Summary
Met behulp van scriptingregel cultuur systemen, wij brengen verslag een in vitro B-cel plasma cel differentiatie model.
Abstract
Plasmacellen (PCs) grote hoeveelheid antilichamen afscheiden en ontwikkelen van B-cellen die zijn geactiveerd. PC's zijn van zeldzame cellen zich in het beenmerg of de mucosa en zorgen Humorale immuniteit. Vanwege hun lage frequentie en de locatie, de studie van PC's is moeilijk in de mens. We gemeld een B naar PC in-vitro differentiatie model met behulp van geselecteerde combinaties van cytokinen en activering moleculen die toestaan om te reproduceren de sequentiële celdifferentiatie optreedt in vivo. In deze in vitro model geheugen B cellen (MBCs) zal onderscheiden in pre plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), vroeg PC's en ten slotte in langlevende Kortbij PC's, met een fenotype hun tegenhangers in gezonde individuen. Ook bouwden we een open toegang bioinformatica tools voor het analyseren van de meest prominente informatie van GEP gegevens met betrekking tot differentiatie van de PC. Deze middelen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de menselijke B PC differentiatie en in de huidige studie, we onderzocht de expressie genregulatie epigenetische factoren tijdens menselijke B naar PC differentiatie.
Introduction
De differentiatie van B-cellen tot plasmacellen (PCs) is essentieel voor de Humorale immuniteit en beschermen van de host tegen infecties1. B bij PC differentiatie wordt geassocieerd met grote veranderingen in de transcriptie capaciteit en metabolisme geschikt voor tot antilichaam secretie. De transcriptiefactoren waarmee B naar PC differentiatie zijn uitvoerig bestudeerd en geopenbaarde exclusieve netwerken met inbegrip van B - en PC-specifieke transcriptie factoren (TFs)2. In de B-cellen zijn PAX5, BCL6 en BACH2 TFs de hoeders van de B-cel identiteit2,3. Inductie van IRF4, PRDM1 BLIMP1 en XBP1 PC TF-codering zal uitdoven van B-cel genen en veroorzaken een gecoördineerde antilichaam-afscheidende cellen transcriptionele programma3,4,5. Deze gecoördineerde transcriptionele veranderingen worden geassocieerd met de activering van de transcriptie van Ig genen samen met een verschuiving van de membraan-gebonden vorm naar de secreted vorm van de immunoglobuline zware ketting2,3, 4. B bij de differentiatie van de PC is verbonden met inductie van genen betrokken bij endoplasmatisch reticulum en Golgi-apparaat functioneert gelijktijdige met ongevouwen eiwitten reactie (UPR) activering bekend dat spelen een sleutelrol in de PC door tegemoet te komen aan de synthese van uitgescheiden immunoglobulinen6,7. De TF-XBP1 speelt een belangrijke rol in deze cellulaire aanpassing8,9,10.
B-cellen en PC's zijn de hoofdrolspelers van de Humorale immuniteit. Inzicht in de biologische processen die controle de productie en het voortbestaan van normale plasmacellen is cruciaal in therapeutische interventies die moeten zorgen voor efficiënte immuunrespons en autoimmuniteit of immuun-deficiëntie te voorkomen. PC zijn zeldzame cellen met vroege stadia van de differentiatie plaatsvindt in anatomische locaties die volledige biologische karakterisering, met name in de mens belemmeren. Met behulp van scriptingregel cultuur systemen, hebben we een in vitro B gemeld aan PC differentiatie model. Dit model reproduceert de sequentiële celdifferentiatie en rijping die zich voordoen in de verschillende organen in vivo11,12,13. In een eerste stap, geheugencellen B zijn voor het eerst activeerde voor vier dagen door de combinatie van interactie CD40-ligand, oligodeoxynucleotides en cytokine en onderscheid maken in preplasmablasts (PrePBs). In een tweede stap, preplasmablasts om te differentiëren in plasmablasts (PBs) veroorzaakt door het verwijderen van CD40L en oligodeoxynucleotides stimulatie en de combinatie van cytokine te wijzigen. In een derde stap, worden plasmablasts veroorzaakt om te differentiëren in vroege PC's door het veranderen van de cytokine combinatie11,12. Een vierde stap werd geïntroduceerd om volledig volwassen PC's door het kweken van deze vroege PC's met beenmerg stromale cellen geconditioneerd medium of geselecteerde groeifactoren13. Deze volwassen PC's kunnen enkele maanden in vitro overleven en afscheiden van hoge bedragen van immunoglobuline (Figuur 1). Interessant is dat recapituleert ons in vitro model de gecoördineerde transcriptionele veranderingen en het fenotype van de verschillende stadia van de PC die gevonden in vivo11,12,13,14 worden kan B ,15. PC's zijn zeldzame cellen en onze in-vitro differentiatie-model maakt het mogelijk om de studie van de menselijke B naar PC differentiatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol volgt de richtsnoeren overeenkomstig de verklaring van Helsinki en de overeenkomst van de Montpellier Universiteit ziekenhuis centrum voor biologische hulpbronnen.
1. in Vitro normaal Plasma cel differentiatie Model
Opmerking: PC's worden gegenereerd door middel van een vier-stappen cultuur11,12,13.
-
Versterking van de b-cel en differentiatie
- Perifere bloedcellen van gezonde vrijwilligers voor geheugen zuivering van de B-cel gebruiken
- Verdun 7,5 mL bloed met 24,5 mL van RPMI 1640 medium.
- 12,5 mL van kamertemperatuur dichtheid verloop (bijvoorbeeld densiteitgradiënt) toevoegen aan een steriele 50 mL conische buis. Zachtjes bedekken het verloop van de dichtheid met de 32 mL verdunde bloed. Minimaliseer het mengen van de twee fasen.
- Centrifugeer 20 min op 500 x g met de rem af. De PBMCs te verzamelen vanuit de kleurovergang verdunde plasma/dichtheid-interface en de cellen in een steriele 50 mL-buis te plaatsen en een volledige tot 45 mL met Henks evenwichtige zoutoplossing.
- De cellen gedurende 5 minuten bij 500 x gcentrifugeren. Verwijder het supernatant voorzichtig en houden de pellet.
- 45 mL RPMI1640/10% foetaal kalfsserum (FCS) en centrifuge 5 min op 500 x gtoevoegen. Verwijder het supernatant voorzichtig en houden de pellet. Voeg 30 mL PBS/2% FCS.
-
Het verwijderen van CD2 + cellen met behulp van anti-CD2 magnetische kralen. 4 kralen voor een doelcel toevoegen. Incubeer 30 min bij 4 ° C.
- Afzonderlijke cellen van de kraal-gebonden uit niet-afhankelijke cellen met behulp van een magneet voor cel scheiding toepassing. Verzamelen van niet-afhankelijke cellen en de cel pellet met anti CD19 APC en anti-CD27 PE antilichamen Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C (2 µL van antilichamen tegen 106 cellen).
- Wassen tweemaal in PBS/10% geit serum.
- Verwijderen van contaminerende gebeurtenissen op zowel FSC als SSC percelen. Plot onderhemden op FSC-A vs FSC-H en WS-A vs DIE SSC-H percelen te verwijderen van puin en schakel de leukocyten van de totale bevolking. Selecteer geheugencellen B op CD19/CD27 en CD19+CD27+.
- Zuiveren MBCs sorteerder van een cel met een zuiverheid van 95%.
- Voer alle stappen van de cultuur met behulp van IMDM en 10% FCS, aangevuld met 50 mg/mL menselijke transferrine en 5 mg/mL menselijke insuline.
-
Plaat gezuiverd MBCs in zes-well cultuur platen (1,5 x 105 MBCs/mL in 5 mL/putje), voor 4 dagen, met IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL), en IL-15 (10 ng/mL).
- Toevoegen van Phosphorothioate apr ODN 2006, histidine-gelabelde recombinante menselijke oplosbare CD40L (sCD40L; 50 ng/mL) en anti-polyhistidine mAb (5 mg/mL) voor MBCs activering (Figuur 1). Activering door sCD40L of ODN alleen met de dezelfde cytokine cocktail levert aan lagere amplificatie12. De combinatie van activering signalen beschreven hier gelode aan het maximale aantal geactiveerd B-cellen en PrePBs11,12 (Figuur 1).
- Voor gen expressie profilering, zuiveren CD38-/CD20- PrePBs, op dag 4, met behulp van een cel sorter (Figuur 2).
-
Plasmablastic cel generatie
- Op dag 4, door de cellen te tellen.
- De cellen van de plaat in 12-well cultuur platen op 2.5 x 105/mL in 2 mL/putje.
- Induceren van differentiatie door verwijdering van CpG oligonucleotides en sCD40L en de toevoeging van een nieuwe kweekmedium met een nieuwe cytokine cocktail met inbegrip van IL-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) en IL-15 (10 ng/mL) (Figuur 1). Cultuur cellen voor 3 dagen (van dag 4 tot dag 7) bij 37 ° C.
- Voor gen expressie profilering, zuiveren CD38+/CD20- PBs, op dag 7, met behulp van een cel sorter (Figuur 2).
-
Vroege plasma cel generatie
- Op dag 7, door de cellen te tellen.
- Plaat van de cellen in 12-well cultuur platen op 5 x 10,5/mL in 2 mL/goed.
- Onderscheiden van PB in vroege PC's verse kweekmedium met IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) en IFN-α (500 U/mL) voor 3 dagen bij 37 ° C. Voor gen expressie profilering, zuiveren CD20-/CD38+/CD138+ vroege PC's, op dag 10, met behulp van een cel sorter (Figuur 2).
-
Langlevende plasma cel generatie
- Differentiëren vroege PCs in lang leefde PC's door het veranderen van de cultuuromstandigheden.
- Cultuur van de cellen in 12-well cultuur platen op 5 x 10,5/mL in 2 mL/goed of in 24-well cultuur platen in 1 mL/goed bij 37 ° C, met behulp van IL-6 en stromale cellen geconditioneerd medium en APRIL (200 ng/mL).
- Verkrijgen stromale cel-geconditioneerd medium door het kweken van stromale cellen voor 5 dagen met kweekmedium. Filter de stromale celcultuur supernatant (0,2 µm) en bevriezen.
- Elke week 50% van stromale cel-geconditioneerd media aan PC culturen met vernieuwing toevoegen. Gegenereerde langlevende PCs kunnen worden gehandhaafd voor maanden13. Overleving op lange termijn van PC's zouden kunnen worden verkregen met IL-6 en APRIL alleen als gerapporteerde13.
- Maatregel Ig secretie van stroom cytometry gesorteerd op PC's.
- PC's op 106 cellen/mL gedurende 24 uur cultuur en oogst supernatant van cultuur. IgG- en IgA met behulp van menselijke enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits11,12,13te meten. De mediane IgG secretie varieerden van 10 pg/cel/dag op dag 10 tot en met 17 pg/cel/dag op dag 6013.
2. moleculaire Atlas van B naar PC differentiatie
Opmerking: We bouwden een handige en open toegang bioinformatica tools om te halen en visualiseren van de meest prominente informatie uit Affymetrix GEP gegevens met betrekking tot PC differentiatie (GenomicScape)15. GEP zijn openbaar uit ArrayExpress database (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/), met inbegrip van gezuiverde MBCs, PrePBs, PBs en Spoon: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 en E-MEXP-3034 en BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape is een vrij beschikbare webtool.
-
Selectie van B naar PC dataset
- B Selecteer bij PC dataset in het menu Bladeren Data in GenomicScape open toegang bioinformatic tool (http://www.genomicscape.com) genaamd menselijke B cellen tot plasmacellen. Visualisatie van genexpressie profiel van unieke gen of een lijst met genen is beschikbaar met behulp van de Expressie-Coexpression rapportage in de Analysetools beschikbaar in de home page.
-
Gecontroleerde analyse en voornaamste componenten analyse (PCA)
- Selecteer analysehulpmiddelen | webSAM voor het laden van de SAM tool.
- Kies de menselijke B cellen tot plasmacellen dataset en Selekteer de groepen van monsters om te vergelijken.
- Gebruik de verschillende filters die beschikbaar zijn om toe te passen van de filteropties van belang.
- Om te vergelijken gene expressieprofielen met SAM tool, wijzigen de filtering opties met inbegrip van Fold wijzigen, aantal PERMUTATIES, valse ontdekking tarief en het type vergelijking. GenomicScape zal berekenen de analyse en genen differentially uitgedrukte tussen de geselecteerde groepen.
- Belangrijkste componenten analyse uitgevoerd door Hoofdcomponentenanalyse in Analysis Tools menu te selecteren.
- Kies de menselijke B cellen tot plasmacellen dataset en Selekteer de groepen van belang.
- Een lijst van genen van belang of selecteer genen volgens de variantie plakken. Een lijst van genen plakken, selecteert u te analyseren van een lijst van genen/ncRNAs, klik hier... Genomicscape zal berekenen partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst die kon worden gevisualiseerd en gedownload.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De algemene procedure voor in-vitro differentiatie voor normale PC wordt afgebeeld in Figuur 1. Met behulp van het protocol hier gepresenteerd, kunnen wij voldoende hoeveelheid cellen die niet kon worden verkregen met ex vivo menselijke specimens genereren. Hoewel de rol van het complexe netwerk van transcriptiefactoren die betrokken zijn bij PC differentiatie heeft onderzocht, blijven de mechanismen tot regeling van de belangrijkste PC differentiatie transcriptie netwerken slecht bekend. Celdifferentiatie wordt voornamelijk gedreven door epigenetische en transcriptionele veranderingen. Met behulp van onze in-vitro model en de B PC GEP atlas, onderzochten we de veranderingen van de expressie van de epigenetische factoren in normale plasma celdifferentiatie.
Epigenetische factor expressie in normale plasma celdifferentiatie
We verstaan epigenetische factoren die behoren tot de volgende families: DNA methyltransferases (DNMT), methyl-apr-bindend domein (MBD) eiwitten, histone acetyltransferases (hoed), histone deacetylases (HDAC), histone methyltransferases (HMT) en Histon demethylases (HDM) zoals eerder is beschreven voor kanker cellen16 (aanvullendetabel 1). We onderzochten de epigenetische factoren differentially uitgedrukte tijdens de differentiatie van de PC met behulp van onze in-vitro model, gezuiverd oudere beenmerg PC's (BMPCs) en 'B naar PC atlas' beschikbaar met behulp van de GenomicScape webtool (Figuur 2). Met behulp van meerdere klasse SAM analyse, vonden we 71 genen aanzienlijk differentieel tussen MBCs, PrePBs, PBs, vroege PC's en BMPCs met een valse ontdekking tarief < 5% (Figuur 3A&3B en aanvullendetabel 2). MBC fase wordt gekenmerkt door de overexpressie van 23 epigenetische speler genen waaronder 39.13% van Histon acetyltransferases (hoeden) 30.43% van Histon methyltransferases (HMTs), 21,74% van Histon demethylases (HDMTs), 4,35 procent van methyl bindende proteïnen en 4.35 gewichtspercenten HDACs (Figuur 4). 14 epigenetische spelers waren overexpressie specifiek in het stadium van de PrePBs met inbegrip van 50% van HMTs, 14.28% van DNMTs, 21.43% van HDACs, 7.14% van HDMTs en 7.14% van hoeden (Figuur 3). PBs fase wordt gekenmerkt door de overexpressie van 5 epigenetische spelers met 2 HDMTS, 2 HMTs en 1 DNMT. 4 epigenetische spelers zijn overexpressie in vroege PCs (1 HDAC, 1 muts, 1 HMT en 1 methyl-bindend-proteïne). In BMPCs waren 10 epigenetische factoren specifiek overexpressie inclusief 50% van de HMT (aanvullendetabel 2).
De belangrijkste veranderingen in de epigenetische factor expressie optreden tijdens de MBCs PrePBs overgang met een Downregulatie van 23 MBCs genen en opregulatie van 14 PrePBs epigenetische genen (Figuur 4). MBCs overexpressie aanzienlijk hoeden die betrokken zijn bij de posttranslationele wijziging van histones. Histon acetylation heeft invloed op de structuur van de chromatine resulterend in decondensation van de chromatine en het vergroten van de transcriptie van genen die epigenetically monddood door compressie van de chromatine gemaakt worden. De MBCs PrePBs overgang wordt ook geassocieerd met een significant Downregulatie van hoeden, een belangrijke verschuiving in de HMTs expressie en verrijking in HDACs en DNMTs gen-expressie. Interessant, wordt PrePB stadium ook gekenmerkt door de overexpressie van MMSET HMT. MMSET/WHSC1/NSD2 is een SET domein met Histon lysine methyltransferase die kunnen di- en trimethylate Histon H3 aan lysine 36. MMSET is betrokken bij de wederzijdse t(4;14)(p16;q32) translocatie van een subgroep van multiple myeloma die wordt geassocieerd met een slechte prognose. Het werd gemeld dat het MMSET gaat in DNA-herstel regulering van de inductie van H4K20 methylering op histonen rond DNA dubbele streng pauzes, die, beurtelings, 53BP1 werving17vergemakkelijkt. PrePBs zijn zeer prolifererende vergeleken met MBCs met 50% van de cellen in de S fase11 suggereren dat de PrePBs fase kan gepaard gaan met een hoge replicatieve stress. Overexpressie van MMSET kon deelnemen aan de preventie van replicatie stress-geïnduceerde DNA-schade in PrePBs.
PB en vroege PC's gepresenteerd soortgelijke epigenetische factor expressieprofielen (Figuur 2). BMPCs worden gekenmerkt door een specifieke overexpressie van HMT en HDAC die gerelateerd zijn aan Ig secretie stress aanpassing met inbegrip van EHMT2 en HDAC6. Volwassen BMPCs hebben het kenmerk om te synthetize en grote hoeveelheden van antilichamen afscheiden. Deze hoge synthese van immunoglobulinen wordt geassocieerd met een misfolded eiwit-geïnduceerde stress en de ontwikkeling van het endoplasmatisch reticulum (ER) reactie op het vangen van deze productie. Onze resultaten tonen aan dat grote gen expressie veranderingen van epigenetische factoren die een belangrijke rol tijdens B tot differentiatie van de PC door middel van herprogrammering evenementen epigenetische-gemedieerde spelen kunnen.
Figuur 1 : In vitro plasma cel differentiatie model. Het PC-model voor differentiatie recapituleert de verschillende stappen van menselijke PC generatie. In een eerste stap, geheugencellen B zijn voor het eerst activeerde voor vier dagen door de combinatie van interactie CD40-ligand, oligodeoxynucleotides en cytokine en onderscheid maken in preplasmablasts. In een tweede stap, worden preplasmablasts veroorzaakt om te differentiëren in plasmablasts door het verwijderen van CD40L en oligodeoxynucleotides stimulatie en de combinatie van cytokine te wijzigen. In een derde stap, worden plasmablasts veroorzaakt om te differentiëren in vroege plasmacellen door het veranderen van de cytokine combinatie11,12. Een vierde stap werd geïntroduceerd om volledig volwassen plasmacellen door het kweken van deze vroege plasmacellen met beenmerg stromale cellen of SC geconditioneerd medium en APRIL voor twee maanden13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Menselijke PC differentiatie model CD20 CD38 en CD138 expressie in pre plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs) markeren en plasmacellen (PCs), waarmee de zuivering met behulp van cel diasorteerderweergave en Affymetrix gen expressie profilering. GenomicScape webtool kunt visualiseren van de expressie-profiel van één of meerdere genen van belang in B aan PC differentiatie gegevensset en analyseren van differentially uitgedrukte genen tussen cel subpopulaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Multi klasse SAM analyse. De signalen van de 71 epigenetische factoren die aanzienlijk differentieel geuit tijdens B PC differentiatie (SAM analyse; FDR < 0.05) in geheugencellen B (MBCs, n = 5), preplasmablasts (PrePBs, n = 5), plasmablasts (PB, n = 5), vroege plasmacellen (vroege PCs, n = 5) en normale beenmerg plasmacellen (BMPCs, n = 5) naar hoge (dieprood) expressie van lage (donkerblauw) worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Percentage van epigenetische genen die behoren tot de DNMTs, methyl-apr-bindend domein (MethylBP) eiwitten, histone acetyltransferases (hoed), histone deacetylases (HDAC), histone methyltransferases (HMT) en Histon demethylases categorieën aanzienlijk overexpressie in MBCs- of PrePBBs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende tabel 1: Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de mens zijn PC zeldzame cellen met differentiatie etappes plaatsvinden in anatomische plaatsen die volledige biologische karakterisering in de weg staan. We hebben ontwikkeld, een in vitro B PC differentiatie model met behulp van scriptingregel cultuur systemen waar verschillende combinaties van moleculen van activering en cytokines worden vervolgens toegepast om te reproduceren de sequentiële celdifferentiatie optreedt de verschillende organen/weefsels in vivo11,12,13.
Andere efficiënte in-vitro B naar PCs differentiatie modellen werden gemeld18,19. Het model ontwikkeld door Le Gallou et al. onderzocht T-cel afhankelijke B naar PC differentiatie met een tweestaps cultuur methodologie vanaf CD19+/CD27- naïef B cellen. Cocco et al. rapporteerde een in vitro model voor het genereren van langlevende PC's vanaf totale B cellen19. Onze strategie bootst de activering en de differentiatie die zich voordoen in germinal centrum met interactie CD40 en Toll-like receptor activering nabootsen van T cel help en antigeen activering gebruikt in combinatie met cytokines geproduceerd door dendritische cellen, macrofagen en T-helper . Activering met sCD40L en CpG ODN levert aan de generatie van PrePBs die zijn vastgesteld in de tonsillen, lymfeklieren en beenmerg in menselijke11,20. Deze overgangsfase wordt gekenmerkt door de afwezigheid van markeringen CD20, CD38 en CD138 en de coexpression van B en PC TFs, maar op een lagere niveau in vergelijking met de B-cellen, PBs, of PC11. Deze overgangsfase is van bijzonder belang, omdat het gekoppeld aan proteasoom remmer resistentie bij multipel myeloom patiënten20,21. Zelfs als PC's kunnen worden gegenereerd zonder IL-1518,19, IL-15 toevoeging geboden, in onze handen, de resultaten in de generatie van CD20 geoptimaliseerd-CD38++ cellen op dag 411,12. Toevoeging van IL-21 zou van bijzonder belang aangezien IL-21 PC differentiatie via BLIMP inductie gemedieerd door STAT3 activering als eerder gemeld19,22 bevordert. Zoals gerapporteerd door Cocco et al. complexe voorwaarden cultuur met IL-21, IFN-α, IL6 en stromale cel-geconditioneerd middellange ondersteuning de generatie van langlevende PCs. We gemeld dat op lange termijn overleven van PC's worden kan ondersteund, in vitro met behulp van IL-6, APRIL en stromale cel-geconditioneerd medium of alleen de twee groeifactoren. Stromale cellen produceren grote PC groeifactoren, met name IL-6 en galectin13,19,23,24,25 en in stand houden van de interacties tussen hematopoietische cellen en PC's26. APRIL is bovendien één van de belangrijkste groei factoren die betrokken zijn bij de overleving van de PC's, geproduceerd door hematopoietische cellen27,28. Om te voorkomen dat de heterogeniteit verband met verschillende bronnen van stromale cellen, werden Resto-6 stromale cellen, ontwikkeld en geleverd door Karin Tarte's lab, gebruikt tussen passages 8 en 1513,29. Resto-6 cellen express markeringen van CD90, CD73 en CD105 stromale cellen en de groei van normale en kwaadaardige B cellen29efficiënt te ondersteunen.
Echter, een gematigde heterogeniteit kon worden waargenomen in het percentage van de geactiveerde B-cellen, PrePBs, PBs en PC's afhankelijk van de gezonde donor bloed gebruikt voor geheugen B-cel zuivering11,12,13. De gegenereerde langlevende PC's zijn niet-Fiet & Mountainbike PC's, overleven en produceren immunoglobulinen voor meer dan drie maanden in vitro, als hun in vivo tegenhanger13. Langlevende PC express zeer CD138 en gen expressie profielen aan in vivo gerelateerde PCs13. Bovendien, een hogere ratio van afgesplitste te unspliced XBP1 samen met hogere uitdrukking van IRF4 en PRDM1 PC's transcriptiefactoren gekenmerkt de langlevende PC's verkregen in vitro in vergelijking met begin PC's verkregen op Dag 10-13.
Het wordt gedacht epigenetische en transcriptionele wijzigingen bepalen de cellulaire overgangen tijdens de ontwikkeling. De terminal differentiatie van B lymfocyten tot plasmacellen is echter een uniek proces waarvan epigenetische wijzigingen grotendeels onbekend blijven. Volgens dat wij onlangs de miRnome van normale PC differentiatie geanalyseerd en geïdentificeerd roman belangrijke miRNAs regulering van de netwerken van betekenis voor normale PC differentiatie14. We toonden dat verschillende miRNAs ook in de regulering van de expressie van belangrijke transcriptiefactoren tijdens PCD deelnemen kunnen, met inbegrip van IRF4, PRDM1, ELL2 en ARID3A14. Volgens dat we uitgebreid hier de karakterisatie van epigenetische gerelateerde gen profielen tijdens B tot differentiatie van de PC met behulp van GenomicScape open access-platform. Deze aanpak konden we identificeren chromatine enzym genen specifiek uitgedrukt in de verschillende stadia van de differentiatie van de PC wijzigen. MBCs overexpressie aanzienlijk hoeden bekend te veroorzaken nuleosomal remodelleren dat transcriptie bandplaatsen blootstelt. Histon post-transcriptional wijzigingen, met inbegrip van Histon acetylation zijn gemeld in promotor regio van de grote B-cel TFs met inbegrip van PAX5, CIITA, SPIB en BCL630,31. Anderzijds Proteoom-analyse aangetoond dat CREBBP en EP300 (overexpressie in MBCs) met BCL6 communiceren en kan een rol spelen in de transcriptionele regulatie van BCL632. PAX5, werd ook aangetoond dat het doel genexpressie regelen door de indienstneming van chromatine-remodeling en Histon eiwitten33wijzigen. Pax5 bleek voor het opwekken van methylation van H3K4 en H3K9 acetylation bij de initiatiefnemers van hun geactiveerde target genen33.
Belangrijke epigenetische factor GEP wijzigingen werden vastgesteld tijdens de MBCs om de overgang van het PrePBs met een grote Downregulatie van hoeden samen met een toename van de HMTs expressie en verrijking van HDACs en DNMTs genexpressie. PrePB overgangsfase is een zeer delende cel bevolking11. Volgens dat verschillende epigenetische factoren bekend betrokken te worden bij de cel proliferatie controle, met inbegrip van DNMT134, EZH235,,36,,37,38 en MMSET39,40 geconstateerd en de betrokken in cel activeren en proliferatie inductie tijdens de PrePB fase zouden kunnen worden.
In de eind fase van B naar PC differentiatie overexpressie BMPCs epigenetische factoren, waaronder EHMT2 en HDAC6, bekend betrokken te worden bij ER stressrespons. ER en Golgi-apparaat spelen een belangrijke rol in de PC voor de synthese van secreted Ig. In de cellen van de kanker van de blaas, EHMT2 inhibitie stimuleert ER stress en induceert apoptosis41. HDAC6 behoort tot de klasse 2b familie van HDACs. Het is bekend dat een rol in de homeostase van het eiwit en de UPR42,43 en HDAC6-remmers worden getest in klinische proeven te richten kwaadaardige Stück in multiple myeloma. Onze gegevens onderstrepen dat epigenetische factoren kunnen een rol spelen in de homeostase van langlevende Ig afscheidende PC's.
Met behulp van lentivirale vectoren en/of specifieke remmers, zou het interessant zijn om te onderzoeken van de rol van deze biologische trajecten en chromatin wijziging van enzymen in de chromatine remodeling, PC differentiatie en functies zoals eerder beschreven door onze fractie 44.
De kennis die zijn afgeleid van dit onderzoek kan informeren en instrueren over diagnostische en therapeutische strategieën voor PC stoornissen, zoals in het geval van multipel myeloom, een kanker zonder een definitieve genezing waarvoor betere prognose en verbeterde therapeutische strategieën kritisch zijn nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de Franse INCA (Institut National du Cancer) Instituut (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) en ITMO kanker (MM & TT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD2 magnetic beads | Invitrogen | 11159D | |
| Anti-CD138-APC | Beckman-Coulter | B49219 | |
| Anti-CD19-APC | BD | 555415 | |
| Anti-CD20-PB | Beckman-Coulter | B49208 | |
| Anti-CD27-PE | BD | 555441 | |
| Anti-CD38-PE | Beckman-Coulter | A07779 | |
| Anti-histidine | R&D Systems | MAB050 | |
| CpG ODN(PT) | Sigma | T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T |
|
| human Transferin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| IFN-α | Merck | Intron A | |
| IMDM | Gibco | 31980-022 | |
| Recombinan Human CD40L-hi | R&D Systems | 2706-CL | |
| Recombinant Human APRIL | R&D Systems | 5860-AP-010 | |
| Recombinant Human IL-10 | R&D Systems | 217-IL- | |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15-10ug | |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL- | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 |
References
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
- Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
- Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
- Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
- Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
- Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
- Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
- Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
- Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
- Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
- Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
- Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
- Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
- Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077 (2015).
- Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).
- Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
- Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
- Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
- Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
- Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
- Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
- Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
- Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
- Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
- Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
- Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
- Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
- McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
- Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
- Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
- Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
- Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877 (2017).
- Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121 (2018).
- Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
- Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
- Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4 (2015).
- Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
- Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
- Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).
