como o exemplo de entrada em um novo tubo de microcentrifugadora. Armazenar o exemplo de entrada a 4 ° C.
      Nota: A quantidade total de proteína no lisado celular deve ser de aproximadamente 4 mg.
    2. Incubar a mistura de lisado/grânulos para 3h em rotacao a 4 ° C.
    3. Centrifugue a mistura a 400 x g a 4 ° C, durante 1 min. Retire o sobrenadante e adicionar 400 µ l de tampão de lavagem com cuidado. Delicadamente, re-suspenda os grânulos pipetando para cima e para baixo cerca de cinco vezes.
    4. Repita essa etapa de lavagem três vezes. Após a lavagem final, remova o máximo possível de sobrenadante.
    5. Prepare 2 x sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS) carregando tintura (glicerol de 25% (v/v), 0,1% (p/v) bromo fenol azul (BPB), 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% (p/v) SDS e 2,75 mM 2-Mercaptoetanol). Loja 2 x tintura de carregamento SDS a-20 ° C. Adicionar 30 µ l de 2 x tintura de carregamento SDS para as contas e o exemplo de entrada armazenado e aquecê-los durante 10 minutos a 95 ° C.
    6. Após o aquecimento, analisar a amostra usando a mancha27ocidental, ou armazenar a amostra a-20 ° C.

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Representative Results

Um esquema para a preparação de poly(PFPA) enxertado SiO2 grânulos, com ou sem PEG substituição é mostrada na Figura 1. Para monitorar o APTES e poly(PFPA) enxertia processo, desencapado SiO2 grânulos, APTES acrescida de SiO2 grânulos, e poly(PFPA) enxertados SiO2 miçangas caracterizam-se por DLS (Figura 2) e XPS (Figura 3). Eficiências IP dos grânulos são determinadas pela mancha ocidental. A Figura 4 mostra o Western mancha resultados para IP usando grânulos de poly(PFPA) PEG-substituídos enxertadas de 1%, onde os grânulos são incubados com nenhum anticorpo, um anticorpo específico ou anticorpo anti-PKR. A Figura 5 mostra os resultados da mancha ocidentais para IP usando 0% PEG-substituídos poly(PFPA) enxertados grânulos e grânulos 1% PEG-substituídos poly(PFPA) enxertados, ambos incubadas com anticorpos anti-PKR.

Figure 1
Figura 1: Diagrama esquemático para a preparação de poly(PFPA) enxertados SiO2 grânulos usando APTES como uma molécula de vinculador. (um) Poly(PFPA) enxertados grânulos. (b) parcialmente PEG-substituídos poly(PFPA) enxertados grânulos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: medições de DLS para (a) bare SiO2 grânulos (SiO2), (b) APTES acrescida de SiO2 grânulos (APTES-SiO2) e (c) poly(PFPA) enxertados SiO2 grânulos (poli (espionagem)-SiO2), dispersos em DMSO. O diâmetro de Z-média (d) e o índice de polidispersividade (PDI) de cada amostra são relatados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Espectro XPS para desencapado SiO2 grânulos (SiO2), acrescida de APTES SiO2 grânulos (APTES-SiO2), e poly(PFPA) enxertados SiO2 grânulos (poli (espionagem)-SiO2). Os picos examinados correspondem a (uma) Si 2P, (b) O 1s, (c) N 1s e (d) F 1s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Western mancha resultados para IP usando 1% poly(PFPA) PEG-substituídos enxertados grânulos, tratados com nenhum anticorpo (pista 2), uma mistura de anticorpos inespecíficos, normal coelho IgG (faixa 3) ou anti-PKR anticorpo (faixa 4). 1 Lane mostra a mistura de proteína de entrada antes de IP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: mancha resultados para IP utilizando 0% PEG-substituídos poly(PFPA) ocidental enxertados grânulos (pista 2) e 1% PEG-substituídos poly(PFPA) enxertados grânulos (faixa 3), ambos são tratados com anticorpos anti-PKR. 1 Lane mostra a mistura de proteína de entrada antes de IP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A síntese de poly(PFPA) enxertados SiO2 grânulos é ilustrado na Figura 1. Empregando APTES como uma molécula de vinculador, escovas poly(PFPA) covalentemente enxertadas de SiO2 substrato podem ser preparadas através de um processo de duas etapas simples. Embora algumas das unidades de PFP são sacrificadas para a reação com APTES, um grande número de unidades a PFP deverão permanecer disponível para posterior reação com anticorpos ou amino-PEG. Os grupos PFP são conhecidos para dar forma a superfícies de baixa energia para que escovas poly(PFPA) fazer não dissolve bem na água28. Para aplicação de IP, os anticorpos precisam ser imobilizados nas escovas de poly(PFPA), e esta reação de troca é feita em solução aquosa de tampão, a fim de preservar a atividade dos anticorpos. Conforme relatado em nossa publicação anterior, substituição parcial das unidades com moléculas hidrofílicas como PEG amina acrescida de PFP pode melhorar a superfície Hidrofilia, levando ao aumento do anticorpo imobilização eficiência18. Neste estudo, parcialmente PEG substituído poly(PFPA) é também preparado, em seguida, transplantada para a superfície de SiO2 usando a mesma molécula de vinculador APTES. Em geral, os métodos ilustrados na Figura 1 que a preparação das superfícies poly(PFPA) enxertado com diferentes graus de substituição de PEG. Estas escovas de polímero com propriedades de superfície ajustáveis fornecem uma plataforma ideal para imobilização de anticorpo e posterior aplicação de IP.

O processo de preparação do grânulo é monitorado por DLS e XPS. Os resultados DLS para vários funcionalizados SiO2 grânulos em DMSO são resumidos na Figura 2. Os desencapado SiO2 grânulos apresentam diâmetro hidrodinâmico de 666 nm, de acordo com o fabricante informou o tamanho do grânulo (0.676 μm; SD = 0,03 μm). Após o tratamento APTES, o diâmetro do grânulo aumenta a 740 nm; e com tratamento de poly(PFPA), o diâmetro do grânulo adicional aumenta a 1889 nm. É importante salientar que o índice de polidispersividade (PDI) para as contas poly(PFPA) enxertado é bastante grande (PDI = 0,76), que é indicativo da amostra de má qualidade, contendo grandes agregados. Embora a curva DLS só mostra um pico nanométricas, pequena quantidade de agregados pode ser presente em suspensão. Os grânulos de2 SiO funcionalizados também são examinados pelo XPS para determinar a composição da superfície (Figura 3). Após o tratamento APTES, N 1s pico associado com os grupos amina na APTES é detectado. E, a seguir poly(PFPA) tratamento, F 1s pico associado com as unidades PFP em polímero é detectado. Juntos esses dados mostram o sucesso functionalization da superfície2 SiO, primeiro com APTES, então com poly(PFPA).

Para mostrar que os grânulos poly(PFPA) enxertado podem ser usados para o enriquecimento da proteína através do IP, usamos 1% poly(PFPA) PEG-substituídos enxertados grânulos e os incubados com nenhum anticorpo, uma mistura de anticorpos de IgG de coelho não-específica ou anticorpo anti-PKR. Lisado contendo o alvo PKR foi extraído das células, e enriquecimento de PKR então foi realizado através de IP usando os três tipos de contas de celular. Para determinar a eficiência IP, analisaram-se as amostras da proteína eluted contra dois anticorpos diferentes através de mancha ocidental. Anticorpo anti-PKR foi usado para visualizar a quantidade de PKR recuperado. E, anticorpo anti-GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) foi usado como um controle negativo GAPDH é uma proteína abundante que não interage com PKR. Como mostrado na Figura 4, grânulos imobilizados sem anticorpo ou resultado de mistura de anticorpo específico em nenhuma recuperação PKR. Em contraste, os grânulos incubados com anticorpo anti-PKR com êxito podem enriquecer PKR, conforme indicado pela presença de uma banda PKR forte e a ausência da banda GAPDH. Estes resultados sugerem escovas poly(PFPA) PEG-substituídos na verdade podem ser acrescidas com anticorpos e utilizadas para o enriquecimento seletivo da proteína do alvo. Nota Quando a eficiência de recuperação de proteína de sistemas diferentes do grânulo é comparada, os experimentos IP, bem como a Western subsequente análises a mancha deve ser feito simultaneamente. Devido às variações inerentes em realizar estas experiências, dados obtidos em ensaios separados não devem ser directamente comparados.

Como relatado anteriormente, a superfície Hidrofilia de escovas poly(PFPA) desempenha um papel fundamental na eficiência IP18. A Figura 5 mostra a mancha dados por IP de ocidental recuperou amostras da proteína usando grânulos poly(PFPA) PEG-substituídos enxertadas de 0% e 1% poly(PFPA) PEG-substituídos enxertados grânulos. Em ambos os casos, as contas foram imobilizadas com anticorpos anti-PKR. Enquanto o uso de 0% PEG-substituídos poly(PFPA) resulta em baixa eficiência de recuperação PKR, a 1% PEG-substituídos poly(PFPA) mostra melhora significativa, indicada pelo enriquecimento seletivo do alvo PKR sobre GAPDH não-alvo. De acordo com a nossa publicação anterior18, o tratamento de PEG aumentou a superfície Hidrofilia da escova poly(PFPA), permitindo que mais unidades PFP ser acessível para a imobilização de anticorpos, levando à melhoria observada na eficiência IP. Note que a substituição de PEG por cento relatada neste estudo não pode ser diretamente comparada àquele relatado em nosso estudo anterior que usou SI-JANGADA sintetizado escovas poly(PFPA). Os dois casos empregam métodos de preparação de escova de polímero muito diferentes, então a quantidade de unidades PFP disponíveis com PEG igual carregamento deverá ser muito diferente. No entanto, as observações de dois estudos concordam qualitativamente, ambos apontando para superfície Hidrofilia como um parâmetro de controle chave para alcançar uma alta eficácia IP.

Enquanto Hidrofilia superfície influencia a quantidade de fixação de anticorpos para as escovas de poly(PFPA), também tem um efeito significativo no fundo IP devido ao enriquecimento específico. Em um experimento típico de IP, muitas etapas de lavagem são executadas para remover as proteínas unbound. Quando as contas são muito hidrofóbicas, tais como aqueles com 0% PEG substituição, eles tendem a agregados grandes de forma que são difíceis de separar. Neste caso, específico de proteínas podem ser presa dentro de estruturas de agregação e lavagem suficientemente não pode removê-los, levando a um aumento no fundo. Portanto, ao realizar o IP, é importante otimizar a propriedade de superfície do grânulo, e deve ser dada atenção para garantir que os grânulos são razoavelmente dispersos.

Em geral, temos demonstrado um processo de duas etapas simples para preparar poly(PFPA) enxertados SiO2 grânulos e mostrou que a superfície Hidrofilia dos grânulos pode ser afinada com substituição parcial das unidades de PFP com amino-PEG. Estas escovas de polímero foram usadas com sucesso para enriquecimento de proteína alvo através de IP, apresentando-se como uma alternativa à tradicional proteína A/G com base técnica IP. Podemos esperar poly(PFPA) pincéis para encontrar aplicação em muitas outras áreas que requerem imobilização biomolécula.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela Agência para o desenvolvimento de defesa (Grant no. UD170039ID).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% Daejung Chemicals 1102-4405
Methyl alcohol for HPLC, 99.9% Duksan Pure Chemicals d62
Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF Sigma-Aldrich 331376
Carbon disulfide anhydrous, ≥99% Sigma-Aldrich 335266
Benzyl bromide, 98% Sigma-Aldrich B17905
Petroleum ether, 90% Samchun Chemicals P0220
Ethyl ether, 99% Daejung Chemicals 4025-4404
Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% Daejung Chemicals 5514-4405
Pentafluorophenyl acrylate Santa Cruz Biotechnology sc-264001 contains inhibitor
Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I Sigma-Aldrich 199443
Sodium Chloride (NaCl) Daejung Chemicals 7548-4400
Anisole anhydrous, 99.7% Sigma-Aldrich 296295
Silica nanoparticle Microparticles GmbH SiO2-R-0.7 5% w/v aqueous suspension
3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% Tokyo Chemical Industry T1255
Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% Sigma-Aldrich 34869
Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether Polymer Source P16082-EGOCH3NH2
Phosphate buffered saline tablet Takara T9181
Tween-20 Calbiochem 9480
Tris-HCl (pH 8.0) Invitrogen AM9855G
KCl Invitrogen AM9640G
NP-40 VWR E109-50ML
Glycerol Invitrogen 15514-011
Dithiothreitol Biosesang D1037
Protease inhibitor Merck 535140-1MLCN
Bromo phenol blue Sigma-Aldrich B5525-5G
Tris-HCl (pH 6.8) Biosolution BT033
Sodium dodecyl sulfate Biosolution BS003
2-Mercaptoethanol Gibco 21985-023
PKR Antibody Cell Signaling Technology 12297S
GAPDH Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-32233
Normal Rabbit IgG Cell Signaling Technology 2729S
HeLa Korea Cell Line Bank 10002
Sonicator DAIHAN Scientific WUC-D10H
Ultrasonicator BMBio BR2006A
Centrifuge I Eppendorf 5424 R
Centrifuge II LABOGENE 1736R
Rotator FINEPCR ROTATOR/AG
Vacuum oven DAIHAN Scientific ThermoStable OV-30
Gel permeation chromatography (THF) Agilent Technologies 1260 Infinity II
X-ray photoelectron spectrometer Thermo VG Scientific Sigma Probe
Dynamic light scattering Malvern Instruments ZEN 3690

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References

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Química edição 141 poli (acrilato de pentafluorophenyl) 3-aminopropyltriethoxysilane escova de polímero reativo pós-polimerização functionalization imobilização do anticorpo imunoprecipitação

Erratum

Formal Correction: Erratum: Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification
Posted by JoVE Editors on 04/30/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification.  Throughout the article, the term "3-aminopropyltriethoxysilane" has been replaced with "3-aminopropyltrimethoxysilane", and "APTES" with "APTMS".

The Keywords were updated from:

Poly(pentafluorophenyl acrylate), 3-aminopropyltriethoxysilane, reactive polymer brush, post-polymerization functionalization, antibody immobilization, immunoprecipitation

to:

Poly(pentafluorophenyl acrylate), 3-aminopropyltrimethoxysilane, reactive polymer brush, post-polymerization functionalization, antibody immobilization, immunoprecipitation

The Abstract was updated from:

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent immunoprecipitation (IP) application. The poly(PFPA) grafted surface is prepared via a simple two-step process. In the first step, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited as a linker molecule onto the silica surface. In the second step, poly(PFPA) homopolymer, synthesized via the reversible addition and fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization, is grafted to the linker molecule through the exchange reaction between the pentafluorophenyl (PFP) units on the polymer and the amine groups on APTES. The deposition of APTES and poly(PFPA) on the silica particles are confirmed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), as well as monitored by the particle size change measured via dynamic light scattering (DLS). To improve the surface hydrophilicity of the beads, partial substitution of poly(PFPA) with amine-functionalized poly(ethylene glycol) (amino-PEG) is also performed. The PEG-substituted poly(PFPA) grafted silica beads are then immobilized with antibodies for IP application. For demonstration, an antibody against protein kinase RNA-activated (PKR) is employed, and IP efficiency is determined by Western blotting. The analysis results show that the antibody immobilized beads can indeed be used to enrich PKR while non-specific protein interactions are minimal.

to:

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent immunoprecipitation (IP) application. The poly(PFPA) grafted surface is prepared via a simple two-step process. In the first step, 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) is deposited as a linker molecule onto the silica surface. In the second step, poly(PFPA) homopolymer, synthesized via the reversible addition and fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization, is grafted to the linker molecule through the exchange reaction between the pentafluorophenyl (PFP) units on the polymer and the amine groups on APTMS. The deposition of APTMS and poly(PFPA) on the silica particles are confirmed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), as well as monitored by the particle size change measured via dynamic light scattering (DLS). To improve the surface hydrophilicity of the beads, partial substitution of poly(PFPA) with amine-functionalized poly(ethylene glycol) (amino-PEG) is also performed. The PEG-substituted poly(PFPA) grafted silica beads are then immobilized with antibodies for IP application. For demonstration, an antibody against protein kinase RNA-activated (PKR) is employed, and IP efficiency is determined by Western blotting. The analysis results show that the antibody immobilized beads can indeed be used to enrich PKR while non-specific protein interactions are minimal.

The fourth paragraph of the Introduction was updated from:

In this contribution, we report an alternative method to prepare poly(PFPA) grafted surface for antibody immobilization and IP application. In a simple two-step process, as illustrated in Figure 1, an APTES linker molecule is first deposited onto the silica surface, then the poly(PFPA) polymer is covalently attached to the linker molecule through the reaction between the PFP units on the polymer and the amine functions on APTES. This preparation method allows for the permanent crosslinking of poly(PFPA) to a substrate surface, but avoids the many complications associated with SI-CTA synthesis and SI-RAFT polymerization of poly(PFPA) brushes. Partial substitution of the PFP units with amino-PEG can still be performed, allowing fine-tuning of the polymer brush surface properties. We show the poly(PFPA) grafted silica beads thus prepared can be immobilized with antibodies and used for protein enrichment via IP. The detailed bead preparation procedure, antibody immobilization, and IP testing are documented in this article, for readers interested in seeking an alternative to conventional Protein A/G based IP.

to:

In this contribution, we report an alternative method to prepare poly(PFPA) grafted surface for antibody immobilization and IP application. In a simple two-step process, as illustrated in Figure 1, an APTMS linker molecule is first deposited onto the silica surface, then the poly(PFPA) polymer is covalently attached to the linker molecule through the reaction between the PFP units on the polymer and the amine functions on APTMS. This preparation method allows for the permanent crosslinking of poly(PFPA) to a substrate surface, but avoids the many complications associated with SI-CTA synthesis and SI-RAFT polymerization of poly(PFPA) brushes. Partial substitution of the PFP units with amino-PEG can still be performed, allowing fine-tuning of the polymer brush surface properties. We show the poly(PFPA) grafted silica beads thus prepared can be immobilized with antibodies and used for protein enrichment via IP. The detailed bead preparation procedure, antibody immobilization, and IP testing are documented in this article, for readers interested in seeking an alternative to conventional Protein A/G based IP.

Step 2.1 of the Protocol was updated from:

Treatment of SiO2 beads with APTES

to:

Treatment of SiO2 beads with APTMS

Step 2.1.1 of the Protocol was updated from:

SiO2 particles are available in the form of a 5% (w/v) aqueous suspension. Combine 0.8 mL of SiO2 suspension with 40 mg of APTES and 8 mL of methanol in a 20 mL scintillation vial equipped with a stir bar.

to:

SiO2 particles are available in the form of a 5% (w/v) aqueous suspension. Combine 0.8 mL of SiO2 suspension with 40 mg of APTMS and 8 mL of methanol in a 20 mL scintillation vial equipped with a stir bar.

Step 2.1.3 of the Protocol was updated from:

Transfer the solution to a conical tube. To isolate the APTES functionalized SiO2 beads, centrifuge the solution at 10,000 x g for 5 min, then remove the supernatant. Wash the beads by re-dispersing them in 3 mL of fresh methanol. Shake the tube by hand for mixing, but if necessary, improve the dispersion by sonication in a water bath for a few seconds. Centrifuge the beads at 10,000 x g for 5 min. Remove the supernatant and repeat the wash step one more time.

to:

Transfer the solution to a conical tube. To isolate the APTMS functionalized SiO2 beads, centrifuge the solution at 10,000 x g for 5 min, then remove the supernatant. Wash the beads by re-dispersing them in 3 mL of fresh methanol. Shake the tube by hand for mixing, but if necessary, improve the dispersion by sonication in a water bath for a few seconds. Centrifuge the beads at 10,000 x g for 5 min. Remove the supernatant and repeat the wash step one more time.

Step 2.1.4 of the Protocol was updated from:

Combine the methanol washed SiO2 beads with 3 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO). Shake the mixture by hand, or if necessary sonicate for a few seconds, until the beads are fully dispersed in DMSO. Centrifuge the beads at 10,000 x g for 5 min, then remove the supernatant. Repeat the step to ensure complete solvent exchange from methanol to DMSO.
NOTE: The final suspension contains the APTES functionalized SiO2 beads dispersed in 4 mL of DMSO.

to:

Combine the methanol washed SiO2 beads with 3 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO). Shake the mixture by hand, or if necessary sonicate for a few seconds, until the beads are fully dispersed in DMSO. Centrifuge the beads at 10,000 x g for 5 min, then remove the supernatant. Repeat the step to ensure complete solvent exchange from methanol to DMSO.
NOTE: The final suspension contains the APTMS functionalized SiO2 beads dispersed in 4 mL of DMSO.

Step 2.2 of the Protocol was updated from:

Grafting poly(PFPA) to APTES functionalized SiO2 beads

to:

Grafting poly(PFPA) to APTMS functionalized SiO2 beads

Step 2.2.2 of the Protocol was updated from:

Add 1 mL of APTES functionalized SiO2 beads suspended in DMSO (from Step 2.1.4) to the poly(PFPA) solution. React at RT for 1 h with vigorous stirring.

to:

Add 1 mL of APTMS functionalized SiO2 beads suspended in DMSO (from Step 2.1.4) to the poly(PFPA) solution. React at RT for 1 h with vigorous stirring.

Step 3.4 of the Protocol was updated from:

To prepare APTES functionalized SiO2 beads suspended in DMSO, follow the same steps shown in Step 2.1. Transfer 1 mL of the bead suspension into the PEG-substituted poly(PFPA) solution prepared in Step 3.3. Allow the grafting between poly(PFPA) and APTES functionalized SiO2 beads to proceed at RT for 1 h with vigorous stirring.

to:

To prepare APTMS functionalized SiO2 beads suspended in DMSO, follow the same steps shown in Step 2.1. Transfer 1 mL of the bead suspension into the PEG-substituted poly(PFPA) solution prepared in Step 3.3. Allow the grafting between poly(PFPA) and APTMS functionalized SiO2 beads to proceed at RT for 1 h with vigorous stirring.

The first paragraph of the Representative Results was updated from:

A schematic for the preparation of poly(PFPA) grafted SiO2 beads, with or without PEG substitution is shown in Figure 1. To monitor the APTES and poly(PFPA) grafting process, bare SiO2 beads, APTES functionalized SiO2 beads, and poly(PFPA) grafted SiO2 beads are characterized by both DLS (Figure 2) and XPS (Figure 3). IP efficiencies of the beads are determined by Western blotting. Figure 4 shows the Western blotting results for IP using 1% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads, where the beads are incubated with no antibody, a non-specific antibody, or anti-PKR antibody. Figure 5 shows the Western blotting results for IP using 0% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads and 1% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads, both incubated with anti-PKR antibodies.

to:

A schematic for the preparation of poly(PFPA) grafted SiO2 beads, with or without PEG substitution is shown in Figure 1. To monitor the APTMS and poly(PFPA) grafting process, bare SiO2 beads, APTMS functionalized SiO2 beads, and poly(PFPA) grafted SiO2 beads are characterized by both DLS (Figure 2) and XPS (Figure 3). IP efficiencies of the beads are determined by Western blotting. Figure 4 shows the Western blotting results for IP using 1% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads, where the beads are incubated with no antibody, a non-specific antibody, or anti-PKR antibody. Figure 5 shows the Western blotting results for IP using 0% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads and 1% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads, both incubated with anti-PKR antibodies.

Figure 1 was updated from:

Figure 1

Figure 1: Schematic for the preparation of poly(PFPA) grafted SiO2 beads using APTES as a linker molecule. (a) Poly(PFPA) grafted beads. (b) Partially PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads.

to:

Figure 1

Figure 1: Schematic for the preparation of poly(PFPA) grafted SiO2 beads using APTMS as a linker molecule. (a) Poly(PFPA) grafted beads. (b) Partially PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads.

Figure 2 was updated from:

Figure 2

Figure 2: DLS measurements for (a) bare SiO2 beads (SiO2), (b) APTES functionalized SiO2 beads (APTES-SiO2), and (c) poly(PFPA) grafted SiO2 beads (poly(PFPA)-SiO2), dispersed in DMSO. The Z-average diameter (d) and polydispersity index (PDI) of each sample are reported.

to:

Figure 2

Figure 2: DLS measurements for (a) bare SiO2 beads (SiO2), (b) APTMS functionalized SiO2 beads (APTMS-SiO2), and (c) poly(PFPA) grafted SiO2 beads (poly(PFPA)-SiO2), dispersed in DMSO. The Z-average diameter (d) and polydispersity index (PDI) of each sample are reported.

Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3: XPS spectra for bare SiO2 beads (SiO2), APTES functionalized SiO2 beads (APTES-SiO2), and poly(PFPA) grafted SiO2 beads (poly(PFPA)-SiO2). The peaks examined correspond to (a) Si 2p, (b) O 1s, (c) N 1s, and (d) F 1s.

to:

Figure 3
Figure 3: XPS spectra for bare SiO2 beads (SiO2), APTMS functionalized SiO2 beads (APTMS-SiO2), and poly(PFPA) grafted SiO2 beads (poly(PFPA)-SiO2). The peaks examined correspond to (a) Si 2p, (b) O 1s, (c) N 1s, and (d) F 1s.

The first and second paragraphs of the Discussion were updated from:

The synthesis of poly(PFPA) grafted SiO2 beads is illustrated in Figure 1. By employing APTES as a linker molecule, poly(PFPA) brushes covalently grafted to SiO2 substrate can be prepared via a simple two-step process. Although some of the PFP units are sacrificed for the reaction with APTES, a large number of the PFP units are expected to remain available for later reaction with either amino-PEG or antibodies. The PFP groups are known to form low energy surfaces so poly(PFPA) brushes do not solvate well in water28. For IP application, the antibodies need to be immobilized on the poly(PFPA) brushes, and this exchange reaction is done in aqueous buffer solution in order to preserve the activity of the antibodies. As reported in our previous publication, partial substitution of the PFP units with hydrophilic molecules such as amine-functionalized PEG can improve surface hydrophilicity, leading to increased antibody immobilization efficiency18. In this study, partially PEG substituted poly(PFPA) is also prepared, then grafted to the SiO2 surface using the same APTES linker molecule. Overall, the methods illustrated in Figure 1 allow the preparation of poly(PFPA) grafted surfaces with different degrees of PEG substitution. These polymer brushes with tunable surface properties provide an ideal platform for antibody immobilization and subsequent IP application.

The bead preparation process is monitored by both DLS and XPS. The DLS results for various functionalized SiO2 beads in DMSO are summarized in Figure 2. The bare SiO2 beads exhibit hydrodynamic diameter of 666 nm, in agreement with the manufacturer reported bead size (0.676 μm; SD = 0.03 μm). After APTES treatment, the bead diameter increases to 740 nm; and with poly(PFPA) treatment, the bead diameter further increases to 1889 nm. It is important to point out that the polydispersity index (PDI) for the poly(PFPA) grafted beads is rather large (PDI = 0.76), which is indicative of poor quality sample containing large aggregates. Although the DLS curve only shows one nano-sized peak, small amount of aggregates may be present in the suspension. The functionalized SiO2 beads are also examined by XPS to determine surface composition (Figure 3). Following APTES treatment, N 1s peak associated with the amine groups on APTES is detected. And, following poly(PFPA) treatment, F 1s peak associated with the PFP units on the polymer is detected. Together these data show the successful functionalization of the SiO2 surface, first with APTES, then with poly(PFPA).

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The synthesis of poly(PFPA) grafted SiO2 beads is illustrated in Figure 1. By employing APTMS as a linker molecule, poly(PFPA) brushes covalently grafted to SiO2 substrate can be prepared via a simple two-step process. Although some of the PFP units are sacrificed for the reaction with APTMS, a large number of the PFP units are expected to remain available for later reaction with either amino-PEG or antibodies. The PFP groups are known to form low energy surfaces so poly(PFPA) brushes do not solvate well in water28. For IP application, the antibodies need to be immobilized on the poly(PFPA) brushes, and this exchange reaction is done in aqueous buffer solution in order to preserve the activity of the antibodies. As reported in our previous publication, partial substitution of the PFP units with hydrophilic molecules such as amine-functionalized PEG can improve surface hydrophilicity, leading to increased antibody immobilization efficiency18. In this study, partially PEG substituted poly(PFPA) is also prepared, then grafted to the SiO2 surface using the same APTMS linker molecule. Overall, the methods illustrated in Figure 1 allow the preparation of poly(PFPA) grafted surfaces with different degrees of PEG substitution. These polymer brushes with tunable surface properties provide an ideal platform for antibody immobilization and subsequent IP application.

The bead preparation process is monitored by both DLS and XPS. The DLS results for various functionalized SiO2 beads in DMSO are summarized in Figure 2. The bare SiO2 beads exhibit hydrodynamic diameter of 666 nm, in agreement with the manufacturer reported bead size (0.676 μm; SD = 0.03 μm). After APTMS treatment, the bead diameter increases to 740 nm; and with poly(PFPA) treatment, the bead diameter further increases to 1889 nm. It is important to point out that the polydispersity index (PDI) for the poly(PFPA) grafted beads is rather large (PDI = 0.76), which is indicative of poor quality sample containing large aggregates. Although the DLS curve only shows one nano-sized peak, small amount of aggregates may be present in the suspension. The functionalized SiO2 beads are also examined by XPS to determine surface composition (Figure 3). Following APTMS treatment, N 1s peak associated with the amine groups on APTMS is detected. And, following poly(PFPA) treatment, F 1s peak associated with the PFP units on the polymer is detected. Together these data show the successful functionalization of the SiO2 surface, first with APTMS, then with poly(PFPA).
Preparação de Poly(pentafluorophenyl acrylate) acrescida SiO<sub>2</sub> grânulos para purificação de proteínas
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Kim, S., Ku, J., Park, J., Kharbash, … More

Kim, S., Ku, J., Park, J., Kharbash, R., Li, S. Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification. J. Vis. Exp. (141), e58843, doi:10.3791/58843 (2018).

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