Summary
Denna artikel presenterar en metod för att studera nikotinacetylkolinreceptorer (nAChRs) i mus hjärnan skivor av nikotin uncaging. När tillsammans med samtidiga patch clamp inspelning och 2-foton mikroskopi för laserscanning, ansluter nikotin uncaging nikotinhaltiga receptorn funktion med cellulära morfologi, att ge en djupare förståelse av kolinerga neurobiologi.
Abstract
Acetylkolin (ACh) verkar via receptorer att modulera olika neuronala processer, men det har svårt för att länka ACh receptor funktion med subcellulär läge inom celler där denna funktion utförs. För att studera subcellulär placeringen av nikotinreceptorer ACh (nAChRs) i native hjärnvävnad, utvecklades en optisk metod för exakt release av nikotin på diskreta platser nära neuronala membran under elektrofysiologiska inspelningar. Patch-fastklämd nervceller i hjärnan skivor är fyllda med färga för att visualisera deras morfologi under 2-photon laser scanning mikroskopi och nikotin uncaging utförs med en ljus blixt genom att fokusera en 405 nm laser beam nära en eller flera cellulära membran. Cellulära aktuella omläggningar mäts, och en högupplöst tredimensionella (3D) bild av inspelade neuron är gjord för att möjliggöra avstämning av nAChR svaren med cellulära morfologi. Denna metod möjliggör detaljerad analys av nAChR funktionell distribution i komplexa vävnad preparat, lovar att förbättra förståelsen av kolinerg neurotransmission.
Introduction
Kolinerg signalering modulerar många processer i hjärnan, inklusive uppmärksamhet kontroll, viljande rörelse och belöning1,2. Läkemedel som ökar acetylkolin (ACh) överföring används för behandling av kognitiv svikt vid Alzheimers sjukdom, vilket innebär en viktig roll för kolinerga system i kognition3. En förbättrad förståelse av kolinerga receptorer och kretsar i friska och sjuka kan leda till bättre behandlingsmetoder för flera neurologiska sjukdomar/störningar.
ACh nikotinreceptorer (nAChRs) är en familj av ligandreglerade jonkanaler som flux katjoner som svar på endogena ACh eller exogena nikotin från tobaksvaror. Tanke på att de var bland de allra första signalsubstansen receptorerna att vara beskrivna4, är nAChR farmakologi och läge i muskelfibrer väl förstått för muskel-typ receptorer. Däremot är jämförelsevis lite känt om farmakologi och subcellulär distribution av infödda nAChRs i hjärnan. Denna lucka i kunskap togs nyligen upp genom att utveckla en ny kemiska sond som möjliggör rumsligt inskränkt och snabb aktivering av nAChRs i hjärnvävnad under cellular imaging och elektrofysiologiska inspelning5. Här beskrivs de viktigaste metodologiska stegen som är inblandade i detta tillvägagångssätt, med det övergripande målet att förbättra förmågan att ansluta nAChR funktion med neuronala struktur.
Photoactivatable nikotin (PA-Nic, kemiskt namn: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] kumarin-4-yl] metyl-nikotin) kan vara photolyzed med ~ 405 nm laser blinkar för att effektivt frigöra nikotin5,6. Före uncaging, PA-Nic är stabil i lösning och uppvisar inga ogynnsamma farmakologisk eller fotokemisk funktioner5. Efter fotolys, släppt nikotin aktiverar förutsägbart nAChRs och uncaging biprodukter är farmakologiskt inerta5. En continuous-wave laser används som fotolys ljuskälla med en uteffekt > 1 mW mätt vid provet. När lokaliserad, riktade foto-stimulering är kombinerat med möjligheten att lokalisera cellulära membran med 2-foton mikroskopi (2PLSM) för laserscanning, och de två viktigaste fördelarna med detta tillvägagångssätt är fullt insåg: fotolys hastighet och rumsliga precision.
I de flesta avseenden är fotolys av PA-Nic överlägsen andra metoder för att leverera nAChR ligander till receptorer i hjärnan skivor. Sådana metoder inkluderar bad ansökan7 och lokal drog leverans via en puffer pipett8. Medan det tidigare tillvägagångssättet tenderar att överbetona de långsiktiga effekterna av tillämpad drogen, kan den senare metoden lida av variabilitet i svar kinetik mellan prövningar och mellan celler. Ingen av dessa alternativa metoder kan adekvat skilja receptor aktiviteter i olika cellulära platser från samma neuron. Optogenetically-aktiverat frisläppandet av ACh har använts för utredning av inhemska nAChRs9,10,11, men det har inte visat sig användbar för mappning subcellulär nAChR platser. Dessutom de flesta studier utnyttjar detta tillvägagångssätt har förlitat sig på en ChR2-uttryckande bakteriella artificiella kromosom transgena möss med onormal kolinerga transmissionen12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic fotolys är inte bara optisk metod för att studera kolinerga receptorer. En bur carbachol användes till funktionellt karta ACh receptor aktiviteter i odlade celler18 och hjärnan skivor19, men var inte kommersiellt tillgängliga för jämförande studier under utvecklingen av PA-Nic. En rutenium bis (bipyridine)-nikotin komplexa (RuBi-nikotin) rapporterades för nikotin uncaging20, men reklamfilmförberedelser RuBi-nikotin visade sämre än PA-Nic i en head-to-head jämförelse studera5. Det kan vara lämpligt att upprepa sådana jämförande experiment med icke-kommersiella, höggradigt renat RuBi-nikotin, som dess synliga absorption kan komplimang PA-nätverkskortets funktioner för kolinerga studier. Slutligen manipulerats nAChRs också optiskt med en kombination av foto-omkopplingsbar ligander och genetiskt modifierade receptorer21. Detta tillvägagångssätt är ett komplement till PA-Nic Fotolys i hjärnvävnad, med förmåga/kravet av genetiska inriktning av den modifierade nAChR ses som både en fördel och en nackdel.
Flera viktiga krav av detta tillvägagångssätt bör noteras. Först behövs en lämplig visualisering metod att exakt lokalisera den neuronala membranen. Imaging med konventionella påljusfluorescens mikroskopi kan räcka när man studerar odlade celler, men för inspelning från nervceller i hjärnan skivor eller andra tjock vävnad preparat, 2PLSM eller konfokalmikroskopi är ett krav. För det andra behövs en lämplig metod att placera fotolys laserstrålen. Denna strategi använder tredjeparts en dual-galvanometer scan huvud med två oberoende x-y speglar för raster skanning av imaging beam och punkt ljusaktivering använder uncaging laser beam22,23,24. Andra, mer begränsade lösningar är möjliga, såsom (1) ett enda-galvanometer scan huvud att alternativt raster File imaging balken och uncaging balken, eller (2) helt enkelt rikta uncaging strålen till mitten av synfältet så att cellen förs till Denna position för flash fotolys. För det tredje krävs ett system för samtidiga elektrofysiologiska inspelning om man vill samla in fysiologiska signaler under experiment. Ovanstående krav kan uppfyllas med en lämplig all-optisk imaging teknik, som nyligen beskriven5. Nedan, ett detaljerat protokoll ingår som beskriver de viktigaste stegen i denna strategi.
Protocol
Arbete som rör hjärnan slice förberedelse var granskas och godkänns av nordvästra universitetet djur vård och användning kommittén (protokoll #IS00003604).
Varning: Lasrar som används för punkt foto-stimulering är synliga klass IIIb laser som har potential att orsaka skada på ögon. 2PLSM kräver en nära infrarött (NIR) klass IV laser (> 500 mW), som har potential att orsaka allvarliga skador på ögon och även brännskador i andra vävnader. Ordentlig laser beam inneslutning, systemet förreglingar, plus konstruerad och administrativa kontroller krävs att säkerställa säker användning av laser-baserad utrustning. Alltid söka lokala laser säkerhetspersonalen när du arbetar med laser.
1. kalibrering och verifiering av den Uncaging Laser(s)
-
Kvantifiera lasereffekt ska levereras till provet.
- Vänd på 405 nm laser (100 mW maxeffekt med 5 V styrsignal) och låt Lasersystemet och varma upp för ca 10 min.
Obs: Lasern är fortfarande slutare (med 0 V-enhet) och det finns ingen uteffekt tills lasern skickas en styrspänningen till modulera uteffekten. - Placera en kraftmätare i vävnad prov planet eller i stället för kondensor linsen. Manuellt center mätaren i förhållande till det optiska vägen/objektivet.
- Ställ in mätaren på rätt våglängdsområdet (400-1100 nm). Noll mätaren genom att trycka på motsvarande knapp.
- Markera med programvarukontrollerna 100 (av max 1000, 1000 = 5 V) för 405 nm laser kraften, som sätter lasern till 10% av full effekt. Om så önskas, laser styrspänningen också kan matas in i det PrairieView systemet via VoltageRecord att tillhandahålla ett digitalt register över kommandot signal timing och effektnivå.
- Spela in läsningen från wattmetern.
- Välj 150 (15% av max 1000) för 405 nm laser uteffekten och spela in läsningen från wattmetern. Upprepa detta för följande utdata befogenheter att samla in en laser effektkurvan: 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, och 1000.
- Vänd på 405 nm laser (100 mW maxeffekt med 5 V styrsignal) och låt Lasersystemet och varma upp för ca 10 min.
-
Kalibrera de uncaging laser galvanometrar. Utför följande steg när det finns en ändring av de optiska komponenterna i systemet, när det finns en oro för exakt plats positionering eller regelbundet varje månad.
- Installera 60 x vatten-doppning Mikroskop objektiv som kommer att användas i photostimulation och imaging experiment. I förvärvet/imaging programvara, Välj 60 x objektiv och en optisk zoominställning 1 (se steg 3.1.4.2.).
- Markera en fylld cirkel på ett rent glas mikroskopi objektglas med en röd permanent markör. Placera bilden på Mikroskop scenen, med markör mot målet.
- Förväg fokusera mikroskopet på regionen röd markör med en 4 x eller 10 x mål. Tillsätt 1-2 mL vatten till toppen av röd markör dot/plats och sedan växla till syftet 60 x och sänk målet i vattnet. Fokusera mål linsen på tunna röda markörregionen.
- Växla till 2-photon laserskanning. För de flesta system, flytta tornet position #1, flytta Trinokulärt prismat av ljusstrålen, flytta scan huvud spegeln till framsidan och ange laser våglängd till ~ 900 nm. Välj alternativet 512 x 512 pixlar box för förvärvet bildparametrarna, vilket är pixel standardelementet för rutinen stimulering spegel kalibrering.
- Starta systemet skanning med en tänkbar lasereffekt som är större än minsta och finjustera objektiva fokus på tunn röd fluorescens Märkningslagret. Välj ett fält i fältet fluorescens klar skräp och jämnt belagda med markör.
Obs: Inställningen i detta protokoll använder PrairieView 5.4 förvärv/imaging programvara. - Öppna funktionen Uncaging Galvo kalibrering inom menyn verktyg – kalibrering/justering av programvaran. Gå igenom den bränna ställen handledningen för rumsliga kalibrering av andra galvanometer spegel paret.
- Inom den bränna ställen handledningen, välja 405 nm laser, Välj en lasereffekt stimulering av 400 och stimulering varar 20 ms. Detta bör ge små (~ 1-5 µm diameter) hål i den röda markören.
Obs: Inställningar såsom ~ 2-4 mW och 1-10 ms används vanligen, men inställningarna bestäms av provet. PA-Nic foto-stimulering energiinställningar sannolikt är betydligt lägre än den effekt som krävs under kalibreringen att avlägsna ett synligt hål i den röda markör bilden. Denna kalibrering rutin är användbara för att lokalisera photostimulation ställen men bör inte användas för att härleda absoluta photostimulation volymer under fysiologiska reaktioner. - Välj uppdatering att stimulera och uppdatera bilden efter center plats bränna och flytta den runda röda indikatorn till den faktiska plats platsen. Gör detta för center plats, rätt center plats, lägre center plats, och slutligen för ett rutnät med nio ställen (alla hörn och kanter plus mitten av bilden).
Obs: De center, höger, och lägre korrigerade spot platser avgör stimulering galvanometer spänningar att definiera sann center och X och Y skalning faktorer att matcha stimulering spegel paret till paret imaging spegel. Programvaran kommer att skala och uppdatera, alla efterföljande MarkPoints experiment utförs på zoominställningar skiljer sig från den rumsliga kalibrering zoomen.
- Inom den bränna ställen handledningen, välja 405 nm laser, Välj en lasereffekt stimulering av 400 och stimulering varar 20 ms. Detta bör ge små (~ 1-5 µm diameter) hål i den röda markören.
- Testa kalibreringen genom att öppna fönstret MarkPoints och manuellt aktivera parametrarna stimulering i definierade spot(s) i ett nytt område av provet. Säkerställa att korrekt, senaste kalibrering filen är inläst i fönstret MarkPoints . Aktivera funktionen MarkPoints/grupp eller MarkPoints serien på en definierad spot(s) eller använda funktionen Live/Ablation för att höger/vänster klicka med musen någonstans på bilden under levande skanning för att tillämpa en test-puls och för att kontrollera korrekt kalibrering.
Obs: Laser Bränn plats bör nu vara perfekt centrerad på indikatorn MarkPoints . - Övervaka och registrera aktivering av puls lasereffekt och tidsmässiga varaktighet genom att trycka av enheten spänningen in i VoltageRecord -programmet (se steg 1.1.4). På samma sätt, registrera placeringen av varje stimulering plats med en skalad spänningssignal från feedback signalerna härstammar från para av foto-stimulering galvanometer speglar.
2. förberedelse av Photoactivatable nikotin (PA-Nic)
- Hämta en alikvot av frystorkade photoactivatable drog från lagring.
Obs: Följande protokoll är specifik för PA-Nic; Justera efter behov för andra photoactivatable läkemedel. Även om PA-Nic visar exceptionell stabilitet5, vidta rimliga försiktighetsåtgärder för att skydda det från exponering för ljus under beredning och/eller experiment. Detta kan åstadkommas genom att helt enkelt arbeta i svagt ljus; begränsa till röda filtrerade ljus är inte nödvändigt. -
Utföra lokala tillämpningen av PA-Nic.
- Dra en glas mikropipett med en öppning diameter på 20-40 µm med en programmerbar pipett avdragare.
- Filtrera ~ 1 mL inspelning lösning med ett 0,22 µm filter. Blandas en mängd PA-Nic i filtrerade inspelning lösning att ge en slutlig koncentration på 2 mM. Till exempel lös en 100 nmol frystorkade alikvot i 50 µL filtrerade inspelning lösning.
Obs: En föreslagen inspelning lösning sammansättning kan hittas i senaste publikationer5,6 sysselsätter PA-Nic fotolys. - Back-fylla lokala tillämpningen pipetten med 50 µL av 2 mM PA-Nic.
- Säkra lokala tillämpningen pipetten i en pipett hållaren monterad på en micromanipulator. Anslut pipett innehavaren via lämpliga slangen till ett trycksystem utmatning ihållande lågtryck tillämpas (1-2 psi).
- Använda micromanipulator, manövrera lokalt program pipetten till den extracellulära inspelning lösningen och placera pipettspetsen något över mus hjärnvävnad ligger ~ 50 μm från cellen av intresse. Konsultera en tidigare rapport för ett detaljerat protokoll mus hjärnan slice berednings-och patch clamp inspelningar8.
- Kontrollera parametrarna tillämpning av påtryckningsmedel för kort (1-2 psi). Det bör vara minimal till ingen förskjutning av cellen av intresse. Om betydande rörelse uppstår, flytta lokalt program pipetten längre bort (i laterala och/eller axiell riktning) från cellen av intresse.
- Efter att uppnå stabila hela cellen patch clamp (detaljer som ingår i en föregående offentliggörande8), slå på lågt tryck (1-2 p.s.i.) program med lämpliga manuella växeln på trycket utmatning enheten. Mätta vävnaden som omger cellen med PA-Nic för 1-2 min innan du fortsätter till nästa steg.
-
Utföra bad tillämpning (superfusion) av PA-Nic på hjärnan segmentet.
- Lös upp en kvantitet av PA-Nic i en volym av inspelning lösning lämplig för kontinuerlig återcirkulation att ge en slutlig koncentration på 100 μM. Till exempel lös en 1 μmol alikvotens till 10 mL inspelning lösning med hjälp av en standard 15 mL tub.
- Börja återcirkulation av PA-Nic lösningen med en hastighet av 1,5-2 mL/min genom att öppna lämpligt flödesregleringen i systemet perfusion. Återcirkulation sker under hela inspelningen. För att spara värdefulla läkemedel, minimera återcirkulation volymen med en minimal innerdiameter slangar, eller genom att förkorta den totala längden på slangen som används i systemet perfusion.
Obs: Genom att vidta dessa åtgärder, kan volymen för bad återcirkulation reduceras till 5 mL PA-Nic lösning. PA-Nic lösningar kan ofta användas för två på varandra följande inspelning dagar inom samma vecka om Förvaras skyddat från ljus vid 4 ° C. - Under cirkulation, kontinuerligt bubbla lösningen med carbogen (5% O2, 95% CO2) och hålla badtemperaturen vid 32 ° C.
- Behålla den hjärnan slice i inspelning lösning medan du arbetar med PA-Nic i svagt ljus.
3. imaging nervceller med 2-foton mikroskopi för laserscanning
- Utföra live visualisering av cellen.
- Identifiera/visualisera en medial habenula (MHb) neuron med hjälp av genomlysning eller infraröd differentiell störningar kontrast (IR/DIC) optik och en videokamera och upprätta en stabil hela cellen patch clamp inspelning. Hänvisa till ett tidigare protokoll för detaljer på patch clamp inspelningar från nervceller i akut förberedda mus hjärnan skivor8.
- Efter upprättandet av Högresistent (> 1 GΩ) cell-anslutna konfiguration, men innan inbrott, växla set-up och programvara till laser skanningsläge.
- Efter inbrott, använda laserskanning för att verifiera att en tänkbar färgämne (utspätt till en slutlig koncentration på 100-200 µM till en standard intracellulära pipett lösning beskrivs tidigare8) är passivt (genom diffusion) fylla neuron. Låt färgen (t.ex. Alexa Fluor 488 i gröna fotomultiplikatorn röret [PMT] kanal, PMT 2; eller Alexa Fluor 568 eller 594 i röda PMT kanalen, PMT 1) fylla de cellulära fack för minst 20-30 min innan experiment som kräver visualisering av någon cellulära fack utanför soma.
Obs: Distala fack (dendritiska strukturer, ryggar, axoner, etc.) kan kräva 30-40 min att helt fylla25. - Använda programvaran Live Scan funktion för att visualisera neuron och subcellulär fack av intresse. Välj imaging parametrar som möjliggör korrekt live visualisering av neuronala funktioner. Manipulera olika inställningar för att påverka eller förändra display visualisering (kontrast), upplösning, baserat på signal-brus (S/N) och bild ram förvärv tid:
-
Look-upp-tabell (LUT). Öppna fönstret LUT med hjälp av lämpliga ikonen på sidan av någon bildfönstret. När öppnar, justera LUT golvet (min) och tak (max) inställning av den specifika bild kanalen att förbättra visualisering av signal kontrast visas på skärmen. Sänka det maximala värdet till ~ 1000 (av 4096, 12-bitars detection), som hjälper till att dra ut den dimmer signaler när du först letar celler, signal och struktur.
Obs: Dessa inställningar påverkar bara signalen visas, inte upptäckt/inspelade värden. Mänskliga ögat kan vanligtvis endast göra kontrast till ~ 50 grå nivåer26. -
Optisk zoom. Använd programvara kontroller för att välja 1 X optisk zoom och Använd panorering kontroller för att hitta önskat område i vävnaden. Detta zoominställning ger det största torget, skannas synfält och skickar de största spänningar och skanning vinklarna, till galvanometer speglarna.
Obs: Standardkonfigurationen är för en 12 x 12 mm synfält inne i scan-huvudet som översätts till 12 mm dividerat med objektiva förstoring inuti provet. Därför skannade en 60 x objektiv avkastning bilder av 200 µm per sida på 1 x optisk zoom. Högre optisk zoom värden Skanna mindre område. 2 x optisk zoom är ofta den mest användbar inställningen för att visualisera hela nervceller. 4 x kan vara användbar för att visualisera subcellulär aspekter av nervceller. -
Antalet pixlar. Komplement till 1 x optisk zoom, Välj 1024 x 1024 pixlar per rad med hjälp av programvara kontroller. Ange antalet pixlar per rad i fångade och visas bilden att inte förlora Detaljer möjligt från objektivet. Använd följande praktiska pixelvärdena för en 60 x / 1.0 numeriska bländaröppningen (NA) mål: 1024 x 1024 för zoom 1, 512 x 512 för zoom 2 och 256 x 256 för zooma 4. Pixelstorlek slutet (~0.17 µm; 12 mm/förstoring/zoom/pixlar) bör vara hälften, eller mindre, av lateral upplösning definieras av objektivet.
Obs: Bildens upplösning är endast definieras av laser våglängd och objektiva NA (0,4 µm upplösning från två-photon glada [2] med 920 nm och ett 1.0 NA mål)27. Kriterierna för full excitation NA, som anges på objektivet, är det 1/e2 intensitet laser beam diameter matcherna (eller ”fyller”) entré eleven (2 x tube objektivets brännvidd x NA / förstoring) av objektivet. Tube linsen i det system som beskrivs här har en brännvidd på 180 mm. -
Pixel uppehållstid . Använd programvara kontroller för att välja 4 µs för pixel dröjtiden, en användbar standardvärdet.
Obs: Pixel dröjtiden ändrar inte den genomsnittliga signal upptäckt; det påverkar endast den intra-pixel genomsnitt och dessa förändringar kan visualiseras genom bildkvaliteten via den S/N. Den bild pixel dröjtiden är alltid en multipel av 0,4 µs enheter, och för större dwell ggr 12-bitars-begränsad intensiteten för varje pixel i bilden är Genomsnittligt 0,4 µs prover. Eftersom det S/N-förhållandet förbättrar som kvadratroten av antalet prov per pixel uppehållstid (4 µs lika med tio prover eller 3.16-fold förbättring i S/N), når förbättrade bildkvaliteten avtagande avkastning för värden som är mycket större än 12 µs. -
Skanna Rotation och regionen av intresse (ROI). Ställa in bilden vinkel till 0° rotation med hjälp av programvara kontroller (inga åtgärder kan behövas, eftersom 0° rotation är standardinställningen för de flesta bildsystem). Om provet placeras i en ”uppochned” orientering, Välj 180° rotation till ”flip” bilden.
Obs: Rotera bilden, på någon given vinkel, kan ge en bättre passform för hela området av intresse för en fylld cell. Rotation kan också ge en tydligare grund för att anpassa strukturella förändringar och för att utföra efterföljande analys. Att välja ett område av intresse inom den skannade bilden på en viss zoom (steg 3.1.4.2) inställningen behåller antalet infödda pixel (steg 3.1.4.3), men begränsningen i totala antalet område och pixlar kan dramatiskt öka bildrutehastigheten, förutsatt att förbättrad temporal upplösning av signalförändringar. -
Ram i genomsnitt. Välj en start ram genomsnittliga inställning av 2 ramar med hjälp av programvara kontroller.
Obs: Den slutliga bildkontrasten (S/N) definieras av totala fotonerna samlas in/upptäckts inom signal pixlarna i bilden. Genomsnitt av flera bildrutor kan förbättra kvoten S/N, förutsatt att provet inte flytta eller bleks inte under imaging. Signalera av intresse förblir samma värde under ram i genomsnitt medan bruset i bilden minskas med kvadratroten ur antalet bildrutor i genomsnitt. Små strukturer i fluorescens bilder kräver ofta mellan pixel genomsnitt, kombinerar pixlar inom den bild (ofta kallad ROIs), och/eller ram i genomsnitt. Ram i genomsnitt ökar söktiden med antalet bilder en väljer att i genomsnitt.
-
Look-upp-tabell (LUT). Öppna fönstret LUT med hjälp av lämpliga ikonen på sidan av någon bildfönstret. När öppnar, justera LUT golvet (min) och tak (max) inställning av den specifika bild kanalen att förbättra visualisering av signal kontrast visas på skärmen. Sänka det maximala värdet till ~ 1000 (av 4096, 12-bitars detection), som hjälper till att dra ut den dimmer signaler när du först letar celler, signal och struktur.
- Använda Panoreringsverktyget, Skanna Rotationoch Optisk Zoom verktygen för att orientera provtagningsplats under skanning. Om motoriska scenen manipulation är nödvändigt att placera provet, undvika stora steg storlekar med X, Y och Z-axeln för att förhindra mål/kondensor kollisioner, vibrationer eller exponering av laserstrålen till reflekterande ytor.
- Samla en Z-stack. Med verktyget Z-serie , Välj en start och stoppa position som innehåller cellen av intresse. Välj en stegstorlek (1 µm) och sedan i följd bild neuron i varje Z-planet som innehåller cellen.
Obs: Z-stack förvärv inställningar varierar mellan neuron typ och fylla färgämne. Optimala parametrar för Z-stack förvärv bör fastställas oberoende av parametrar som används för levande imaging. Z-stack förvärv kan utföras före eller efter optopharmacology experiment. Om möjligt, utför Z-stack förvärv efter optopharmacology att undvika cellulär skada inducerad från 2PLSM och möjliggöra optimal dye fyllning av små cellulära fack.
4. laser Flash fotolys under elektrofysiologiska Recordings
Obs: Tillämpa 405 nm eller 473 nm laser befogenheter ≥ 1 mW producerar fosforescens inuti glaset av mål och kondensor linser. Detta genererade ljus är direkt relaterad till den laser belysning makten. utsläppen är närvarande i de gröna och röda spektral windows och har glada-state livstider i intervallet ms. Denna bakgrund stimulering artefakt är sett i alla objektiv testats och vatten-doppning objektiv från alla stora tillverkare av objektiv. Kondensorn linser producera mycket högre fosforescens än objektiv. Denna ”signal” motiverar användning av mekanisk slutare för skydd av de känsliga galliumarsenid upp (GaAsP) PMT katoder under foto-stimulering händelser. Med hjälp av en normalt sluten mekanisk slutare (stängd när du inte aktivt skannar) representerar den bästa lösningen för skydd av kylda GaAsP PMTs.
- För ett timglas-typ photostimulation beam geometri, ta bort alla fokus linser i ljusbanan optiken som skulle annars smala/tygla laserstrålen som det går in objektiva ingången eleven.
- Använder MarkPoints, Välj inställningen enda plats.
Obs: Andra inställningar för foto-stimulering (flera ställen, ett rutnät av fläckar, spiral scanning) är möjliga inom MarkPoints. Enda platsen är det enklaste. Experimentella mål och biologiska skillnader kan kräva en annan inställning. - Uppdatera bilden med alternativet Live Scan kort bild och lokalisera den subcellulär intresseområde. Regelbundet uppdatera bilden för att identifiera alla potentiella små drivor i fokus.
- Använda programvara kontroller för att öka den optiska zoomen (dvs. välja en högre optisk zoominställning än det nuvarande), om nödvändigt, att visualisera små strukturer (dvs spines eller distala dendriter).
- Placera MarkPoints enda plats hårkorset omedelbart angränsande (~0.5 μm) till cellmembranet. Inte plats foto-stimulering plats direkt över en cellulär funktion, eftersom detta kan leda till åldrad hud.
- Ställa in parametrar för foto-stimulering med hjälp av programvara kontroller i MarkPoints. Tillämpa startande riktlinjerna enligt följande: 1-50 ms varaktighet, 1-4 mW laser power och ≥1 rättegång.
- Välj Kör MarkPoints att inleda MarkPoints protokollet och observera elektrofysiologi datainsamling i realtid.
- Upprepa steg 4.2-4.7 flera gånger för att utvärdera konsistens och stabilitet, eller brist på sådan, av svar amplitud och kinetik.
Representative Results
För fotolys är stimulering, exponeringsdos (intensitet och tid), exponering läge och beam geometri viktiga variabler. Systemet beskrivs i denna artikel kan två olika photostimulation balkar, justerbar via flyttar en lins och utcheckning av photostimulation ljusstrålen innan balken träder galvanometer systemet. Utan denna lins, photostimulation strålen fyller ingången eleven av 60 x / 1.0 NA vatten-doppning [60 x WD] mål, producerar en nära-diffraktion-begränsad, sub-µm plats på fokalplanet inuti provet. Detta är förknippat med photostimulation ljus med en timglasform, sträcker sig ovanför och nedanför den focal spot symmetrisk med den optiska axeln. Med objektiv isatt i sökvägen, photostimulation laserljus är inriktad till ingången eleven av objektivet och sedan avslutas som en penna-liknande stråle. Denna balk, som förväntas vara ~ 10 µm i diameter för en 60 x mål, lodrätt jämnt/under hela provet. I det här läget blir ljusintensiteten på valfri plats inom stimulering plats ~ 1% av nära-diffraktion-begränsad liten spot intensiteten. Alltså krävs högre laser befogenheter normalt när du använder ~ 10 µm spot stimulering. För alla experiment rapporterats i denna artikel, användes ett timglas-typ photostimulation-beam.
Levererade prov kraften kan plottas mot inställningen inspänning, efter mätning av laser på provet med hjälp av en kraftmätare. Dessa studier använder en 60 x WD mål med ett avstånd av 2 mm, men det är inte nedsänkt i vatten att undvika potentiella skada elementet detektor mätningar på power. När mål med listan NA > 0,95 mäts i luft (utan nedsänkning vätska), det kan finnas totalreflexion förluster på elementet lins framsidan på grund av det lägre indexet (luft). I detta fall, för en mer exakt prov power mätning (för att korrigera för totalreflexion förluster), öka den uppmätta kraften av 1,0 NA objektiva (1,0/0,95)2 mätt i luften. Figur 1a visar en typisk indata/utdata-tomt för 405 nm och 473 nm synligt lasrar som är införlivade med lasern lansera systemet i denna studie. Dessa lasersystem är idealiska för foto-stimulering dos Exponeringskontroll av följande skäl: (1) de är pre kalibrerad att ge direkt linjär uteffekt i förhållande till inspänning (0-5 V), (2) de ger en tyst slutare drift (med ingen laser produktionen), och (3) de har rapid, sub-ms intensitet puls längd kontroll (0.1 ms svar). När du använder spot foto-stimulering med en laser/galvo system, är rutinmässig kalibrering av MarkPoints ställen en viktig uppgift. Figur 1b (till vänster) visar ett system som är ur kalibrering (önskad punkt att foto-stimulera inte resulterar i exakt stimulering av denna punkt, som indikeras av bränna-håls läge), med en återgång till exakt positionering av plats efter kalibrering ( Figur 1b, högra panelen).
PA-Nic är blygsamt fluorescerande (utsläpp peak på ~ 510 nm), uppvisar effektiv excitation mellan 350-450 nm (1-photon magnetisering) eller 700-900 nm (2-photon magnetisering)5. För att visualisera PA-Nic under lokal applicering, PA-Nic (1 mM) tillämpades nära hjärnvävnad följt av samtidig avbildning av hjärnan (1) vävnad optisk sektionerad överföring sammanhang via Dodt kontrast och (2) utsända fluorescens från excitation (900 nm) av PA-Nic. PA-Nic 2PE fluorescens var lätt att upptäcka under trycket utmatning från ett lokalt program pipett (figur 2a). Nikotin och en monoalkylcoumarin, 7-carboxymethylamino-4-metyl kumarin, är de huvudsakliga fotokemiska produkterna av PA-Nic fotolys reaktion5. Med samma imaging inställningar/parametrar som användes för PA-Nic imaging, fotograferades vävnaden under leverans av antingen nikotin (1 mM) eller 7-carboxymethylamino-4-metyl kumarin (1 mM). Ingen fluorescerande signal upptäcktes (figur 2a, mellersta och nedre paneler), visar specificiteten av PA-Nic resultaten. Slutligen, PA-Nic tillämpades inom hjärnvävnad och PA-Nic fluorescens utsläpp fotograferades (figur 2b). Detta tillvägagångssätt bekräftar att PA-Nic är närvarande inom 100-200 µm i lokala tillämpningen pipetten. Tillsammans, bekräftar dessa uppgifter att PA-Nic effektivt levereras till hjärnans vävnad via lokala program.
Elektrofysiologi inspelningar med samtidiga 2PLSM för visualisering av cellulära strukturer kräver utredaren att balans överväganden för båda komponenterna av experimentet, och ofta ett smalt tidsfönster (~ 20 min) är tillgänglig för giltig prov datainsamling från en lappat cell. Utan med tanke på cellulära visualisering, är det bäst att börja spela in så snart som möjligt efter inbrott eftersom inspelningen stabiliteten tenderar att minska med tiden. Dock när imaging är ett krav, måste elektrofysiologiska överväganden tillåta tillräcklig tid för fluorescens koncentrationen ökar i små/fjärrkontroll strukturer. Detta exemplifieras genom att undersöka en dye koncentration fylla kurva28, vilket är ibland användbart att härleda när imaging en ny celltyp. Figur 3 visar flera exempel nervceller avbildats som Z-stackar via 2PLSM och kollapsat till en maximal intensitet projektion för presentation ändamål. Figur 3a visar bilder av hög kvalitet där neuronala morfologi verkar vara komplett, brus minimeras och skräp inte störa tolkningen av cellulära morfologi. Figur 3b visar bilder av lägre kvalitet, på grund av en lägre signal till bakgrunden baserat och betydande skräp. Detta skräp visas ofta som sfäriska fickor av intensiv fluorescens, som härrör från utmatning av imaging färgämne från patch pipetten samtidigt närmar sig cellen. Bland annat införande av 100 µM PA-Nic i badet (när du utför bad ansökan) tenderar att minska förhållandet signal-till-bakgrund och leder till suboptimala bildens kontrast. Alexa Fluor 568 eller 594 är ofta ganska användbart i lokala tillämpningen experiment som finder färgämne eller som ett normaliserande 2PE referens/normalisering signal. En effektiv våglängd för två-photon excitation av dessa färgämnen är ~ 780 nm27, som tillåter samtidiga visualisering av PA-Nic och identifiering av cellulära fack. Denna våglängd, dock undvika inte helt två-photon fotolys av PA-Nic5. Alexa Fluor 488 är fördelaktigt i PA-Nic bad-ansökan experiment; När glada med en lämplig våglängd ≥900 nm, kan två-photon fotolys av PA-Nic5 undvikas samtidigt bibehålla lämpliga visualisering av cellulära fack.
Figur 4 visar exempeldata för lokaliserad PA-Nic laser flash fotolys på MHb nervceller i hjärnan skivor. Figur 4a (övre paneler) visar ett exempel på en ”referens” bilden, som är en skärm-ta till fånga av den sista 2PLSM bild tagen innan protokollet MarkPoints kördes, övertäckt med foto-stimulering plats platsen. Figur 4a (nedre bilden paneler) visar en inzoomad bild av foto-stimulering spot överlagras på cellulära morfologi. Motsvarande tid-korrelerade elektrofysiologiska svar PA-Nic fotolys visas i figur 4alägre paneler. Tidigare arbete visat att dessa strömningar är känsliga för nAChR antagonister5. Figur 4b visar representativa uppgifter från olika celler där den enda plats fotolys utfördes med ett intervall på antingen 1 s eller 10 s. ett 10 s-intervall får tillräcklig återhämtningstiden för baslinjen hålla nuvarande, kortare 1 s intervall ledde till en gradvis ökning av anläggningen som är aktuella som protokoll fortsatte. Den ökande nuvarande antyder att nikotin inte hade tillräckligt med tid att diffundera bort från systemet med 1 Hz intervall29. Sådana tidsmässiga svar analyser måste vara utfört de novo på någon ny celltyp som studeras, eftersom neurofarmakologi av nAChRs kan skilja sig mellan celltyper.
Figur 1: Photostimulation laser kalibrering. (en) foto-stimulering laser uteffekt. Effekt vid prov planet (genom en 60 x / 1.0 NA vatten-doppning mål) mättes för 405 nm och 473 nm foto-stimulering lasrar på angivna kapacitetsinställningen. (b) foto-stimulering laser kalibrering. Skärm ta till fånga profilen Visa rumslig relation mellan avsedda foto-stimulering plats och motsvarande plats där foto-stimulering inträffade (bränna hål) före (vänster) och efter (höger) kör kalibrering i MarkPoints. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: PA-Nic lokala tillämpningen. (en) identifiering av PA-Nic från en lokal applikation pipett. 1 mM PA-Nic, fotolys biprodukt eller nikotin var upplöst i ACSF lästs in lokalt program pipett och dispenseras på hjärnvävnaden under 2PLSM (900 nm magnetisering) imaging använder samma imaging inställningar för varje läkemedel. Laserscanning Dodt kontrast överföring bilden visar vävnad/pipetten medan en GaAsP katod PMT användes för att fånga fluorescens utsläpp. (b), PA-Nic (1 mM) var perfusion i hjärnvävnad och avbildas via 2PLSM som (en) att Visa laterala spridningen av PA-Nic med dess inneboende fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: förvärv av 2-foton mikroskopi bilder för laserscanning. (en) Optimal 2PLSM Z-stackar. Två exempel på 2PLSM Z-stack maximalstyrkan prognoser är visas av MHb nervceller med väl löst dendriter och lite till inget störande skräp. (b) suboptimala 2PLSM Z-stackar. Två exempel på 2PLSM Z-stack maximalstyrkan prognoser visas för MHb nervceller omgiven av skräp (färgämne utvisas från pipetten under närma sig cellen). Sådana bilder är svårare att tolka än bilderna som de visas i (en). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Laser flash fotolys av PA-Nic. (en) MarkPoints referens bilder och inåtgående strömmar frammanade av PA-Nic fotolys. För en MHb neuron visas rå referensbilder för MarkPoints foto-stimulering prövningar på en enda (indikeras) cellulär plats. Observera att för vissa foto-stimulering platser (den högra bilden i denna serie), dendritiska struktur är i fokus men de soma och proximala dendrite är inte. Under varje referensbild ritas nikotin uncaging-framkallat inåt nuvarande. (b) mellan stimulus intervall för PA-Nic fotolys. Föredöme inspelningar visas för MHb nervceller där nikotin var upprepade gånger uncaged på samma perisomatic plats med ett mellan stimulus intervall 1 s eller 10 s. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Valet av PA-Nic ansökan/leverans metod är det mest kritiska steget i denna lokaliserade foto-stimulering teknik. Två metoder, bad ansökan och lokala perfusion, erbjuder varje olika fördelar och begränsningar. Valet påverkas till stor del av nivån nAChR funktionella uttryck i celltyp av intresse. Det är ofta bättre att använda bad ansökan när funktionella uttryck är höga, som bad ansökan gör för en enhetlig sonden koncentration kring inspelade cellen, att underlätta tolkning av data. Bad ansökan eliminerar också behovet av en andra perfusion pipett i vävnaden, vilket gör hela processen enklare. Dock föreningar bad tillämpningen av dyra kostar mer per experiment.
Felsökning innebär vanligen, försöker förstå varför ingen nAChR aktivering är sett följande flash fotolys. När du arbetar med en celltyp som inte har tidigare studerats med PA-Nic, utredaren bör utföra lokala puff-tillämpningen av ACh eller nikotin att avgöra huruvida tillräcklig receptorer är funktionellt uttryckt5. För att verifiera att systemet är kan upptäcka fotolys svaren, bör kontroll experiment göras i mediala habenula nervceller som uttrycker stora mängder receptor30. I detta hjärnområde är PA-Nic bad program möjligt, vilket är att föredra för validering experiment. Endast efter att ha utfört dessa validering experiment bör man gå vidare till ett outforskat celltyp. Om det experimentella systemet har validerats och svaren förblir mycket små eller omätbara, det kan vara befogat att öka koncentrationen av PA-Nic, öka blixtintensitet eller pulslängd, lägga till en nAChR positiv Alloster modulator att förbättra nAChR verksamhet6, eller någon kombination av dessa.
Ibland, uncaging svaren är alltför stora, med betydande nAChR aktivering resulterar i indirekta spänning gated Na+ kanal aktivering och unclamped inåtgående strömmar på grund av dålig utrymme klämman. Dessa artefakter, som helt skymmer nAChR inåtgående strömmar och omöjliggöra tolkning av data, kan elimineras genom införandet av QX-314 (2 mM) i inspelning pipetten. De kan också elimineras genom att minska koncentrationen av PA-Nic eller att minska blixtintensitet eller pulslängd. I alla synliga ljus foto-stimulering experiment, måste försiktighet iakttas när man väljer stimulering platser att undvika oavsiktlig stimulering/fotolys ovanför eller under önskad fokalplanet. Dessutom och när tillämpligt, laser makt måste alltid titreras för att reproducera fysiologiska reaktioner. Det är särskilt viktigt att vara medveten om z-photostimulation när du arbetar med bur ligander, som ligander som aktiveras ovanför/nedanför fokal plats kan fortfarande diffusa och interagera med det biologiska systemet (dvs., -receptorer) under studien.
PA-Nic laser flash fotolys kanske inte lämpliga för alla utredare, som flera begränsningar finns. Först är de relativt höga kostnaderna för en lämplig set-up. När du arbetar med intakt hjärnan skivor, uncaging nära liten diameter strukturer som dendriter kräver en sofistikerad visualiseringssystem såsom 2-photon Mikroskop. Bortsett från de höga kostnaderna för en Ti:sapphire, avstämbara IR pulsad laser för presterande 2-foton mikroskopi, ökar ett dual-galvanometer system kan självständigt positionering två laserstrålar ytterligare system kostnaden. Systemets totala kostnader kan minskas genom att använda en hembyggda system om Utredaren har tillräcklig kompetens och tid att konstruera, felsöka och underhålla ett sådant system. En andra begränsning ofta innebär låg nAChR funktionella uttryck, som kan mildras delvis genom att vidta åtgärder som nämnts ovan, men detta kan inte garantera framgång. Vanligtvis, om man inte kan mäta ligand-aktiverat strömmar efter puff-applicering av agonister, PA-Nic flash fotolys under spänningen klämman kan inte ge acceptabla resultat. En tredje begränsning innebär den inneboende fluorescens av PA-Nic. PA-Nic absorberar ~ 405 nm ljus och avger i ett liknande utbud som grönt fluorescerande protein (GFP) eller Alexa 4885. När PA-Nic koncentrationerna överskrider ~ 1 mM, kan detta fluorescens boende göra det utmanande att samtidigt visualisera neuronala strukturer. För att minska detta, är det viktigt att kunna enkelt styra flödet av PA-Nic från perfusion pipetten. Regelbundet, stoppades PA-Nic flödet för att tillåta fluorescerande molekyler för att diffundera bort. Detta tillåtet ny avbildning av neuron för att kontrollera avistapositionen i uncaging balken. En fjärde potentiella begränsning att nämna innebär användning av 405 nm ljus för fotolys. Kortare våglängder såsom 405 nm är mer benägna att spridningen i komplexa vävnad såsom ett hjärnan segment. Således, vid en given blixt intensitet och varaktighet, uncaging svar amplituder och decay kinetik differentially påverkas av djupet av uncaging fokus inom segmentet. Slutsatser om biologiska aspekter av nAChRs bör beakta denna viktig varning.
Denna lokaliserade laser flash fotolys teknik har använts nyligen att avslöja nya detaljer om nAChR neurobiologi. Exempelvis förbättrar kronisk nikotin exponering perisomatic och dendritiska nAChR funktion i mediala habenula nervceller5. Det användes också för att visa, för första gången att ventral tegmental area glutamat nervceller uttrycka funktionella nAChRs i sin perisomatic och dendritiska cellulära fack6. Det finns många potentiella framtida använder denna teknik, och metoden skulle kunna tillämpas på andra typer av nyckel neuron som är kända för att uttryckliga nAChRs, såsom kortikala pyramidala nervceller31 eller interneuroner i hjärnbarken32, striatum33 , och hippocampus19. Denna teknik kan också kombineras med farmakologi eller nAChR gen redigering34 för att lokalisera specifik receptor undertyper till olika neuronala fack. Metoden kan lätt anpassas till andra kumarin-bur föreningar, inklusive men inte begränsat till, de utvecklas parallellt med PA-Nic5. Slutligen, PA-Nic flash fotolys kan en dag användas i ett vaket/beter sig djur för att studera nikotins action i romanen beteendemässiga farmakologi paradigm.
Disclosures
D.L.W. fungerar som en betald konsult för Bruker Nano fluorescensmikroskopi.
Acknowledgments
Författarna tackar laboratorium medlemmar av de följande nordvästra Forskargruppsledare: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy och Anis entreprenör. Detta arbete stöddes av oss National Institutes of Health (NIH) (bidrag DA035942 och DA040626 till R.M.D.), PhRMA Foundation (gemenskap till M.C.A.) och HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
| Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
| Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
| (-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
| 7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
| 1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
| Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
| Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
| Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
| 6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
| QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
| Power Meter | ThorLabs | S120C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Solutions | |||
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
| Thiourea | Sigma | T8656 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components of 2-Photon Microscope | |||
| Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
| Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
| Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
| Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
| Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
| Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
| Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
| OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
| OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
| Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
| Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
| Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
| X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
| Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
| Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
| B&W CCD camera; Watec, 0.5 in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
| Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
| 595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
| 565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
| GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
| 525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
| High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
| Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |
References
- Zhang, C., et al. Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications. Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).
- Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).
- Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation. Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).
- Katz, B., Thesleff, S. A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate. Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).
- Banala, S., et al. Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology. Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).
- Yan, Y., et al. Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission. Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).
- Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. α4α6β2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).
- Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
- Ren, J., et al. Habenula "cholinergic" neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes. Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).
- Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity. Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).
- Zhang, J., et al. Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression. Cell. 166 (3), 716-728 (2016).
- Chen, E., et al. Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).
- Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus. Neuroscience. 218, 1-11 (2012).
- Ting, J. T., Feng, G. Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).
- Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice. Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).
- Kolisnyk, B., et al. ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains. The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).
- Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).
- Denk, W. Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).
- Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons. The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).
- Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).
- Tochitsky, I., et al. Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).
- Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities. Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).
- Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons. Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).
- Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons. Elife. 6, (2017).
- Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Science STKE. (219), pl5 (2004).
- Inoue, S., Spring, K. Video microscopy: The fundamentals. , 2 edn, Plenum Press. 163-186 (1997).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing. Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).
- Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses. Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).
- Shih, P. Y., et al. Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula. The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).
- Verhoog, M. B., et al. Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity. Nature Communications. 7, 12826 (2016).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Xiao, C., et al. Chronic nicotine selectively enhances α4β2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).
- Peng, C., et al. Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission. European Journal of Neuroscience. , (2018).
