Summary
생체 외에서 B 세포 플라즈마 세포 차별화 모델을 보고 다단계 문화 시스템을 사용 하 여, 우리.
Abstract
플라즈마 세포 (Pc)는 많은 양의 항 체를 분 비 하 고 활성화 된 B 세포에서 개발. Pc 희귀 세포 골 수 또는 점 막에 위치 하 고 체액 성 면역을 확인 합니다. 그들의 낮은 주파수 및 위치, Pc의 연구는 어려운 인간에서. 우리 PC에는 B를 보고 선택한 조합의 vivo에서 발생 하는 순차 세포 분화를 재현할 수 있도록 하는 cytokines 및 활성화 분자를 사용 하 여 체 외 분화 모델. 그리고 마지막으로, 긴에이 체 외 모델, 메모리 B 세포 (MBCs) (PBs), 초기 Pc 사전 plasmablasts (prePBs), plasmablasts로 차별화에 Pc는 표현 형 가까운 건강 한 개인. 에서 그들의 대응에 우리 또한 오픈 액세스 생물 정보학 GEP 데이터 PC 분화에 관련 된에서 가장 눈에 띄는 정보를 분석 하는 도구를 만들었습니다. 인간의 B PC 차별화 하 고 현재 연구에 연구를 이러한 리소스를 사용할 수 있습니다, 그리고 우리 인간의 B PC 차별화를 하는 동안 후 요인의 유전자 표현 규제 조사.
Introduction
플라즈마 세포 (Pc) B 세포의 분화는 체액 성 면역에 대 한 필수적 이며 감염1에 대 한 호스트를 보호. B PC 차별화를 주요 변화 항 체 분 비에 맞게 전송 용량 및 신진 대사에 연결 됩니다. B PC 차별화를 제어 하는 전사 인자 광범위 하 게 연구 하 고 밝혀 독점 네트워크 B 및 PC 관련 전사를 포함 하 여 요인 (TFs)2. B 세포, PAX5 BCL6, BACH2 TFs에 B 세포 정체성2,3의 수호자. 유도 IRF4, PRDM1 인코딩 BLIMP1 및 XBP1 PC TF의 B 세포 유전자를 소화 하 고 유도 조정된 항 체 은닉 세포 transcriptional 프로그램3,,45. 이러한 조정된 transcriptional 변화는 secreted 형태의 면역 글로불린 무거운 체인2,3, 막 바인딩 폼에서 스위치 함께 Ig 유전자 녹음 방송 활성화와 관련 4. B PC 차별화를 바인딩과 그물에 관련 된 유전자의 유도로 연결 기능과 Golgi 기구 펼쳐진된 단백질 응답 (UPR) 활성화의 합성을 수용 하 여 PC에서 핵심적인 역할을 담당할 것으로 알려져 수 반하는 은닉 면역 글로불린6,7. TF XBP1이 셀룰러 적응8,,910에서 주요 역할을 한다.
B 세포와 Pc는 체액 성 면역의 중요 한 선수. 이해 하는 생물 학적 제어 생산과 정상 혈장 세포의 생존은 효율적인 면역 반응 및 면역 또는 면역 결핍을 방지 하는 치료 내정간섭에 중요 하 처리 합니다. PC는 전체 생물 학적 특성, 특히 인간에서에서 방해 해 부 위치에서 일어나는 초기 분화 단계와 희귀 세포 이다. 다단계 문화 시스템을 사용 하 여, 우리 PC 차별화 모델에는 생체 외에서 B를 보고 있다. 이 모델 재현 순차 세포 분화 및 성숙 vivo11,12,13. 에 다른 장기에서 발생 첫 번째 단계에서 메모리 B 세포 처음 CD40 ligand, oligodeoxynucleotides 및 cytokine 조합 하 여 4 일에 활성화 하 고 preplasmablasts (PrePBs)으로 차별화 합니다. 두 번째 단계에서 preplasmablasts는 CD40L oligodeoxynucleotides 자극을 제거 하 고 cytokine 조합을 변경 하 여 plasmablasts (PBs)로 분화를 유도. 세 번째 단계에서 plasmablasts는 cytokine 조합11,12변경 하 여 초기 Pc로 차별화를 유도. 네 번째 단계 이러한 초기 Pc 골 수 기질 세포 조절 매체와 경작 하 여 완전히 성숙한 Pc를 소개 했다 또는 성장 요인13을 선택. 이러한 성숙한 Pc 생체 외에서 몇 달 동안 살아남을 수 있고 분 비 면역 글로불린 (그림 1)의 높은 양의. 흥미롭게도, 우리의 생체 외에서 모델이 조정 transcriptional 변화와 감지 vivo에서11,12,13,14 수 있는 PC 단계에 다른 B 형 ,15. Pc는 희귀 세포 및 우리의 체 외 분화 모델 인간의 B PC 차별화를 연구 수 있습니다.
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Protocol
프로토콜은 헬싱키의 선언 및 계약 몽펠리에 대학 병원 센터의 생물 자원에 대 한 지침을 따릅니다.
1. 체 외 일반 플라즈마 세포 차별화 모델에
참고: Pc 4 단계 문화11,,1213를 통해 생성 됩니다.
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B 세포 증폭 및 분화
- 메모리 B 세포 정화에 대 한 건강 한 자원자에서 말 초 혈액 세포를 사용 합니다.
- RPMI 1640 매체의 24.5 mL와 함께 혈액의 7.5 mL를 희석.
- 살 균 50 mL 원뿔 튜브에 실내 온도 밀도 그라데이션 (예: Ficoll)의 12.5 mL를 추가 합니다. 부드럽게 희석된 혈액의 32 mL와 함께 밀도 그라디언트 오버레이. 두 단계를 혼합 하 여 최소화 합니다.
- 해제 브레이크 500 x g 에서 20 분을 원심. 희석된 플라즈마/밀도 그라데이션 인터페이스는 PBMCs를 수집 하 고 셀 살 균 50 mL 튜브에 놓고 45 mL 행 크의 균형 소금 솔루션을 완료 합니다.
- 500 x g에 5 분에 대 한 셀 원심 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 펠 릿을 유지.
- 500 x g에서 RPMI1640/10% 송아지 태아 혈 청 (FCS) 및 원심 분리기 5 분의 45 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 펠 릿을 유지. PBS/2% FCS의 30 mL를 추가 합니다.
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C d 2 + 자석 구슬 안티-c d 2를 사용 하 여 셀을 제거 합니다. 4 구슬 한 목표 셀에 대 한 추가 합니다. 4 ° c.에 30 분을 품 어
- 별도 구슬 바인딩된 셀 셀 분리 응용 프로그램에 대 한 자석을 사용 하 여 바인딩되지 않은 셀에서. 바인딩되지 않은 세포를 수집 하 고 셀 펠 릿으로 CD19 APC 안티 및 CD27 PE 항 체 안티 4 ° C (106 셀에 대 한 항 체의 2 µ L)에서 15 분 동안 품 어.
- PBS/10% 염소 혈 청에 두 번 세척.
- FSC 그리고 SSC 플롯에 오염 이벤트를 제거 합니다. FSC-A vs FSC-H와 SSC A 대 SSC-H 플롯 파편을 제거 하 고 총 백혈구 채우기 선택에 singlets을 플롯 합니다. CD19/CD27와 CD19 메모리 B 셀 선택+CD27+.
- 95% 순수성을 가진 셀 정렬을 사용 하 여 MBCs를 정화.
- 10%와 IMDM FCS, 50 mg/mL 인간의 올려진다 고 5 mg/mL 인간의 인슐린 보충을 사용 하 여 모든 문화 단계를 수행 합니다.
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6 잘 배양 배지에서 MBCs를 정화 하는 플레이트 (1.5 x 105 MBCs/mL에 5 mL/잘), 일리노이-2와 4 일 동안 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL), 및 IL-15 (10 ng/mL).
- Phosphorothioate CpG ODN 2006, 히스티딘 태그 재조합 인간 성 CD40L를 추가 (sCD40L; 50 ng/mL) 및 MBCs 활성화 (그림 1)에 대 한 안티 polyhistidine mAb (5 mg/mL). 낮은 확대12같은 cytokine 칵테일 수익률 만으로 sCD40L 또는 ODN 활성화. 여기의 최대 수에 납을 첨가 하는 활성화 신호를 설명의 조합 활성화 B 세포와 PrePBs11,12 (그림 1).
- 진 식 프로 파일링, CD38 정화-/CD20- PrePBs, 4, 일에서 셀 정렬 (그림 2)를 사용 하 여.
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Plasmablastic 셀 생성
- 4 일에는 셀을 계산 합니다.
- 2 mL/잘에서 105/mL x 2.5에서 12-잘 배양 배지에서 플레이트 세포.
- CpG oligonucleotides 및 sCD40L의 제거 및 추가와 새로운 cytokine 칵테일 일리노이-2를 포함 하 여 새로운 문화 매체의 차별화를 유도 (20 U/mL), 일리노이-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) 및 IL-15 (10 ng/mL) (그림 1). 3 일 (4 일) 하루 7 37 ° c.에 대 한 문화 셀
- 진 식 프로 파일링, CD38 정화+/CD20- PBs, 하루 7에서 셀 정렬 (그림 2)를 사용 하 여.
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초기 플라즈마 세포 생성
- 7 일에는 셀을 계산 합니다.
- 셀 2 mL에 5 x 105/mL에서 12-잘 문화 접시에 접시/잘.
- 일리노이-6와 신선한 문화 매체를 사용 하 여 초기 Pc에 PB를 차별화 (50 ng/mL), 일리노이-15 (10 ng/mL)와 IFN-α (500 U/mL) 37 ° c.에 3 일 동안 CD20 정화 진 식 프로 파일링,-/CD38+/CD138+ 초기 Pc, 하루 10에서 셀 정렬 (그림 2)를 사용 하 여.
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수명이 긴 플라즈마 세포 생성
- 문화 상태를 변경 하 여 초기 Pc 오래 살았던된 Pc로 차별화.
- 5 x 1052 ml에서 /mL에서 12-잘 배양 배지에서 셀 문화/잘 또는 24-잘 배양 배지 1 mL/37 ° C에서 4 월의 매체를 조절 하는 일리노이-6와 stromal 세포를 사용 하 여 (200 ng/mL).
- Stromal 세포 배양과 5 일 배양 여 stromal 세포 조절 매체를 가져올. Stromal 세포 배양 표면에 뜨는 (0.2 µ m) 필터 및 고정.
- 매주 갱신 PC 문화를 stromal 세포 조절 미디어의 50%를 추가 합니다. 생성 된 긴 Pc 개월13유지 될 수 있습니다. Pc의 긴 기간 생존 보고13으로만 일리노이-6와 4 월 얻을 수 수 있습니다.
- Cytometry에서 측정 Ig 분 비 Pc 정렬.
- 24 h에 대 한 106 셀/mL에 Pc 문화 고 문화 상쾌한 수확. IgG 및 IgA 인간 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 키트11,,1213를 사용 하 여 측정 합니다. 메디아 IgG 일 10 ~ 17 세/셀/일 하루 6013에서 10 pg/셀/일에서 240 분 비.
2. 분자 아틀라스 PC 차별화에 B의
참고: 우리는 편리 하 고 오픈 액세스 생물 정보학 도구를 추출 하 고 PC 차별화 (GenomicScape)15에 관련 된 Affymetrix GEP 데이터에서 가장 눈에 띄는 정보 시각화를 내장. GEP 순화 MBCs, PrePBs, PBs와 Epc를 포함 하 여 ArrayExpress 데이터베이스 (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)에서 공개적으로 사용할 수 있습니다: 전자-MTAB-1771, E-MEXP-2360 및 E-MEXP-3034 BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape는 자유롭게 사용할 수 webtool을 이다.
-
PC 데이터 집합 B의 선택
- GenomicScape 오픈 액세스 bioinformatic 도구 (http://www.genomicscape.com) 라는 인간의 B 세포 플라스마 세포에서에서 데이터 찾아보기 메뉴에서 PC 데이터 집합에 B를 선택 합니다. 시각화의 독특한 유전자의 유전자 식 프로필 또는 유전자의 목록이 분석 도구 홈 페이지에서 사용할 수 있는 식 Coexpression 보고서 도구를 사용 하 여 이용하실 수 있습니다.
-
감독된 분석 및 주성분 분석 (PCA)
- 선택 분석 도구 | webSAM SAM 도구를 로드.
- 플라스마 세포 인간 B 세포 데이터 집합을 선택 하 고 샘플 비교의 그룹을 선택 합니다.
- 관심의 필터링 옵션을 적용할 수 있는 다른 필터를 사용 합니다.
- 샘 도구로 유전자 표현 프로 파일 비교를 배 변경, 순열, 거짓 검색 속도 비교의 종류의 수를 포함 하 여 필터링 옵션을 수정 합니다. GenomicScape는 분석을 계산 하 고 차동 선택한 그룹 사이 표현 하는 유전자를 제공.
- 주요 구성 요소 분석 분석 도구 메뉴에서 선택 하 여 주성분 분석을 실행 합니다.
- 플라즈마 세포 인간 B 세포 데이터 집합을 선택 하 고 관심의 그룹을 선택 합니다.
- 관심사의 유전자 또는 분산에 따라 선택 유전자 목록을 붙여 넣습니다. 유전자의 목록을 붙여 넣습니다, 유전자/ncRNAs 목록을 분석 하 고 여기를 클릭... Genomicscape 선택 PCA 시각화 하 고 다운로드 수를 계산 합니다.
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Representative Results
생체 외에서 정상적인 PC 차별화의 전반적인 절차는 그림 1에 표시 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여, 우리 수 얻을 수 없는와 ex vivo 인간의 샘플 셀의 충분 한 수량을 생성할 수 있습니다. PC 분화에 관련 된 녹음 방송 요인의 복잡 한 네트워크의 역할을 조사 하지만 키 PC 차별화 전사 네트워크 규제 메커니즘 가난 하 게 알려진 남아 있습니다. 세포질 감 별 법은 주로 transcriptional epigenetic 변화에 의해 구동 됩니다. 우리는 epigenetic 요인 정상 플라즈마 세포 차별화에의 식을 변화 조사 우리의 생체 외에서 모델과 PC GEP 아틀라스 B를 사용 하 여.
정상적인 플라스마 세포 분화에 epigenetic 요소 식
우리는 다음 제품군에 속하는 epigenetic 요인으로 정의: DNA methyltransferases (DNMT), 메 틸 CpG 묶는 도메인 (MBD) 단백질, 히스톤 acetyltransferases (모자), 히스톤 deacetylases (HDAC), 히스톤 methyltransferases (HMT) 및 히스톤 demethylases (HDM) 앞에서 설명한 암 세포16 (보표 1). 우리는 epigenetic 조사 요인 차동 정화 우리의 체 외 모델을 사용 하 여 PC 차별화 중 표현 성숙 골 수 Pc (BMPCs)와 "B PC 아틀라스를" 사용할 수를 사용 하 여 GenomicScape webtool (그림 2). 멀티 클래스 샘 분석을 사용 하 여, 우리 발견 71 유전자 크게 차동 MBCs, PrePBs, PBs, 초기 Pc와 BMPCs 사이 틀린 발견 비율 < 5% (그림 3A&3B 와 보표 2). MBC 무대 히스톤 acetyltransferases (모자)의 39.13%, 히스톤 methyltransferases (HMTs)의 30.43%, 히스톤 demethylases (HDMTs)의 21.74%, 메 틸 의무적인 단백질의 4.35%를 포함 하 여 23 epigenetic 선수 유전자의 overexpression에 의해 특징입니다, 4.35 %HDACs (그림 4). 14 후 선수 HMTs의 50%, 14.28 %DNMTs, HDACs의 21.43%, HDMTs의 7.14% 및 7.14% 모자 (그림 3)의 포함 하 여 PrePBs 단계에서 특히 overexpressed 했다. PBs 단계 2 HDMTS, 2 HMTs와 1 DNMT 5 후 플레이어의 overexpression에 의해 구별 된다. 4 후 플레이어는 초기 Pc (1 HDAC, 1 모자, 1 HMT와 1 메 틸 의무적인 단백질)에 overexpressed는. BMPCs, 10 epigenetic 요인 특히 overexpressed HMT (보표 2)의 50%를 포함 했다.
후 성적인 요소 식에서 가장 중요 한 변화는 downregulation 23 MBCs 유전자의 upregulation 14 PrePBs 후 성적인 유전자 (그림 4)의 PrePBs 전환 하는 MBCs 동안 발생합니다. MBCs는 크게 모자 히스톤의 posttranslational 수정에 overexpressed. Histone acetylation chromatin 구조를 chromatin의 decondensation를 epigenetically chromatin 압축에 의해 입 막 음 하는 유전자의 녹음 방송을 증가 영향을 줍니다. PrePBs 전환 MBCs 관련 된 모자, HMTs 식에 큰 변화 및 HDACs 및 DNMTs 유전자 발현에 농축의 상당한 downregulation 이기도 합니다. 흥미롭게도, PrePB 무대 또한 MMSET HMT의 overexpression에 의해 특징입니다. MMSET/WHSC1/NSD2 디-및 trimethylate 히스톤 H3 리 36에서 할 수 있는 히스톤 lysine methyltransferase를 포함 하는 집합된 도메인입니다. MMSET는 빈약한 예 지와 관련 된 여러 myeloma의 하위 그룹에서 상호 t(4;14)(p16;q32) 전 좌에 포함 된다. 그것은 MMSET 관련 되어 보도 했다 DNA 수리 DNA 이중 가닥 나누기 주위 히스톤에 메 틸 H4K20의 유도 통제에, 차례 차례로, 용이 하 게 53BP1 모집17. PrePBs 높은 PrePBs 단계 높은 일차 스트레스와 관련 될 수 있는 제안 S 단계11 에서 셀의 50%와 MBCs에 비해 확산 됩니다. MMSET의 overexpression PrePBs의 복제 스트레스 유발 DNA 손상의 예방에 참여할 수 있습니다.
PB 및 초기 Pc 제시 유사한 후 성적인 요소 식 프로필 (그림 2). BMPCs는 HMT와 HDAC Ig 분 비 스트레스 적응 EHMT2 및 HDAC6를 포함 하 여 관련 된 특정 overexpression에 의해 특징 이다. 성숙한 BMPCs synthetize에 있고 많은 양의 항 체를 분 비. 면역 글로불린의이 높은 합성이이 생산에 맞게 바인딩과 그물 (응급실) 응답의 개발과 misfolded 단백질 유도 스트레스와 연결 됩니다. 우리의 결과 재활 이벤트 후 중재를 통해 PC 차별화에 B 동안 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 후 요인의 주요 유전자 표현 변화를 보여 줍니다.
그림 1 : 생체 외에서 플라즈마 세포 차별화 모델. PC 차별화 모델 인간의 PC 세대의 다양 한 단계를이. 첫 번째 단계에서 메모리 B 세포 처음 CD40 ligand, oligodeoxynucleotides 및 cytokine 조합 하 여 4 일에 활성화 하 고 preplasmablasts로 차별화 합니다. 두 번째 단계에서 preplasmablasts CD40L oligodeoxynucleotides 자극을 제거 하 고 cytokine 조합을 변경 하 여 plasmablasts로 차별화 하는 유도 됩니다. 세 번째 단계에서 plasmablasts는 cytokine 조합11,12변경 하 여 초기 플라즈마 세포로 분화를 유도. 네 번째 단계는 2 개월13골 수 기질 세포 또는 SC 조절 매체와 4 월이 초기 플라즈마 세포를 배양 하 여 완전히 성숙한 플라즈마 세포를 소개 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 인간의 PC 차별화 모델 CD20, CD38, CD138 식 사전 plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs)에서 강조 및 정화를 허용 하는 플라즈마 세포 (Pc)를 사용 하 여 셀 정렬 및 Affymetrix 유전자 식 프로 파일링. GenomicScape webtool PC 차별화 데이터 집합 B에 관심의 하나 또는 여러 개의 유전자의 식 프로필 시각화 하 고 셀 부분 모집단 사이 차동 표현한 유전자를 분석할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 멀티 클래스 샘 분석. 크게 차동 표현 B 동안 PC 차별화 (샘 분석; 71 epigenetic 요인의 신호 루즈벨트 < 0.05) 메모리 B 세포에서 (MBCs, n = 5), preplasmablasts (PrePBs, n = 5), plasmablasts (PB, n = 5), 초기 플라즈마 세포 (초기 Pc, n = 5) 및 정상 골 수 플라스마 세포 (BMPCs, n = 5) 낮은 (딥 블루)에서 높은 (진한 빨간색) 식으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 크게 DNMTs, 메 틸 CpG 묶는 도메인 (MethylBP) 단백질, 히스톤 acetyltransferases (모자), 히스톤 deacetylases (HDAC), 히스톤 methyltransferases (HMT) 및 히스톤 demethylases 범주에 속하는 후 성적인 유전자의 비율 MBCs 또는 PrePBBs에 overexpressed. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 1: 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 2: 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
인간, PC 희귀 세포 분화 단계 전체 생물 학적 특성을 방해 해 부 장소에서 일어나는. 우리 개발 활성화 분자와 cytokines의 다양 한 조합에서 발생 하는 순차 세포 분화를 재생 하기 위하여 적용 이후에 다단계 문화 시스템을 사용 하 여 PC 차별화 모델에 생체 외에서 B는 vivo11,,1213에 다른 기관/조직.
Pc 차별화 모델에 다른 효율적인 생체 외에서 B 보고18,19했다. Le Gallou 개발한 모델 외. CD19에서 시작 하는 2 단계 문화 방법론 PC 차별화에 T 세포 의존 B 탐험+/CD27- 순진한 B 세포. Cocco 그 외 여러분 보고 총 B 셀19에서 시작 하는 오래 된 Pc를 생성 하는 체 외 모델. 활성화 및 CD40 수용 체 통행세 같이와 본 원 센터에서 발생 하는 차별화를 모방 하는 우리의 전략 활성화 cytokines와 함께 사용 되는 T 세포 도움말 및 항 활성화를 흉내 낸 수지상 세포, 대 식 세포와 T에 의해 생산 . SCD40L와 CpG ODN 활성화 림프절, 편도 선 및 인간11,20골에서 식별 된 PrePBs의 생성을 생성 합니다. 이 과도 적인 단계 CD20, CD38, 및 CD138 마커 및 B와 PC TFs, coexpression, PBs, B 세포에 비해 감소 된 수준에서의 부재에 의해 특징 또는 PC11. 이 과도 단계 다중 골 수 종 환자20,21프로테아좀 억제제 저항에 연결 된 이후 특정 관심의 이다. IL-15 추가 제공, 우리 손에 CD20의 세대에 결과 최적화 Pc IL 1518,19없이 생성 될 수 있습니다, 경우에-CD38 ++ 세포 주 411,12. IL-21 예 스 러운 유도 STAT3 활성화 이전에 보고 된19,22로 의해 중재를 통해 PC 차별화를 촉진 이후 IL-21의 추가 특정 관심의 것입니다. Cocco 외. 복잡 한에서 보고 문화 조건 포함 IL-21, IFN-α, IL6 stromal 세포 조절 중간 지원 장 Pc의 세대. 우리 Pc의 장기 생존 지원, 생체 외에서, 수 일리노이-6, 4 월 및 stromal 세포 조절 매체 또는 두 성장 인자만을 사용 하 여 보고. Stromal 세포 주요 PC 성장 요인, 특히 일리노이-6와 galectin13,,1923,,2425 를 생산 하 고 조 혈 사이 상호 작용을 유지 세포와 Pc26. 또한, 4 월 조 혈 모 세포27,28제작한 Pc 생존에 관련 된 주요 성장 요인 중 하나입니다. Stromal 세포의 다른 소스와 관련 된이 방지 하려면 바래-6 stromal 세포, 개발과 카린 Tarte 실험실에 의해 제공 통로 8과 1513,29사이 사용 되었다. 바래-6 셀 CD90, CD73 CD105 stromal 세포 마커를 표현 하 고 정상 및 악성 B 세포29의 성장을 효율적으로 지원.
그러나, 중간이 활성화 된 B 세포, PrePBs, PBs 및 메모리 B 세포 정화11,,1213에 사용 하는 건강 한 기증자의 혈액에 따라 Pc의 비율에서 관찰 될 수 있었다. 생성 된 오래 된 Pc는 비-사이클링 Pc, 살아 나 고 생체 외에서, 그들의 생체 조건 대응13으로 3 개월 이상에 대 한 면역 글로불린을 생산. 수명이 긴 Pc 익스프레스 높은 CD138 및 유전자 식 프로필을 vivo에서 관련된 Pc13. 또한, unspliced 접합된 XBP1 IRF4 및 PRDM1 Pc 녹음 방송 요인의 더 높은 식 함께 더 높은 비율에서 얻은 획득 시험관에서 이른 Pc에 비해 수명이 긴 Pc 특징 10 일13.
그것은 후 생각 고 transcriptional 변경 개발 하는 동안 세포 전환 제어. 그러나, 플라즈마 세포로 B 림프 톨의 터미널 차별화의 후 성적인 수정 크게 불명 하 게 남아 독특한 과정 이다. 그에 따라 우리는 최근 정상적인 PC 차별화의 miRnome를 분석 하 고 소설 키 miRNAs 규제 일반 PC 차별화14에 대 한 중요성의 네트워크 식별. 우리는 몇몇 miRNAs PCD, IRF4, PRDM1, ELL2 및 ARID3A14를 포함 하 여 동안 주요 녹음 방송 요인의 표현의 규제에도 참여할 수 있는 것을 보였다. 그에 따르면 우리 확장 여기 GenomicScape 오픈 액세스 플랫폼을 사용 하 여 PC 차별화에 B 동안 epigenetic 관련된 유전자 프로 파일의 특성. 이 이렇게를 사용 하 여 PC 차별화의 다른 단계에서 구체적으로 표현 하는 효소 유전자를 수정 하는 chromatin를 식별할 수 있었습니다. MBCs는 크게 모자 nuleosomal 전사 바인딩 사이트 노출 하 리 모델링을 일으키는 것으로 알려진 overexpressed. 히스톤 post-transcriptional 수정, 포함 histone acetylation PAX5, CIITA, SPIB 및 BCL630,31를 포함 한 주요 B 세포 TFs의 발기인 지구에 보고 되었습니다. 또한, proteomic 분석 CREBBP와 EP300 (MBCs에 overexpressed) BCL6 상호 작용을 시연 하 고 BCL632의 transcriptional 규칙에 있는 역할을 할 수 있습니다. PAX5, 또한 개장 하는 chromatin와 히스톤 단백질33수정 모집 하 여 대상 유전자 발현 조절 표시 했다. Pax5는 H3K4 메 틸 화와33그들의 활성화 대상 유전자 발기인에서 H3K9 acetylation 유도 표시 했다.
주요 후 성적인 요소 GEP 변경 MBCs HMTs 표현과 농축 HDACs 및 DNMTs 유전자 발현의 증가 함께 모자의 주요 downregulation PrePBs 전환 하는 동안 확인 되었다. 과도 적인 PrePB 단계는 매우 proliferating 셀 인구11이다. 즉, DNMT134, EZH235,36,,3738 MMSET39,40 등 셀 확산 제어에 관련 된 것으로 알려진 여러 epigenetic 요인에 따라 확인 되었습니다 및 PrePB 단계 세포 활성화와 확산 유도에 관련 된 수.
PC 차별화에 B의 최종 단계에서 BMPCs EHMT2 , HDAC6, ER 스트레스 반응에 관련 된 것으로 알려진 epigenetic 요소 overexpressed. ER 및 Golgi 기구 Ig 분 비의 합성을 수용 하기 위해 PC에 중요 한 역할을 재생 합니다. 방광 암 세포에서 EHMT2 억제 ER 스트레스를 자극 하 고 유도 하는 apoptosis41. HDAC6은 HDACs의 클래스 2b 가족에 속한다. 그것은 단백질 항상성에서 역할을 알려져 있다 그리고 내42,43 와 HDAC6 억제제 다중 골 수 종에서 악성 Pc를 대상으로 임상 실험에서 테스트. 우리의 데이터는 epigenetic 요인 역할을 할 수 장 명 Ig의 항상성에서 Pc를 은닉 밑줄.
Lentiviral 벡터 또는 특정 억제제를 사용 하 여, 그것은 이러한 생물 학적 경로 수정, PC 차별화 및 우리의 그룹 앞에서 설명한 기능을 개장 하는 chromatin에서 효소는 chromatin의 역할을 조사 하기 위해 재미 있을 수 있었다 44.
이 연구에서 파생 된 지식 수 통보 하 고 지시 PC 장애에 대 한 진단 및 치료 전략에와 같은 여러 발성의 경우는 더 나은 예 지와 향상 된 치료 전략에 대 한 확실 한 치료 없이 암 비판적으로 필요 합니다.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
이 작품은 프랑스 잉카 (인 국가 뒤 암)에서 교부 금에 의해 지원 되었다 연구소 (PLBIO15-256), ANR (넥타이-건너뛰기) 및 ITMO 암 (m M & TT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD2 magnetic beads | Invitrogen | 11159D | |
| Anti-CD138-APC | Beckman-Coulter | B49219 | |
| Anti-CD19-APC | BD | 555415 | |
| Anti-CD20-PB | Beckman-Coulter | B49208 | |
| Anti-CD27-PE | BD | 555441 | |
| Anti-CD38-PE | Beckman-Coulter | A07779 | |
| Anti-histidine | R&D Systems | MAB050 | |
| CpG ODN(PT) | Sigma | T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T |
|
| human Transferin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| IFN-α | Merck | Intron A | |
| IMDM | Gibco | 31980-022 | |
| Recombinan Human CD40L-hi | R&D Systems | 2706-CL | |
| Recombinant Human APRIL | R&D Systems | 5860-AP-010 | |
| Recombinant Human IL-10 | R&D Systems | 217-IL- | |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15-10ug | |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL- | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 |
References
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