Summary
यहाँ, हम एक अतिरिक्त फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर candida एल्बिकैंस में mitochondrial श्वसन और glycolytic समारोह की जांच करने के लिए एक पदश: प्रोटोकॉल मौजूद.
Abstract
Mitochondria सेलुलर चयापचय और अस्तित्व के लिए आवश्यक organelles हैं । प्रमुख घटनाओं की एक किस्म माइटोकॉन्ड्रिया में जगह ले, जैसे सेलुलर श्वसन, oxidative चयापचय, संकेत transduction, और apoptosis. फलस्वरूप, रोगजनक कवक के ऐंटिफंगल दवा सहिष्णुता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए mitochondrial शिथिलता की सूचना है । हाल के डेटा भी कवक रोगजनन के लिए एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता के रूप में mitochondria के महत्व की मांयता के लिए नेतृत्व किया है । कवक जीव विज्ञान में माइटोकोनड्रिया के महत्व के बावजूद, मानकीकृत तरीके से अपने कार्य को समझने के लिए खराब विकसित कर रहे हैं । यहां, हम एक प्रक्रिया के लिए बेसल ऑक्सीजन की खपत दर (OCR), माइटोकॉड्रियल श्वसन का एक उपाय है, और extracellular अडिफिकेशन दर (ECAR), सी. एल्बीकांस उपभेदों में glycolytic समारोह के एक उपाय का अध्ययन प्रस्तुत करते हैं । यहां वर्णित विधि किसी भी Candidaspp. संवेदनहीन को बरकरार कवक कोशिकाओं से mitochondria शुद्ध करने की आवश्यकता के बिना लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी सी. एल्बिकन उपभेदों में mitochondrial समारोह के inhibitors के लिए स्क्रीन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
आक्रामक कवक संक्रमण १,५००,००० लोगों को एक साल दुनिया भर में मार डालो । यह संख्या वृद्धि पर समझौता प्रतिरक्षा के साथ रहने वाले लोगों की संख्या में वृद्धि के कारण है, बुजुर्गों सहित, समयपूर्व शिशुओं, प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं, और कैंसर के रोगियों1। C. albicans एक अवसरवादी मानव कवक रोगज़नक़ है कि मानव माइक्रोफ्लोरा का एक हिस्सा है । यह भी श्लेष्मिक सतहों और एक कोमेंसल जीव के रूप में जठरांत्र संबंधी मार्ग में जलधाराओं । C. एल्बीकांस उन लोगों में गंभीर प्रणालीगत बीमारी पैदा करता है, जिनके पास प्रतिरक्षा की कमी है, जो शल्य चिकित्सा करते हैं, या जो एंटीबायोटिक दवाओं के लंबे पाठ्यक्रमों के साथ इलाज किया गया है । कैंडिडा प्रजातियों मनुष्यों में nosocomial संक्रामक रोगों (एनआईडी) के शीर्ष तीन से चार कारणों में रैंक2,3,4,5,6,7. Candida खून संक्रमण की वार्षिक वैश्विक संख्या का अनुमान है ~ ४००,००० मामलों में, 46-75%1के एसोसिएटेड की शर्तों के साथ । कैंडिडिआसिस की वार्षिक मृत्यु दर लगभग १०,००० संयुक्त राज्य अमेरिका में अकेले है । कवक के कारण एनआईडी की मात्रा भी खगोलीय रोगी व्यय5में परिलक्षित होता है । संयुक्त राज्य अमेरिका में, आक्रामक कवक संक्रमण के उपचार के लिए वार्षिक खर्च $२,०००,०००,००० से बढ़कर, पहले से ही मुलभुत स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली के लिए एक बड़ा दबाव जोड़ने । वर्तमान में, उपलब्ध मानक ऐंटिफंगल चिकित्सा क्योंकि विषाक्तता के सीमित हैं, तेजी से प्रचलित दवा प्रतिरोध, और नशीली दवाओं बातचीत । इसलिए, वहां एक तत्काल नए ऐंटिफंगल दवा लक्ष्य है कि उच्च जोखिम वाले रोगियों के लिए बेहतर इलाज के विकल्प में परिणाम होगा की पहचान की जरूरत है । हालांकि, कवक लक्ष्य पर काम कर रहे नई दवाओं की खोज जटिल है क्योंकि कवक यूक्योट्स हैं । यह बहुत कवक विशेष दवा लक्ष्य की संख्या को सीमित करता है ।
हाल के अध्ययनों से संकेत मिला है कि mitochondria कवक और ऐंटिफंगल दवाओं के लिए सहिष्णुता के लिए एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता है mitochondria सेलुलर श्वसन के लिए महत्वपूर्ण हैं, oxidative चयापचय, संकेत transduction, और apoptosis8 ,9,10,11. दोनों glycolytic और गैर glycolytic चयापचय स्तनधारी मेजबान12,13,14,15,16में सी. ऐल्बिकन्स के अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, कई सी. ऐल्बिकन म्यूटेंट में माइटोकोड्रियल प्रोटीन की कमी होती है, जैसे कि Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 आदि को फाइलेमेंटेशन में दोषपूर्ण दर्शाया गया है, c. ऐल्बिकन17 का एक महत्वपूर्ण विलक्षणकारी कारक 18 , 19 , 20 , 21 , 22. इसके अलावा, इन म्यूटेंट भी फैलाया कैंडिडिआसिस17,18,19,20,21 के एक माउस मॉडल में विरूंस के लिए क्षीणता दिखाया गया ,22. इस प्रकार, कवक mitochondria दवा की खोज के लिए एक आकर्षक लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । हालांकि, सी. एल्बीकेंस में माइटोकोड्रियल फंक्शन का अध्ययन चुनौतीपूर्ण है क्योंकि c. ऐल्बिकेंस पेटिट निगेटिव23है, जिसका मतलब है कि यह माइटोकोड्रियल जीनोम के बिना जीवित नहीं रह सकता ।
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि माइटोकॉनड्रिया को शुद्ध करने की आवश्यकता के बिना सी. एल्बिकन्स में mitochondrial और glycolytic समारोह की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन. इस विधि के आनुवंशिक हेरफेर या रासायनिक नियन्त्रक के प्रभाव की जांच करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है माइटोकॉड्रियल और C. albicansमें glycolytic रास्ते पर ।
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Protocol
नोट: विस्तृत परख के पदश: प्रोटोकॉल नीचे वर्णित है, और योजनाबद्ध प्रोटोकॉल चित्रा 1में दिखाया गया है ।
1. एलबीवांस संवेदनहीन और विकास की स्थिति
- तरल खमीर निकालने में सी. एल्बीकेंस उपभेदों विकसित-Peptone-डेक्सट्रोज (ypd) मध्यम 30 डिग्रीसेल्सियस पर एक मशीन में शेखर रात भर ।
नोट: जमे हुए शेयरों और YPD आगर पर बढ़ने के रूप में Candida उपभेदों को बनाए रखने (1% खमीर निकालने, 2% peptone, 2% डेक्सट्रोज, और 2% आगर) ।
2. अभिकर्मकों की तैयारी
- परख माध्यम के रूप में इस प्रकार तैयार:
- mitochondrial समारोह परख के लिए, भंग १.०४ जी Roswell पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) १६४० पाउडर और 2 जी ग्लूकोज (2%) ९० मिलीलीटर बाँझ पानी में और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए मीडिया को गर्म । 5 एम NaOH का उपयोग ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें और बाँझ पानी के साथ १०० मिलीलीटर करने के लिए मात्रा बनाने ।
- glycolytic तनाव परख के लिए, भंग १.०४ g RPMI १६४० पाउडर में अकेले ९० मिलीलीटर बाँझ पानी, मीडिया को गर्म करने के लिए ३७ ° c और पीएच को समायोजित करने के लिए ७.४. बाँझ पानी के साथ १०० मिलीलीटर करने के लिए मात्रा बनाओ । rpmi १६४० पाउडर कोई बिकरबोनेट, जो परख के दौरान ग्लाइकोलिसिस के एक उपाय के रूप में पीएच परिवर्तन की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है ।
- इंजेक्शन यौगिकों ।
- 20 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ पानी और स्टोर में 1 एम ग्लूकोज शेयर तैयार करें ।
- डिमेथिल सल्फोक्साइड (DMSO) में १०० mM oligomycin स्टॉक तैयार करें, छोटी मात्रा में aliquot और स्टोर-20 डिग्री सेल्सियस पर ।
- तैयार १०० मिमी एंटिमाइसिन DMSO में एक शेयर, छोटी मात्रा में aliquot और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
- परख के दिन इथेनॉल में १०० मिमी शम (salicylhydroxamic एसिड) स्टॉक तैयार करें ।
- बाँझ पानी में 1 एम KCN को परख के दिन तैयार करें ।
3. पाली-डी-Lysine (PDL) के साथ परख थाली की कोटिंग
नोट: एक स्तरीय हूड में नीचे दिए गए सभी चरणों का पालन करें ।
- ५० μg/एमएल अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए ऊतक संस्कृति ग्रेड पानी में पाली-डी Lysine भंग । यह अच्छी तरह से मिश्रण और एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में और स्टोर-20 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के लिए ।
नोट: ५० μL प्रति अच्छी तरह से की जरूरत है, और 24 कुओं के लिए, १.२ मिलीलीटर की आवश्यकता है । इसलिए, माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के अनुसार कम-से १.३ मिलीलीटर पर aliquot । - ५० μL प्रति अच्छी तरह से जोड़ें और 1-2 एच के लिए कवर ढक्कन के साथ कमरे के तापमान पर सेते ।
- समाधान महाप्राण और ५०० μL बाँझ ऊतक संस्कृति ग्रेड पानी के साथ एक बार कुल्ला ।
- ढक्कन खोलो और कुओं सूखी हवा के लिए अनुमति देते हैं । एक ही दिन में थाली का प्रयोग करें या 2-3 दिन की अधिकतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
4. सेंसर कारतूस का हाइड्रेशन
नोट: प्रयोग के एक दिन पहले यह चरण निष्पादित करें ।
- अतिरिक्त फ्लक्स परख किट खोलें और सामग्री को हटा दें । संवेदक कारतूस उल्टा उपयोगिता प्लेट के बगल में प्लेस (चित्रा 2) ।
- 1 मिलीलीटर के साथ उपयोगिता प्लेट की एक अच्छी तरह से भरें और सेंसर कारतूस वापस जगह । सुनिश्चित करें कि सेंसर जो फ्लुओरोफोरेज़ होते हैं (ऑक्सीजन और पीएच को मापने के लिए) जांचना में डूबे हुए हैं ।
- सेंसर कारतूस एक गैर में रातोंरात सेते-सह2 ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
5. बढ़ रही है और PDL में कोशिकाओं बोने-लेपित प्लेटों
- ypd शोरबा में सी. एल्बीकेंस inoculate और २०० rpm पर एक शेखर में 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बढ़ने ।
नोट: परख डिजाइन और ब्याज के आधार पर, सी albicans भी ypg या ंयूनतम माध्यम में उगाया जा सकता है । - परख के दिन, परख माध्यम में कोशिकाओं की एक उपयुक्त संख्या पतला करने के लिए १०० μL प्रति १००,००० कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता उपज ।
- कुओं A1, B4, C3, और D6, जिसमें पृष्ठभूमि सुधार के लिए परख माध्यम के केवल १०० μL जोड़ने के अलावा परख थाली के प्रत्येक कूप में पतला कोशिकाओं के १०० μL जोड़ें (चित्रा 3) ।
- प्लेट को ३७ डिग्री सेल्सियस पर नॉन-सह2 इनयूबेटर पर स्थानांतरित करें और ६० मिनट के लिए सेते, जो कोशिकाओं को प्लेट की सतह का पालन करने देगा ।
6. परख प्रोटोकॉल
नोट: यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल उपकरण के 24-well स्वरूप के लिए है । यदि किसी अंय स्वरूप का उपयोग किया जाता है तो वॉल्यूंस समायोजित करने की आवश्यकता होगी ।
- माइटोकोड्रियल फलन परख
- यौगिकों की तैयारी
- मिटोकॉन्ड्रयल फंक्शन परख के लिए 10x एकाग्रता में यौगिकों तैयार करें: इसी परख माध्यम में 20 मिमी शम, १०० μM Oligomycin, १०० mM KCN, और 20 μM Antimycin एक तैयार करें ।
- बंदरगाह में एक, ५५ μL Oligomycin बंदरगाह में बी, ६२ μL KCN में बंदरगाह सी और ६८ μL Antimycin में एक बंदरगाह डी में ५० μL शम जोड़ें (चित्रा 4) ।
- यौगिकों की तैयारी
- Glycolytic तनाव परख
- यौगिकों की तैयारी
- glycolytic तनाव परख के लिए 10x एकाग्रता में यौगिकों तैयार । तैयार १०० मिमी ग्लूकोज, १०० μM Oligomycin, ५०० मिमी 2-Deoxy ग्लूकोज (2DG) और इसी परख माध्यम में 20 μM Antimycin एक.
- बंदरगाह में ५० μL ग्लूकोज जोड़ें A, ५५ μL Oligomycin बंदरगाह में बी, ६२ μL 2-डीजी बंदरगाह में सी और ६८ μL Antimycin एक बंदरगाह डी में.
- यौगिकों की तैयारी
- अतिरिक्त फ्लक्स विश्लेषक है, जो ऑक्सीजन की खपत दर (OCR) और एक 24-well थाली प्रारूप में जीवित कोशिकाओं की extracellular अडिफिकेशन दर (ECAR) उपायों को रोजगार । अग्रिम में परख प्रोटोकॉल की स्थापना की ।
- अतिरिक्त फ्लक्स विश्लेषक खोलें और परख जादूगर टैब का उपयोग करके परख टेंपलेट की स्थापना की और सभी जानकारी है कि सेटअप के दौरान बाहर चबूतरे को भरने के लिए कदम से कदम अनुदेश का पालन करें । चित्र 5में दिखाए गए के समान समूह लेआउट जनरेट करें । तालिका 1में दर्शाए अनुसार प्रोटोकॉल सेट करें । परख से पहले अच्छी तरह से आगे इन लेआउट सेट और कंप्यूटर में बचाने के लिए । परख के समय, बचाया प्रोटोकॉल को खोलने में संबंधित फ़ाइल खोलें फ़ाइल विकल्प में परख जादूगर टैब (चित्रा 5) खोलकर पुनर्स्थापित करें ।
- अतिरिक्त फ्लक्स विश्लेषक के वाहक ट्रे में अंशांकन और लोड युक्त हाइड्रेटेड संवेदक कारतूस के संबंधित बंदरगाहों में 10x यौगिकों लोड । स्क्रीन पर प्रारंभ बटन दबाकर अंशांकन प्रारंभ करें ।
- परख मध्यम के ३५० μL जोड़ें कुओं के किनारे के साथ सेल प्लेट को धीरे से सेल अशांति को कम करने के लिए ४५० μL करने के लिए अंतिम खंड लाने के लिए ।
- उपयोगिता प्लेट परख थाली के साथ और जारी रखने के साथ अंशांकन की जगह ।
- संवेदक कारतूस और थाली निकालें एक बार परख पूरा हो गया है । उपयुक्त गंतव्य फ़ोल्डर में फ़ाइल सहेजें ।
7. डेटा विश्लेषण
- चित्र 6में दर्शाए अनुसार संबंधित पैरामीटर्स (ocr या ecar) का चयन कर समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर की गणना करने के लिए सॉफ़्टवेयर में वक्र-विश्लेषण के प्रसरण (auc-anova) विश्लेषण टैब के अंतर्गत क्षेत्र का उपयोग करें ।
- उन समूहों का चयन करें जिनकी तुलना की जानी चाहिए ।
- ANOVA के लिए विश्लेषण समूहों में जोड़ें और ठीकक्लिककरें ।
नोट: यह एओसी ANOVA विश्लेषण उस फ़ाइल में एक नया पत्रक जोड़ेगा जिसमें प्रत्येक समूह के लिए AUC की गणना की जाती है और ANOVA द्वारा उनके बीच तुलना की जाती है. यह महत्व दिखाने के लिए पी मूल्यों की एक मेज दे देंगे ।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल का ध्यान अतिरिक्त फ्लक्स विश्लेषक द्वारा मूल्यांकन C. albicans के bioenergetic कार्यों का निर्धारण करने के लिए है । एक ग. ऐल्बिकेन्स उत्परिवर्ती का अभाव माइटोकोड्रियल प्रोटीन Mam33 भी इसके पूरक तनाव के साथ शामिल है, mam33Δ/Δ:: Mam33 ओसीआर और ecar पर एक mitochondrial प्रोटीन के विलोपन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए. MAM33 encodes के लिए एक ख्यात माइटोकोड्रियल अंलीय मैट्रिक्स प्रोटीन और candida में अपने कार्य ज्ञात नहीं है ।
अतिरिक्त फ्लक्स परख के लिए सेल नंबर
हम 1x 105 सी. एल्बीकांस के प्रति अच्छी तरह से अतिरिक्त फ्लक्स परख है, जो १४५ pmol/मिनट (चित्रा 7), जो किसी भी extracellular प्रवाह परख के लिए 100-300 pmol/ यह भी महत्वपूर्ण है के लिए सेल नंबर परख से पहले एक इष्टतम OCR प्राप्त करने के लिए या जब वहां विभिंन assays के बीच वृद्धि मध्यम संरचना में परिवर्तन है ।
आंकड़ों का विश्लेषण
सॉफ्टवेयर में वक्र-विश्लेषण के प्रसरण (एओसी-ऐनोवा) विश्लेषण टैब के अंतर्गत क्षेत्र का प्रयोग संबंधित पैरामीटरों (ओसीआर अथवा ईसीआर) के रूप में चित्र 7में दर्शाए अनुसार समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर की गणना करने के लिए किया गया था । इस विश्लेषण में उस फ़ाइल में एक नया पत्रक जोड़ा गया जिसमें प्रत्येक समूह के लिए AUC की गणना की गई थी और उंहें स्वचालित रूप से ANOVA द्वारा, जिसमें p मान तालिका दी गई थी, की तुलना की गई थी ।
माइटोकोड्रियल फलन परख
mitochondrial तनाव परीक्षण में, परख बेसल ऑक्सीजन की खपत दर (ocr) एक वैकल्पिक ऑक्सीडेस (aox), एटीपी synthase, और इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला परिसरों, चतुर्थ और तृतीय के inhibitors के इंजेक्शन के बाद मापने के साथ शुरू होता है । शास्त्रीय श्वसन श्रृंखला के अलावा, C. albicans भी ऊर्जा उत्पादन के लिए aox मार्ग का इस्तेमाल24। इसलिए, हम OCR पर एओएक्स प्रणाली के प्रभाव salicylhydroxamic एसिड (अन्तर्वासना)25का उपयोग करके अपनी गतिविधि में बाधा की जांच की । माइटोकोड्रियल फलन, जिसे बेसल में पमोल/मिनट में ऑक्सीजन उपभोग दर (ओसीआर) के रूप में मापा जाता था और संबंधित अवरोधकों को इंजेक्शन लगाने के बाद चित्र 7में दर्शाया जाता है । जंगली प्रकार, mam33Δ/δ, और mam33Δ/δ:: MAM33 उपभेदों के आधार ocr कोई मतभेद नहीं दिखाया (चित्र 7ए और बी) । इसी प्रकार, बेसल इकार में कोई महत्वपूर्ण अंतर इन उपभेदों के बीच नहीं देखा गया (चित्र 7ग और घ) । हालांकि, kcn द्वारा जटिल चतुर्थ बाधा द्वारा, जंगली प्रकार और mam33Δ/δ:: MAM33 mam33Δ के विपरीत ग्लाइकोलिसिस की ओर एक महत्वपूर्ण बदलाव दिखाया /Δ, जो काफी एक क्षतिपूरक glycolytic पारी दिखाने में विफल (चित्रा 7 ई), सुझाव है कि सी चतुर्थ निर्भर glycolytic मार्ग जंगली प्रकार और mam33Δ/δ:: MAM33 उपभेदों की तुलना में mam33Δ/δ उत्परिवर्ती में बिगड़ा हुआ है ।
Glycolytic तनाव परख
glycolytic तनाव परीक्षण में, कोशिकाओं 1 एच के लिए ग्लूकोज के लिए भूखे थे और बेसल ओसीआर और ECAR मापा गया था. भुखमरी पर, mam33Δ/δ काफी कम ocr दिखाया (चित्रा 8ए और बी) और Ecar (चित्रा 8सी और डी) जंगली प्रकार और mam33Δ के मुकाबले /δ:: MAM33 उपभेदों ग्लूकोज के एक बिगड़ा उपयोग का सुझाव दोनों श्वसन और ग्लाइकोलिसिस के लिए जब कोशिकाओं को भुखमरी की स्थिति के लिए मजबूर कर रहे हैं । ग्लूकोज इंजेक्शन लगाने के बाद, सभी उपभेदों OCR और ECAR दोनों की उत्तेजना दिखाई । हालांकि oligomycin दोनों ओसीआर और ECAR, 2-डीजी, जो glycolysis के एक प्रतिस्पर्धी अवरोध करनेवाला है पर कम प्रभाव है, दोनों OCR और ECAR रोकता है । विशेष रूप से, 2-डीजी आंशिक रूप से ओसीआर को रोकता है, जो आगे एन्टिमाइसिन ए द्वारा हिचकते हैं । इसके विपरीत, 2-डीजी लगभग पूरी तरह से रोकता है ECAR.
तालिका 1. परख के लिए प्रोटोकॉल आज्ञाओं
चित्रा 1 . प्रयोग का योजनाबद्ध निरूपण कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 . सेंसर कारतूस (ग्रीन) अंशांकांत जोड़ने से पहले उपयोगिता थाली के पास उल्टा रखा । फ्लोरोहोरेज़ तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 . सेल कल्चर प्लेट A1, B4, C3, और D6 पृष्ठभूमि कुओं दिखा रहा है । नीले निशान पायदान से पता चलता है, निचले बाएँ करने के लिए उन्मुख. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4 . सेंसर कारतूस के शीर्ष भाग के बंदरगाहों ए, बी, सी और डी दिखा । तीर चिह्न पायदान से पता चलता है, निचले बाईं ओर उंमुख । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5 . कुओं और समूह असाइनमेंट के लेआउट के रूप में सॉफ्टवेयर में कल्पना । WT-वंय प्रकार; MT- mam33Δ/Δ उत्परिवर्ती; COMP-mam33Δ/Δ:: MAM33 के पूरक तनाव. तीर चिह्न खोलें फ़ाइल टैब दिखाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6 . समूह के बीच के महत्व की गणना करने के लिए वक्र (एओसी) ANOVA विश्लेषण टैब के अंतर्गत क्षेत्र । उन समूहों का चयन करें जिनकी तुलना की जा सके और ANOVA के लिए विश्लेषण समूहों में जोड़ें और ठीक क्लिक करें. यह एओसी ANOVA विश्लेषण उस फ़ाइल में एक नया पत्रक जोड़ेगा जिसमें प्रत्येक समूह के लिए AUC की गणना की जाती है और ANOVA द्वारा उनके बीच तुलना की जाती है. यह महत्व दिखाने के लिए पी मूल्यों की एक मेज दे देंगे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7. माइटोकोड्रियल फलन परख C. एल्बिकियों. ऑक्सीजन की खपत और बाह्य अडिलीकरण दरों को वन्य प्रकार, Mam33 δ/δ, और Mam33 δ/δ:: mam33 उपभेदों के रूप में मापा गया । A) बेसल श्वसन पर ऑक्सीजन उपभोग दर (OCR) का वास्तविक समय ग्राफ (2 मिमी), Oligomycin (10 μM), KCN (10 मिमी), और Antimycin एक (2 μM) के परिणाममूलक इंजेक्शन के बाद । ख) वक्र के अंतर्गत क्षेत्र की तुलना (एओसी) जंगली प्रकार के बीच आधारी ओसीआर, mam33Δ/δ, और mam33Δ/δ:: C. albicans के MAM33 उपभेदों कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा । ग) बेसल ग्लाइकोलिसिस में extracellular अंलीकरण दर (ECAR) का एक वास्तविक समय ग्राफ (2 मिमी), Oligomycin (10 μM), KCN (10 मिमी), और Antimycin एक (2 μM) के क्रमिक इंजेक्शन के बाद । D) वक्र के अंतर्गत क्षेत्रफल की तुलना (एओसी) जंगली प्रकार के बीच आधारी ईकार, mam33Δ/δ, और mam33Δ/δ:: C. albicans के MAM33 उपभेदों कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा । (ङ) वक्र के अंतर्गत क्षेत्र की तुलना वन्य प्रकार, mam33Δ/δ और Mam33 δ/δ के बीच (एओसी) ईकेआर के mam33 उपभेदों सी-IV अवरोध करनेवाला kcn के इंजेक्शन के बाद, glycolytic में महत्वपूर्ण कमी दिखाने के mam33Δ/ जंगली प्रकार और पूरक संवेदनहीन मूल्यों की तुलना में उत्परिवर्ती औसत ± मानक त्रुटि मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । * p < 0.05, * * p < 0.001 एक तरह से ANOVA द्वारा महत्वपूर्ण माना जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 8 . सी. ऐल्बिकन्समें ग्लाइकोलाइटिक तनाव की परख होती है । ऑक्सीजन की खपत और extracellular अडिफिकेशन जंगली प्रकार में मापा गया, mam33Δ/Δ उत्परिवर्ती वे संतृप्त ग्लूकोज एकाग्रता के तीव्र इंजेक्शन के बाद ग्लूकोज के लिए भूखे थे के बाद. क) कोशिकाओं के बाद ऑक्सीजन की खपत दर का एक वास्तविक समय ग्राफ बेसल ECAR के अधीन किया गया और इसके बाद ग्लूकोज (10 मिमी), Oligomycin (1 μM), 2-डीजी (४० मिमी), और Antimycin एक (2 μM) के अनुक्रमिक इंजेक्शन के द्वारा । ख) बार ग्राफ जंगली प्रकार, mam33Δ/δ के बीच बेसल ग्लाइकोलिसिस के वक्र ecar के तहत क्षेत्र दिखा रहा है, और mam33Δ/δ:: MAM33 C. albicansके उपभेदों. ग) कोशिकाओं के बाद glycolytic समारोह के एक वास्तविक समय ग्राफ बेसल ECAR के अधीन थे ग्लूकोज (10 मिमी), Oligomycin (1 μM), 2-डीजी (40mM), और Antimycin एक (2 μM) के अनुक्रमिक इंजेक्शन के बाद । D) बार ग्राफ जंगली प्रकार, mam33Δ/δ के बीच बेसल ग्लाइकोलिसिस के वक्र ecar के तहत क्षेत्र दिखा रहा है, और mam33Δ/δ:: MAM33 C. albicans मूल्यों के उपभेदों औसत ± मानक त्रुटि माध्य के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । * पी < 0.05, * * * पी < 0.0005, * * * * पी < 0, 0001 के रूप में एक तरह से ANOVA महत्वपूर्ण माना जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
bioenergetics अतिरिक्त फ्लक्स परख एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में कार्य करता है के लिए बाहर oxidative फास्फोरिलेशन (OXPHOS)-वास्तविक समय में निर्भर ऑक्सीजन की खपत को मापने से mitochondrial समारोह पढ़ें । इसके अलावा, एक glycolytic समारोह है जो एक extracellular अडिफिकेशन दर के रूप में मापा जाता है (extracellular पीएच में परिवर्तन) भी वास्तविक समय विश्लेषण में एक ही समय में जांच की जा सकती है ।
परख थाली में सी. albicans के सफल चढ़ाना परख में महत्वपूर्ण चरणों में से एक है क्योंकि pdl लेपित प्लेटों में कोशिकाओं के ऊष्मायन कोशिकाओं परख थाली का पालन करने के लिए अनुमति देते हैं । पालन सी albicans कोशिकाओं के दृश्य प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पूरा किया है । अनुचित सेल पालन कुओं, जो replicates के बीच असंगत रीडिंग के साथ परख परिणाम को प्रभावित करेगा में तैर कोशिकाओं को जंम दे सकता है । इसी तरह, यह करने के लिए इस परख में पहला कदम के रूप में सेल संख्या टाइट्रेट करने के लिए 100-300 pmol के बीच एक OCR प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है/ इसके अलावा, इष्टतम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए यौगिकों titrating भी इष्टतम प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । जब भी बेसल मीडियम कम्पोजिशन में बदलाव होता है तो यह किया जा सकता है ।
DMEM स्तनधारी कोशिकाओं के लिए अतिरिक्त प्रवाह परख में सबसे अधिक इस्तेमाल किया बेसल मध्यम है । हालांकि, हमारे हाथ में, RPMI १६४० मध्यम C. albicansके साथ इष्टतम परिणाम दिया । यह मुख्यतः मिटोकॉड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन कॉम्प्लेक्स अवरोधकों की प्रभावकारिता के कारण था, जो DMEM की तुलना में RPMI १६४० मध्यम में बेहतर काम करता था ।
इस परख में, जंगली प्रकार, mam33Δ/δ, और mam33Δ/δ:: C. albicans के MAM33 उपभेदों का उपयोग किया गया माइटोकॉड्रियल श्वसन और glycolytic दक्षता का आकलन करने के लिए. परिणामों से स्पष्ट रूप से पता चलता है कि MAM33 जीन का विलोपन सी . एल्बीकन्स की क्षमता को कम करने के लिए तनाव की स्थिति में जैसे सी चतुर्थ के निषेध (चित्रा 7सी और 7e) के तहत ग्लाइकोलिसिस में बदलाव । इसी प्रकार, जब कोशिकाओं ग्लूकोज भुखमरी की तरह तनाव की स्थिति के अधीन थे, दोनों mitochondrial श्वसन और glycolytic दक्षता में काफी समझौता किया है mam33Δ/Δ उत्परिवर्ती लेकिन जंगली प्रकार में नहीं है और पूरक उपभेदों ( चित्रा 8). इसलिए, प्रयोगों के आधार पर, RPMI १६४० में कार्बन स्रोतों भी ग्लिसरॉल या galactose करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, जो कोशिकाओं के बजाय glycolysis OXPHOS का उपयोग करने के लिए मजबूर.
अतिरिक्त फ्लक्स परख का उपयोग कर के महत्व यह है कि विभिंन substrates और यौगिकों कि परेशान mitochondrial समारोह का उपयोग करके, कोशिकाओं की क्षमता के लिए उपयोग करने के लिए oxphos बनाम ग्लाइकोलिसिस inferred किया जा सकता है । यह एक जानकारीपूर्ण उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है mitochondrial समारोह पर किसी भी उपचार या जीन के प्रभाव को समझने और एक प्रकार का दस्ताना अलग बिना candida एल्बिकैंस में ग्लाइकोलिसिस । परख उपाय बेसल ऑक्सीजन की खपत दर (OCR), जो mitochondrial श्वसन का एक उपाय है, और extracellular अडिफिकेशन दर (ECAR), जो दोनों ग्लूकोज की उपस्थिति और ग्लूकोज भुखमरी के बाद glycolytic समारोह का एक उपाय है । अतिरिक्त फ्लक्स सेलुलर परख अच्छी तरह से स्तनधारी मॉडल26की एक किस्म में कार्यरत है । सी एल्बीकन्सके चिकित्सीय महत्व के बावजूद, फफूंद मिटोकॉनड्रिया में अनुसंधान को कुछ हद तक मानकीकृत प्रायोगिक प्रक्रियाओं की कमी के कारण वास्तविक समय में माइटोकोड्रियल फंक्शन और ग्लाइकोलिसिस का अध्ययन करने में बाधा आई है ।
यह विधि सी. एल्बिकांस में वास्तविक समय extracellular प्रवाह परख का उपयोग करके mitochondrial श्वसन और glycolytic दक्षता की जांच का एक आसान और सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है । भविष्य में, इस परख भी दवा का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है प्रभावकारिता आमतौर पर ऐसे fluconazole के रूप में कार्यरत antifungals का उपयोग कर परीक्षण । इसके अतिरिक्त, इस विधि का एक और संभावित भविष्य आवेदन दवा खोज में है, विशेष रूप से सी. एल्बीक्ंसके mitochondrial समारोह लक्ष्यीकरण यौगिकों के लिए ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है
Acknowledgments
नेकां प्रयोगशाला में अनुसंधान स्वास्थ्य के एक राष्ट्रीय संस्थान (NIH) अनुदान R01AI24499 और ंयू जर्सी स्वास्थ्य फाउंडेशन (NJHF) अनुदान, #PC40-18 द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
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