Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

في المختبر التمايز نموذج الذاكرة البشرية العادية ب الخلايا إلى خلايا البلازما المعمرة

Published: January 20, 2019 doi: 10.3791/58929
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3
1IGH, CNRS, Univ Montpellier, 2Laboratory for Monitoring Innovative Therapies, Department of Biological Hematology, CHU Montpellier, 3UFR de Médecine, Univ Montpellier

Summary

تستخدم نظم الاستزراع متعدد خطوة، نحن تقرير خلية بفي المختبر إلى خلية البلازما تمايز النموذجي.

Abstract

تفرز كميات كبيرة من الأجسام المضادة خلايا البلازما (أجهزة الكمبيوتر) وتطوير من الخلايا ب أنه قد تم تنشيط. أجهزة الكمبيوتر هي نادرة الخلايا الموجودة في نخاع العظام أو الغشاء المخاطي وضمان حصانة humoral. نظراً لتردد منخفض والموقع، دراسة لأجهزة الكمبيوتر من الصعب في الإنسان. أبلغنا أ ب للكمبيوتر نموذج التمايز في المختبر باستخدام مجموعات مختارة من الجزيئات السيتوكينات والتنشيط التي تسمح بإعادة إنتاج التمايز الخلية متسلسلة تحدث المجراة في. في هذا النموذج في المختبر، ذاكرة الخلايا ب (MBCs) سوف تفرق في ما قبل بلاسمابلاستس (بريببس)، بلاسمابلاستس (PBs)، أوائل أجهزة الكمبيوتر، وأخيراً، إلى المعمرة أجهزة الكمبيوتر، مع النمط الظاهري إغلاق لنظرائهم في الأشخاص الأصحاء. بنينا المعلوماتية الحيوية وصول مفتوح أيضا أدوات لتحليل المعلومات الأكثر بروزا من جيب البيانات المتصلة بالتمييز بين أجهزة الكمبيوتر. يمكن استخدام هذه الموارد لدراسة ب البشرية إلى التمييز بين أجهزة الكمبيوتر، وفي الدراسة الحالية، ونحن التحقيق في تنظيم التعبير الجيني عوامل جينية خلال ب البشرية إلى التمييز بين أجهزة الكمبيوتر.

Introduction

التفريق بين الخلايا ب إلى خلايا البلازما (أجهزة كمبيوتر) ضروري للحصانة humoral وحماية البلد المضيف ضد العدوى1. ب للكمبيوتر التمايز يرتبط بتغييرات كبيرة في قدرات النسخ والايض لاستيعاب لإفراز الأجسام المضادة. وقد درست عوامل النسخ التي تتحكم ب للتمايز الكمبيوتر على نطاق واسع وكشف شبكات الحصرية بما في ذلك النسخ المحددة ب والكمبيوتر عوامل (TFs)2. في الخلايا ب، وهي PAX5، و BCL6، و BACH2 TFs أولياء الأمور من الخلية بهويه2،3. سوف إخماد جينات الخلية بتحريض IRF4، PRDM1 ترميز BLIMP1 و XBP1 PC TF وحمل منسقة إفراز جسم خلية برنامج النسخي3،4،5. هذه التغييرات النسخي منسقة ترتبط بتفعيل النسخ الجينات Ig جنبا إلى جنب مع التحول من شكل غشاء زمنياً بشكل يفرز الغلوبولين المناعي السلسلة الثقيلة2،3، 4-ب إلى التمايز الكمبيوتر مرتبط بتحريض المورثات المشتركة في هيولى ووظائف المتزامن مع تنشيط استجابة (الاستعراض) البروتين تكشفت المعروفة للعب دور رئيسي في جهاز الكمبيوتر باستيعاب التوليف جهاز غولجي ويفرز المناعية6،7. TF XBP1 يلعب دوراً رئيسيا في هذا التكيف الخلوي8،،من910.

ب خلايا وأجهزة الكمبيوتر هي الجهات الفاعلة الرئيسية من الحصانة humoral. فهم البيولوجية العمليات التي تتحكم في الإنتاج وبقاء خلايا البلازما العادية أمر حاسم في التدخلات العلاجية التي بحاجة إلى ضمان فعالية الاستجابات المناعية ومنع المناعة الذاتية أو نقص المناعة. أجهزة الكمبيوتر هي خلايا نادرة مع التمايز المراحل المبكرة التي تجري في المواقع التشريحية التي تعوق توصيف كامل البيولوجية، وبخاصة في الإنسان. تستخدم نظم الاستزراع متعدد خطوة، أبلغنا ب في المختبر نموذج التمايز PC. يستنسخ هذا النموذج بتمايز الخلية متسلسلة والنضج التي تحدث في أجهزة مختلفة في الجسم الحي11،،من1213. في خطوة أولى، يتم تنشيط أولاً لمدة أربعة أيام قبل تركيبة يجند وأوليجوديوكسينوكليوتيديس وسيتوكين CD40 خلايا الذاكرة ب وتفرق في بريبلاسمابلاستس (بريببس). في خطوة ثانية، هي التي يسببها بريبلاسمابلاستس تفرق في بلاسمابلاستس (PBs) عن طريق إزالة التحفيز CD40L وأوليجوديوكسينوكليوتيديس وتغيير تركيبة سيتوكين. في خطوة ثالثة، هي التي يسببها بلاسمابلاستس تفرق في أوائل أجهزة الكمبيوتر عن طريق تغيير تركيبة سيتوكين11،12. خطوة الرابعة وقدم للحصول على أجهزة الكمبيوتر ناضجة تماما باستزراع هذه أجهزة مبكرة مع نخاع العظام الخلايا اللحمية مكيفة المتوسطة أو تحديد عوامل النمو13. أجهزة الكمبيوتر هذه ناضجة يمكن البقاء على قيد الحياة منذ عدة أشهر في المختبر وإفراز كميات عالية من الغلوبولين المناعي (الشكل 1). من المثير للاهتمام، ولدينا نموذج في المختبر يجمل التغييرات النسخي المنسقة وفي النمط الظاهري ب مختلف مراحل الكمبيوتر التي يمكن أن يكون تم اكتشافها في المجراة11،،من1213،14 ،15. أجهزة الكمبيوتر هي الخلايا النادرة ونموذجنا التمايز في المختبر يسمح للدراسة ب البشرية إلى التمايز PC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية وفقا "إعلان هلسنكي" واتفاق مركز مستشفى جامعة مونبلييه "الموارد البيولوجية".

1-في المختبر عادي خلية البلازما تمايز النموذجي

ملاحظة: يتم تكوين أجهزة الكمبيوتر من خلال ثقافة أربع خطوات11،،من1213.

  1. خلية بالتضخيم والتمايز
    1. استخدام خلايا الدم المحيطية من المتطوعين صحية للذاكرة تنقية الخلية ب.
    2. تمييع 7.5 مل دم مع مل 24.5 في المتوسط RPMI 1640.
    3. إضافة 12.5 مل من درجة حرارة الغرفة الكثافة المتدرجة (مثلاً، فيكول) إلى أنبوب مخروطي عقيمة 50 مل. تراكب التدرج الكثافة مع 32 مل الدم المخفف بلطف. تقليل الخلط بين المرحلتين.
    4. الطرد المركزي 20 دقيقة في 500 x ز مع الفرامل قبالة. جمع في ببمكس من واجهة التدرج/كثافة البلازما المخفف ومكان الخلايا في أنبوب عقيم 50 مل وإكمال إلى 45 مل مع الحل هانك الملح المتوازن.
    5. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 500 x ز. بعناية إزالة المادة طافية وإبقاء بيليه.
    6. إضافة 45 مل من مصل العجل الجنين RPMI1640/10% (FCS) وأجهزة الطرد المركزي 5 دقائق في 500 x ز. بعناية إزالة المادة طافية وإبقاء بيليه. إضافة 30 مل السفح PBS/2%.
    7. إزالة CD2 + الخلايا باستخدام الخرز المغناطيسية المضادة-CD2. إضافة 4 حبات للخلية الهدف واحد. احتضان 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
      1. خلايا منفصلة زمنياً حبة من الخلايا غير منضم باستخدام مغناطيس لتطبيق الفصل بين الخلية. جمع الخلايا غير منضم واحتضان بيليه الخلية مع مكافحة CD19 APC ومكافحة CD27 PE الأجسام المضادة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية (2 ميليلتر من جسم 106 خلايا).
      2. تغسل مرتين في مصل الماعز PBS/10%.
      3. إزالة تلويث الأحداث في مؤامرات منتدى التعاون الأمني والتعاون بين بلدان الجنوب على حد سواء. ارسم نوع في منتدى التعاون الأمني-أ مقابل مقابل ح منتدى التعاون الأمني والتعاون بين بلدان الجنوب-أ ح ال SSC مؤامرات لإزالة الحطام وتحديد السكان مجموع الكريات البيض. حدد خلايا الذاكرة ب CD19/CD27 و CD19+CD27+.
      4. تنقية MBCs باستخدام أرز خلية بدرجة نقاء 95%.
    8. تنفيذ كافة الخطوات ثقافة استخدام FCS إيمدم و 10 في المائة، وتستكمل مع 50 ملغم/مل البشرية ترانسفيرين و 5 ملغ/مل الأنسولين البشري.
    9. لوحة تنقية MBCs في الثقافة جيدا ست لوحات (1.5 × 105 مليلتر MBCs في 5 مل/جيد)، لمدة 4 أيام، مع إيل-2 (يو 20/mL)، إيل-10 (50 نانوغرام/مل)، وايل-15 (10 نانوغرام/مل).
      1. إضافة فوسفوروثيواتي البد ODN 2006، معلم الحامض الأميني الماشوب البشري قابل للذوبان CD40L (sCD40L؛ 50 نانوغرام/مل) ومكافحة بوليهيستيديني ماب (5 ملغ/مل) للتنشيط MBCs (الشكل 1). التنشيط بواسطة sCD40L أو ODN مع محصول كوكتيل سيتوكين نفسه إلى انخفاض التضخيم12فقط. مزيج إشارات التنشيط الموصوفة هنا المحتوى على الرصاص للحد الأقصى لعدد تنشيط خلايا ب وبريببس11،12 (الشكل 1).
      2. للتنميط التعبير الجيني، تنقية CD38/CD20–– بريببس، في يوم 4، باستخدام أرز خلية (الشكل 2).
  2. جيل خلية بلاسمابلاستيك
    1. في يوم 4، عد الخلايا.
    2. لوحة خلايا في لوحات الثقافة 12-جيدا في 2.5 × 105/mL في 2 مل/جيدا.
    3. يحفز التمايز بإزالة النوكليوتيد CpG و sCD40L وإضافة وسيلة ثقافة جديدة مع سيتوكين جديد كوكتيل بما في ذلك إيل-2 (يو 20/mL)، إيل-6 (50 نانوغرام/مل)، إيل-10 (50 نانوغرام/مل)، وايل-15 (10 نانوغرام/مل) (الشكل 1). خلايا الثقافة لمدة 3 أيام (من يوم 4 إلى يوم 7) عند 37 درجة مئوية.
    4. للتنميط التعبير الجيني، تنقية CD38+/CD20– برنامج تلفزيوني، في يوم 7، استخدام أرز خلية (الشكل 2).
  3. بداية الخلية البلازمية جيل
    1. في يوم 7، عد الخلايا.
    2. لوحة خلايا في لوحات الثقافة 12-جيدا في/mL 5 × 105في 2 مل/حسنا.
    3. التفريق بين الجريدة الرسمية في أوائل أجهزة الكمبيوتر باستخدام الطازجة الثقافة المتوسطة مع إيل-6 (50 نانوغرام/مل)، إيل-15 (10 نانوغرام/مل) و IFN-α (500 U/mL) لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية. للتنميط التعبير الجيني، تنقية CD20/CD38–+/CD138+ أجهزة المبكر، في يوم 10، استخدام أرز خلية (الشكل 2).
  4. جيل المعمرة بلازما الخلية
    1. التفريق بين "أوائل أجهزة الكمبيوتر" إلى أجهزة الكمبيوتر عاش فترة طويلة بتغيير شروط الثقافة.
    2. الثقافة الخلايا في لوحات الثقافة 12-جيدا في/mL 5 × 105في 2 مل/استخدام خلية stromal وايل-6 مكيفة جيدا أو في لوحات الثقافة 24-جيدا في 1 مل/أيضا على 37 درجة مئوية، المتوسطة ونيسان/أبريل (200 نانوغرام/ملليلتر).
    3. الحصول على stromal المتوسطة مكيفة الخلية باستزراع الخلايا اللحمية لمدة 5 أيام مع الثقافة المتوسطة. تصفية طافية ثقافة الخلية stromal (0.2 ميكرون) وتجميدها.
    4. إضافة 50% من stromal مكيفة خلية الإعلام للثقافات PC مع تجديد كل أسبوع. يمكن الإبقاء على أجهزة الكمبيوتر المعمرة التي تم إنشاؤها لأشهر13. ويمكن الحصول على البقاء مدة طويلة لأجهزة الكمبيوتر مع إيل-6 ونيسان/أبريل فقط كما ذكرت13.
    5. فرز إفراز Ig قياس التدفق الخلوي من أجهزة الكمبيوتر.
    6. أجهزة الثقافة في 106 خلايا/مل ح 24 وحصاد الثقافة طافية. قياس مفتش وايغا استخدام الإنسان المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا) مجموعات11،12،13. متوسط إفراز مفتش تراوحت بين 10 بيكوغرام/خلية/يوم في يوم 10 إلى 17 جزء من الغرام/خلية/يوم في اليوم 6013.

2-الجزيئية أطلس ب للتمايز PC

ملاحظة: وبنينا وصول مريحة وفتح أدوات المعلوماتية الحيوية لاستخراج وتصور المعلومات الأكثر بروزا من جيب Affymetrix البيانات المتصلة بالكمبيوتر التمايز (جينوميكسكابي)15. جيب متاحة علنا من قاعدة البيانات أرراييكسبريس (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)، بما في ذلك تنقية MBCs، بريببس، وبرنامج تلفزيوني وابكس: ه-MTAB-1771، ه-ميكسب-2360 و14،ه-ميكسب-3034 وعطاءات ه-ميكسب-236015. جينوميكسكابي ويبتول متاحة بحرية.

  1. تحديد ب إلى PC dataset
    1. حدد ب إلى dataset الكمبيوتر في قائمة استعراض البيانات في الوصول المفتوح جينوميكسكابي بيوينفورماتيك أداة (http://www.genomicscape.com) تسمى الخلايا "البشرية ب" إلى خلايا البلازما. التصور للشخصية التعبير الجيني للجينات الفريدة أو قائمة بالجينات متاح باستخدام أداة التقرير التعبير-كوكسبريشن في أدوات التحليل المتاحة في الصفحة الرئيسية.
  2. تحليل تحت إشراف وتحليل المكونات الرئيسية (PCA)
    1. حدد "أدوات التحليل" | ويبسام لتحميل الأداة سام.
    2. اختر dataset الخلايا "البشرية ب" إلى خلايا البلازما وتحديد مجموعات العينات للمقارنة.
    3. استخدام عوامل التصفية المختلفة المتاحة لتطبيق خيارات التصفية للفائدة.
    4. لمقارنة ملامح التعبير الجيني مع أداة سام، قم بتعديل خيارات التصفية بما في ذلك حظيرة التغيير، عدد التباديل، معدل اكتشاف كاذبة والنوع من المقارنة. جينوميكسكابي سوف تحسب التحليل وتقديم الجينات أعرب متفاوتاً بين المجموعات المحددة.
    5. تشغيل تحليل المكونات الرئيسية عن طريق تحديد تحليل العنصر الرئيسي في القائمة أدوات التحليل .
    6. اختر dataset الخلايا "البشرية ب" إلى خلايا البلازما وحدد المجموعات ذات الاهتمام.
    7. قم بلصق قائمة جينات فائدة أو تحديد الجينات وفقا للفرق. للصق قائمة بالجينات، وحدد جينوميكسكابي لتحليل قائمة بالجينات/نكرناس، انقر هنا... سوف تحسب محكمة التحكيم الدائمة التي يمكن أن تصور وتحميلها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويمثل الإجراء العام للتمايز الكمبيوتر العادي في المختبر في الشكل 1. باستخدام بروتوكول المعروضة هنا، ونحن يمكن أن تولد كمية كافية من الخلايا التي لا يمكن الحصول عليها مع السابقين فيفو العينات البشرية. على الرغم من أن قد تم التحقيق دور الشبكة المعقدة من عوامل النسخ المشاركة في التمييز بين أجهزة الكمبيوتر، تظل آليات تنظيم الشبكات النسخ التمايز الكمبيوتر الرئيسية المعروفة بشكل قليل. التمايز الخلوي معظمها تحركها تغييرات جينية والنسخي. استخدام نموذجنا في المختبر وب إلى كمبيوتر جيب أطلس، نحن التحقيق التغييرات التعبير عوامل جينية في تمايز الخلية البلازما العادية.

تعبير عامل جينية في تمايز الخلية البلازما العادية
حددنا كعوامل جينية أولئك الذين ينتمون إلى أسر التالية: الحمض النووي ميثيلترانسفيراسيس (دنمت)، والبروتينات الميثيل-البد-ملزمة المجال (مليون برميل يوميا)، أسيتيلترانسفيراسيس هستون (قبعة)، هيستون ديسيتيلاسيس (هداك)، ميثيلترانسفيراسيس هستون (جرارات) و هيستون ديميثيلاسيس (HDM) كما تم وصفه سابقا لسرطان الخلايا16 (تكميليةالجدول 1). نحن التحقيق جينية العوامل الأثران أعرب خلال التمايز الكمبيوتر استخدام نموذجنا في المختبر، تنقية الناضجة نخاع العظام أجهزة الكمبيوتر (بمبكس) واستخدام "B لكمبيوتر أطلس" المتاحة ويبتول جينوميكسكابي (الشكل 2). باستخدام تحليل سام فئة متعددة، وجدنا الجينات 71 كثيرا متفاوتاً بين MBCs، بريببس، وبرنامج تلفزيوني، وأوائل أجهزة الكمبيوتر وبمبكس مع معدل اكتشاف كاذبة < % 5 (الشكل 3أ&3B و التكميليةالجدول 2). تتميز المرحلة أم بي سي قبل overexpression من 23 لاعب جينية الجينات منها 39.13% من هيستون أسيتيلترانسفيراسيس (القبعات)، 30.43% من هيستون ميثيلترانسفيراسيس (همتس)، 21.74% من هيستون ديميثيلاسيس (هدمتس)، 4.35 في المائة من البروتينات ملزمة الميثيل و 4.35 في المائة هداكس (الشكل 4). كانت overexpressed اللاعبين جينية 14 على وجه التحديد في مرحلة بريببس بما فيها 50% همتس و 21.43% من هداكس، 7.14% من هدمتس و 14.28% من دنمتس 7.14% من القبعات (الشكل 3). تتميز المرحلة برنامج تلفزيوني ب overexpression من 5 لاعبين جينية مع هدمتس 2، 2 همتس ودنمت 1. هي overexpressed 4 لاعبين جينية في أوائل أجهزة الكمبيوتر (هداك 1 وهات 1، 1 جرارات والبروتين ملزمة الميثيل 1). في بمبكس، كانت عوامل جينية 10 overexpressed على وجه التحديد بما في ذلك 50% جرارات (تكميليةالجدول 2).

تحدث التغييرات الأكثر أهمية في التعبير عوامل جينية أثناء MBCs الانتقال بريببس مع downregulation 23 MBCs الجينات و upregulation من 14 بريببس جينية الجينات (الشكل 4). إلى حد كبير overexpressed MBCs القبعات المشاركة في التعديلات بوسترانسلاشونال من هيستونيس. هيستون acetylation يؤثر هيكل الكروماتين أدى إلى ديكوندينسيشن الكروماتين وزيادة نسخ جينات التي يتم إسكات ابيجينيتيكالي بالضغط الكروماتين. MBCs للانتقال بريببس يرتبط أيضا مع دوونريجوليشن كبيرة من القبعات، تحولاً كبيرا في التعبير همتس والإثراء في التعبير الجيني هداكس ودنمتس. من المثير للاهتمام، أيضا تتميز المرحلة بريبب ب overexpression جرارات مست . ممسيت/WHSC1/NSD2 هو مجال مجموعة التي تحتوي على ميثيلترانسفيراسي يسين هيستون الذي يمكن من هستون دي--وتريميثيلاتي H3 على يسين 36. وتشارك مست في إزفاء t(4;14)(p16;q32) المعاملة بالمثل في مجموعة فرعية من المايلوما المتعددة المرتبطة بسوء التشخيص. وأفيد أن ممسيت تشارك في إصلاح الحمض النووي تنظم استحثاث مثلايشن H4K20 في هيستونيس حول فواصل مزدوجة حبلا الحمض النووي، الذي، بدوره، يسهل 53BP1 التوظيف17. بريببس العالية تنتشر MBCs مقارنة مع 50% خلايا في المرحلة S11 مما يوحي بأن مرحلة بريببس يمكن أن تكون مقترنة إجهاد ريبليكاتيفي عالية. ويمكن المشاركة overexpression ممسيت في منع النسخ المتماثل الإجهاد الناجم عن تلف الحمض النووي في بريببس.

PB وأوائل أجهزة الكمبيوتر عرض عوامل جينية مماثلة التعبير التشكيلات الجانبية (الشكل 2). تتميز بمبكس أوفيريكسبريسيون محددة من جرارات وهداك المرتبطة بإفراز Ig الإجهاد التكيف، بما في ذلك EHMT2 و HDAC6. تتميز إلى سينثيتيزي بمبكس ناضجة وتفرز كميات كبيرة من الأجسام المضادة. هذا التوليف عالية من المناعية مقترن تجمعات إجهاد الناجم عن البروتين وتطوير استجابة هيولى (ER) لاستيعاب هذا الإنتاج. نتائجنا تثبت الجينات الرئيسية التعبير تغييرات جينية من العوامل التي قد تلعب دوراً هاما خلال ب لتمييز جهاز الكمبيوتر من خلال أحداث إعادة برمجة جينية بوساطة.

Figure 1
الشكل 1 : نموذج التمايز في المختبر بلازما الخلية. نموذج التمايز PC يلخص الخطوات المختلفة للإنسان جهاز كمبيوتر الجيل. في خطوة أولى، يتم تنشيط أولاً لمدة أربعة أيام قبل تركيبة يجند وأوليجوديوكسينوكليوتيديس وسيتوكين CD40 خلايا الذاكرة ب وتفرق في بريبلاسمابلاستس. في خطوة ثانية، هي التي يسببها بريبلاسمابلاستس تفرق في بلاسمابلاستس عن طريق إزالة التحفيز CD40L وأوليجوديوكسينوكليوتيديس وتغيير تركيبة سيتوكين. في خطوة ثالثة، هي التي يسببها بلاسمابلاستس التفريق في وقت مبكر البلازما الخلايا عن طريق تغيير تركيبة سيتوكين11،12. وقدم للحصول على خلايا البلازما ناضجة تماما باستزراع هذه الخلايا البلازما المبكر مع stromal خلايا نخاع العظام أو اتفاقية استكهولم مكيفة المتوسطة ونيسان/أبريل لمدة شهرين13خطوة الرابعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : نموذج التمايز PC الإنسان تسليط الضوء على التعبير CD20 و CD38 و CD138 في مرحلة ما قبل بلاسمابلاستس (بريببس)، بلاسمابلاستس (PBs) واستخدام خلايا البلازما (أجهزة كمبيوتر) التي تسمح لتنقية الخلية فارز والتنميط التعبير الجيني أفيميتريكس. ويبتول جينوميكسكابي يسمح بتصور الشخصية تعبير الجينات واحد أو عدة تهم في ب PC التمايز مجموعة البيانات وتحليل الجينات أعرب متفاوتاً بين الفئات السكانية الفرعية الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تحليل سام فئة متعددة. الإشارات لعوامل جينية 71 إلى حد كبير الأثران أعرب خلال ب إلى التمايز PC (سام التحليل؛ فرانكلين روزفلت < 0.05) في خلايا الذاكرة ب (MBCs، ن = 5)، بريبلاسمابلاستس (بريببس، ن = 5)، بلاسمابلاستس (الجريدة الرسمية، n = 5)، أوائل بلازما خلايا (أجهزة الكمبيوتر في وقت مبكر، ن = 5) وخلايا البلازما العادية نخاع العظام (بمبكس، ن = 5) يتم عرضها من منخفضة (أزرق) للتعبير (الأحمر العميق) عالية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 4
الشكل 4 : النسبة المئوية لجينات جينية المنتمين إلى دنمتس والبروتينات الميثيل-البد-ملزمة المجال (ميثيلبب)، أسيتيلترانسفيراسيس هستون (قبعة)، هيستون ديسيتيلاسيس (هداك)، هيستون ميثيلترانسفيراسيس (جرارات) وهيستون ديميثيلاسيس فئات كثيرا overexpressed في MBCs أو بريببس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلية الجدول 1: اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الجدول 2: اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في الإنسان، جهاز كمبيوتر هي خلايا نادرة مع مراحل التمايز تجري في الأماكن التشريحية التي تعوق توصيف كامل البيولوجية. وقد وضعنا ب في المختبر لنموذج التمايز الكمبيوتر باستخدام نظم الاستزراع متعدد خطوة حيث يتم بعد ذلك تطبيق تركيبات مختلفة من السيتوكينات وجزيئات التنشيط بغية إعادة إنتاج التمايز خلية المتسلسلة التي تحدث في أجهزة مختلفة/الأنسجة في الجسم الحي11،،من1213.

وكانت الأخرى ب كفاءة في المختبر لنماذج التمييز بين أجهزة الكمبيوتر عنها18،في الفترة من19. النموذج الذي وضعته جالو Le et al. استكشاف ب تي خلية تابعة للتمايز PC مع منهجية ثقافة خطوتين بدءاً من CD19+/CD27– من السذاجة ب الخلايا. Cocco وآخرون عن نموذج في المختبر لإنشاء أجهزة معمرة بدءاً من مجموع الخلايا ب19. يحاكي استراتيجيتنا بالتنشيط والتفرقة التي تحدث في مركز جيرمنال مع CD40 ومستقبلات الشبيهة بحصيلة تفعيل محاكاة خلايا تي المساعدة ومستضد التنشيط المستخدمة في تركيبة مع السيتوكينات التي تنتجها الخلايا الجذعية والضامة ومساعد تي . التنشيط مع sCD40L و ODN البد تؤدي إلى توليد بريببس التي تم تحديدها في العقد الليمفاوية ولوزه ونخاع العظام في الإنسان11،20. تتميز هذه المرحلة الانتقالية بعدم وجود علامات CD20 و CD38 و CD138 وكوكسبريشن ب و TFs الكمبيوتر، ولكن بمستوى أقل بالمقارنة مع الخلايا باء، برنامج تلفزيوني، أو الكمبيوتر11. هذه المرحلة الانتقالية باهتمام خاص نظراً لأنه مقترن بروتوزوم مثبط للمقاومة في المايلوما المرضى20،21. حتى لو كان يمكن أن تتولد أجهزة الكمبيوتر دون18،إيل-1519، إضافة إيل-15 قدم، في أيدينا، أمثل النتائج في توليد CD20–CD38++ الخلايا في يوم 411،12. إضافة إيل-21 ستكون ذات أهمية خاصة منذ 21 إيل يعزز التمايز الكمبيوتر عن طريق الاستقراء المنطاد توسط التنشيط STAT3 كما ذكر سابقا19،22. كما أفاد Cocco et al. مجمع الثقافة الظروف المحتوية على إيل-21، IFN-α و IL6 و stromal مكيفة خلية دعم متوسطة الجيل من أجهزة الكمبيوتر المعمرة. ونحن أفادت أن البقاء الطويل الأجل لأجهزة الكمبيوتر يمكن دعمها، في المختبر، استخدام إيل-6، نيسان/أبريل والمتوسطة stromal مكيفة الخلية أو عوامل النمو اثنين فقط. Stromal خلايا إنتاج عوامل النمو الكمبيوتر الرئيسية، لا سيما إيل-6 وجاليكتين13،19،،من2324،25 والحفاظ على التفاعلات بين المكونة للدم الخلايا وأجهزة الكمبيوتر26. وعلاوة على ذلك، نيسان/أبريل واحد من عوامل النمو الرئيسية المعنية ببقاء أجهزة الكمبيوتر، التي تنتجها الخلايا المكونة للدم27،28. لتجنب عدم تجانس المتصلة بمصادر مختلفة من الخلايا اللحمية، استخدمت رستو-6 خلايا اللحمية، نمواً وتوفيرها من قبل مختبر كارين البراندي، بين الفقرات 8 و 1513،29. خلايا رستو-6 التعبير عن علامات خلية stromal CD90 و CD73 و CD105 ودعم كفاءة نمو طبيعي والخبيثة خلايا ب29.

ومع ذلك، يمكن ملاحظة عدم تجانس معتدلة في النسبة المئوية لتنشيط خلايا ب، بريببس، وبرنامج تلفزيوني، وأجهزة الكمبيوتر اعتماداً على بالدم صحة التبرع المستخدمة للذاكرة المحمولة بتنقيه11،،من1213. أجهزة الكمبيوتر التي تم إنشاؤها بالمعمرة هي غير-ركوب الدراجات أجهزة الكمبيوتر، والباقين على قيد الحياة وإنتاج المناعية لأكثر من ثلاثة أشهر في المختبر، ك نظيره في المجراة على13. أجهزة معمرة إكسبريس عالية CD138 والجينات التعبير التشكيلات الجانبية المتصلة المجراة في أجهزة الكمبيوتر13. وعلاوة على ذلك، تتميز بنسبة أعلى من المقسمة إلى أونسبليسيد XBP1 جنبا إلى جنب مع التعبير أعلى من عوامل النسخ IRF4 وأجهزة PRDM1 المعمرة أجهزة الكمبيوتر التي تم الحصول عليها في المختبر مقارنة بأوائل أجهزة الكمبيوتر التي تم الحصول عليها في يوم 1013.

ويعتقد جينية ومراقبة التغييرات النسخي التحولات الخلوية أثناء التطوير. ومع ذلك، التفريق بين الخلايا الليمفاوية ب المحطة الطرفية إلى خلايا البلازما هو عملية فريدة من نوعها تعديلات جينية التي لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. ووفقا لذلك، نحن مؤخرا حلل ميرنومي العادي PC التمايز وحددت رواية ميرناس الرئيسية تنظيم الشبكات أهمية بالنسبة للكمبيوتر العادي التفريق14. لقد أظهرنا أن ميرناس عدة يمكن أن يشارك أيضا في تنظيم التعبير عن عوامل النسخ الرئيسية خلال PCD، بما في ذلك IRF4، PRDM1، ELL2، و ARID3A14. ووفقا لذلك، قدمنا هنا وصف ملامح جينية الجينات ذات الصلة خلال ب إلى تمايز جهاز الكمبيوتر باستخدام منصة مفتوحة للجميع جينوميكسكابي. هذا النهج يسمح لنا بتحديد لونين تعديل الجينات إنزيم أعرب على وجه التحديد في المراحل المختلفة للتمييز بين أجهزة الكمبيوتر. إلى حد كبير overexpressed MBCs القبعات المعروف أنها تسبب نوليوسومال يعيد البناء التي تكشف مواقع ربط النسخ. وأبلغ التعديلات هيستون بوستترانسكريبشونال، بما في ذلك acetylation هستون في منطقة المروج TFs الرئيسية بالخليه بما في ذلك30، PAX5، سيتا، شبيب و BCL631. وعلاوة على ذلك، أثبتت أن كريبب و EP300 (overexpressed في MBCs) تتفاعل مع BCL6 تحليل البروتين ويمكن أن تلعب دوراً في تنظيم النسخي BCL632. وأبدى أيضا PAX5، لتنظيم التعبير الجيني المستهدف بتجنيد الكروماتين يعيد البناء وهستون تعديل البروتينات33. وأبدى Pax5 لحفز مثلايشن H3K4 وأسيتيليشن H3K9 على المروجين لتلك الجينات الهدف مفعّلة33.

التغييرات جيب عامل جينية رئيسية تم تحديدها خلال MBCs الانتقال بريببس مع دوونريجوليشن رئيسية للقبعات جنبا إلى جنب مع زيادة في التعبير همتس وإثراء التعبير الجيني هداكس ودنمتس. بريبب المرحلة الانتقالية هو سكان خلية المتكاثرة الغاية11. ووفقا لذلك، عدة عوامل جينية معروفة للمشاركة في مراقبة انتشار الخلايا بما في ذلك DNMT134، EZH235،36،،من3738 وممسيت39،40 تم تحديدها، ويمكن أن يشاركوا في الاستقراء خلية التنشيط والانتشار خلال مرحلة بريبب.

في نهاية المرحلة ب PC التمايز، أوفيريكسبريسيد بمبكس عوامل جينية، بما في ذلك EHMT2 و HDAC6، المعروف أن تشارك في أية استجابة الإجهاد. جهاز غولجي ER ودور رئيسي في جهاز الكمبيوتر لاستيعاب توليف Ig يفرزها. في خلايا سرطان المثانة، تثبيط EHMT2 يحفز الإجهاد ER ويستحث المبرمج41. HDAC6 ينتمي إلى عائلة هداكس 2b فئة. ومن المعروف أن تلعب دوراً في التوازن البروتين والاستعراض الدوري الشامل42،43 ومثبطات HDAC6 يتم اختبارها في التجارب السريرية لاستهداف أجهزة الكمبيوتر الخبيثة في الورم النخاعي المتعدد. تسطير البيانات لدينا أن عوامل جينية قد تلعب دوراً في التوازن Ig المعمرة إفراز أجهزة الكمبيوتر.

استخدام ناقلات لينتيفيرال و/أو مثبطات محددة، فإنه يمكن أن تكون مثيرة للاهتمام للتحقيق في دور هذه الممرات البيولوجية والكروماتين تعديل الإنزيمات في إعادة عرض الكروماتين والتمايز الكمبيوتر ووظائفه كما تم وصفه سابقا بمجموعتنا 44.

المعرفة المستمدة من هذا البحث يمكن إعلام وإرشاد حول الاستراتيجيات التشخيصية والعلاجية لاضطرابات جهاز الكمبيوتر، كما هو الحال في حالة الورم النخاعي المتعدد، سرطان دون علاج نهائي لتنبؤ أفضل وتحسين الاستراتيجيات العلاجية التي هناك حاجة ماسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgments

بتأييد هذا العمل بمنح من "الإنكا الفرنسية" (المعهد الوطني للسرطان دو) معهد (PLBIO15-256) ووكالة الاستخبارات الوطنية (التعادل-تخطي) وسرطان إيتمو (ملم وترينيداد وتوباغو).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-CD2 magnetic beads Invitrogen 11159D
Anti-CD138-APC Beckman-Coulter  B49219
Anti-CD19-APC BD 555415
Anti-CD20-PB Beckman-Coulter  B49208
Anti-CD27-PE BD 555441
Anti-CD38-PE Beckman-Coulter  A07779
Anti-histidine R&D Systems MAB050
CpG ODN(PT) Sigma T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human Transferin Sigma-Aldrich T3309
IFN-α Merck Intron A
IMDM Gibco 31980-022
Recombinan Human CD40L-hi R&D Systems 2706-CL
Recombinant Human APRIL R&D Systems 5860-AP-010
Recombinant Human IL-10 R&D Systems 217-IL-
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-
Recombinant Human IL-6 Peprotech 200-06

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
  2. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
  3. Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
  4. Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
  5. Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
  6. Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
  7. Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
  8. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  9. Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
  10. Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
  11. Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
  12. Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
  13. Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
  14. Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
  15. Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077 (2015).
  16. Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).
  17. Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
  18. Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
  19. Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
  20. Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
  21. Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
  22. Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
  23. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
  24. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
  25. Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
  26. Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
  27. Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
  28. Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
  29. Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
  30. Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
  31. Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
  32. Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
  33. McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
  34. Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
  35. Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
  36. Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
  37. Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877 (2017).
  38. Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121 (2018).
  39. Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
  40. Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
  41. Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4 (2015).
  42. Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
  43. Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
  44. Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 143،
في المختبر التمايز نموذج الذاكرة البشرية العادية ب الخلايا إلى خلايا البلازما المعمرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jourdan, M., de Boussac, H.,… More

Jourdan, M., de Boussac, H., Viziteu, E., Kassambara, A., Moreaux, J. In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells. J. Vis. Exp. (143), e58929, doi:10.3791/58929 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter