Summary
Mit mehrstufigen Kultur-Systeme, berichten wir eine in-vitro-B-Zelle zur Plasmazelle Differenzierung Modell.
Abstract
Plasmazellen (PCs) absondern, große Mengen von Antikörpern und entwickeln von B-Zellen, die aktiviert wurden. PCs sind seltene Zellen im Knochenmark oder in der Schleimhaut und humorale Immunität zu gewährleisten. Aufgrund ihrer niedrigen Frequenz und Position, die Untersuchung von PCs ist schwierig in der menschlichen. Wir berichteten einen B an PC in-vitro-Differenzierung Modell mit ausgewählten Kombinationen von Zytokinen und Aktivierung Moleküle, die es ermöglichen, um die sequentielle Zelldifferenzierung Auftritt in vivo zu reproduzieren. In diesem in-vitro-Modell, Speicher, B-Zellen (MBCs) in Pre-Plasmablasts (PrePBs), Plasmablasts (PBs), früh PCs unterscheiden werden und schließlich in langlebigen schließen-PCs mit einem Phänotyp zu ihren Gegenstücken in den gesunden Einzelpersonen. Wir bauten auch eine open-Access-Bioinformatik Werkzeuge um die prominentesten Informationen von GEP-Daten im Zusammenhang mit PC-Differenzierung zu analysieren. Diese Ressourcen können verwendet werden, um menschliche B PC Differenzierung und in der aktuellen Studie zu studieren, untersuchten wir Ausdruck Genregulation epigenetische Faktoren während der menschlichen B PC Differenzierung.
Introduction
Die Differenzierung der B-Zellen zu Plasmazellen (PCs) ist wichtig für die humorale Immunität und schützen die Gastgeber gegen Infektionen1. B PC Differenzierung ist verbunden mit großen Veränderungen in Transkription Kapazität und des Stoffwechsels, zu Antikörper-Sekretion unterzubringen. Die Transkriptionsfaktoren, die B auf PC Differenzierung Steuern wurden ausgiebig untersucht und offenbarten exklusive Netzwerke einschließlich B - und PC-spezifische Transkription Faktoren (TFs)2. In B-Zellen sind PAX5, BCL6 und BACH2 TFs die Hüter der B-Zell-Identität-2,-3. Induktion von IRF4, PRDM1 BLIMP1 und XBP1 PC TF-Codierung wird B-Zell-Gene zu löschen und induzieren eine koordinierte Antikörper-sezernierenden Zelle transkriptionelle Programm3,4,5. Diese koordinierte transcriptional Änderungen sind verbunden mit Ig Gene Transcription Aktivierung zusammen mit einem Wechsel von der Membran-gebundener Form zu sekretierte Form von Immunglobulin schwere Kette2,3, 4. B zu PC Differenzierung ist mit Induktion von Genen, die im endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat funktioniert mit unfolded Protein Response (UPR) Aktivierung bekannt, eine wichtige Rolle im PC zu spielen, durch die Aufnahme der Synthesis von abgesondert, Immunglobuline6,7. Die TF-XBP1 spielt eine wichtige Rolle in diesem zellulären Anpassung8,9,10.
B-Zellen und PCs sind Hauptakteure der humoralen Immunität. Verständnis der biologisches Prozesse, Kontrolle der Produktion und das Überleben der normalen Plasmazellen ist von entscheidender Bedeutung im therapeutischen Interventionen, die müssen effiziente Immunantworten zu gewährleisten und verhindern Autoimmunität oder Immunschwäche. PC sind seltene Zellen mit Frühstadium Differenzierung findet in anatomischen Standorten, die volle biologische Charakterisierung, besonders beim Menschen behindern. Mit mehrstufigen Kultur-Systemen, haben wir einen in-vitro-B PC Differenzierung Modell berichtet. Dieses Modell bildet die sequentielle Zell-Differenzierung und Reifung, die in den verschiedenen Organen in Vivo11,12,13. In einem ersten Schritt B Speicherzellen sind zunächst vier Tage lang durch CD40-Liganden, Oligodeoxynukleotiden und Zytokin-Kombination aktiviert und in Preplasmablasts (PrePBs) zu unterscheiden. In einem zweiten Schritt werden Preplasmablasts induziert, in Plasmablasts (PBs) zu unterscheiden durch CD40L und Oligodeoxynukleotiden Stimulation entfernen und ändern die Zytokin-Kombination. In einem dritten Schritt werden Plasmablasts induziert, in frühen PCs zu unterscheiden, indem Sie ändern die Cytokine Kombination11,12. Ein vierter Schritt wurde eingeführt, um ausgereifte PCs bekommen durch die Kultivierung dieser frühen PCs mit dem Knochenmark Stromazellen Zellen bedingt Medium oder Wachstumsfaktoren13ausgewählt. Diese ältere PCs in-vitro-mehrere Monate überleben und absondern, hohe Mengen an Immunglobulin (Abbildung 1). Interessanterweise, rekapituliert unsere in-vitro-Modell die koordinierte transcriptional Änderungen und dem Phänotyp der verschiedenen B PC-Stufen, die erkannten in-vivo-11,12,13,14 ,15. PCs sind seltene Zellen und unsere in-vitro-Differenzierung Modell erlaubt, um menschliche B PC Differenzierung zu studieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Das Protokoll folgt den Richtlinien entsprechend der Deklaration von Helsinki und Vereinbarung von Montpellier Universität Krankenhauszentrum für biologische Ressourcen.
(1) in Vitro Normal Plasmazelle Differenzierung Modell
Hinweis: PCs entstehen durch ein vierstufiges Kultur11,12,13.
-
B-Zell-Verstärkung und Differenzierung
- Verwenden Sie peripheren Blut Zellen von gesunden Probanden für das Gedächtnis B Zellen Reinigung.
- Verdünnen Sie 7,5 mL Blut mit 24,5 mL RPMI 1640 Medium.
- Ein steril 50 mL konische Röhrchen 12,5 mL Raumtemperatur Dichtegradient (z. B. Ficoll) hinzufügen. Sanft überlagern der Dichtegradient mit 32 mL verdünnte Blut. Die Vermischung der beiden Phasen zu minimieren.
- Zentrifugieren Sie 20 min bei 500 X g mit der Bremse aus. Sammeln Sie die PBMCs von der verdünnten Plasmadichte gradient Schnittstelle und legen Sie die Zellen in einer sterilen 50 mL Tube und füllen Sie bis 45 mL mit Hank es ausgeglichene Salzlösung.
- Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 500 X g. Nehmen Sie des Überstands vorsichtig und halten Sie das Pellet.
- 45 mL RPMI1640/10% fetalen Kälberserum (FCS) und Zentrifuge 5 min bei 500 X gzugeben. Nehmen Sie des Überstands vorsichtig und halten Sie das Pellet. 30 mL PBS/2% FCS hinzugeben.
-
Entfernen Sie CD2 + Zellen mit magnetischen Beads Anti-CD2. 4 Perlen für eine Zielzelle hinzufügen. 30 min bei 4 ° c inkubieren
- Separate Wulst-gebundenen Zellen aus ungebundenen Zellen mit Hilfe eines Magneten für Zelle Trennung Anwendung. Ungebundene Zellen sammeln und 15 Minuten bei 4 ° C (2 µL des Antikörpers für 106 Zellen) Zelle Pellet mit anti-CD19 APC und anti-CD27 PE Antikörper inkubieren.
- Zweimal in PBS/10% Ziegenserum waschen.
- Entfernen Sie kontaminierende Ereignisse auf FSC und SSC Grundstücken. Plot-Unterhemden auf FSC-A Vs FSC-H und SSC-A Vs SSC-H Plots, Ablagerungen zu entfernen und die Bevölkerung insgesamt Leukozyten auszuwählen. Wählen Sie B Speicherzellen CD19/CD27 und CD19+CD27+.
- MBCs, mit einer Zelle Sorter mit einer Reinheit von 95 % zu reinigen.
- Alle Schritte Kultur mit IMDM und 10 % FCS, ergänzt mit 50 mg/mL menschlichen Transferrin und 5 mg/mL Humaninsulin.
-
Platte MBCs in sechs Brunnen Kultur Platten gereinigt (1,5 x 105 MBCs/mL in 5 mL/gut), für 4 Tage, mit IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL) und IL-15 (10 ng/mL).
- Fügen Sie Phosphorothioat CpG ODN 2006, Histidin-markierten rekombinanten menschlichen lösliche CD40L (sCD40L; 50 ng/mL) und Anti-Polyhistidine mAb (5 mg/mL) für MBCs-Aktivierung (Abbildung 1). Aktivierung von sCD40L oder ODN nur mit der gleichen Zytokin cocktail Erträge niedriger Verstärkung12. Die Kombination der beschriebenen Aktivierung Signale hier verbleit, die maximale Anzahl von B-Zellen und PrePBs11,12 (Abbildung 1) aktiviert.
- Gene Expression Profiling, reinigen CD38–/CD20– PrePBs, am Tag 4, mit einer Zelle Sorter (Abbildung 2).
-
Plasmablastic Zellgeneration
- Am Tag 4 zählen Sie die Zellen.
- Platte Zellen in Kultur 12-Well Platten 2,5 x 105/mL in 2 mL/gut.
- Differenzierung durch Entfernung von CpG-Oligonukleotiden und sCD40L und Zugabe von ein neues Nährmedium mit einer neuen Zytokin cocktail einschließlich IL-2 induzieren (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) und IL-15 (10 ng/mL) (Abbildung 1). Zellkulturen für 3 Tage (ab Tag 4 bis Tag 7) bei 37 ° C.
- Gene Expression Profiling, reinigen CD38+/CD20– PBs, an Tag 7, mit einer Zelle Sorter (Abbildung 2).
-
Frühe Plasmazelle generation
- Am 7. Tag zählen Sie die Zellen.
- Typenschild Zellen in Kultur 12-Well-Platten an 5 x 105/mL in 2 mL/gut.
- PB in frühen PCs mit frischem Nährmedium mit IL-6 zu unterscheiden (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) und IFN-α (500 U/mL) für 3 Tage bei 37 ° C. Gene Expression Profiling, reinigen CD20–/CD38+/CD138+ frühen PCs, an Tag 10, mit einer Zelle Sorter (Abbildung 2).
-
Langlebige Plasma Zellgeneration
- Frühen PCs in langlebigen PCs durch Ändern der Kulturbedingungen zu unterscheiden.
- Kultur der Zellen in Kultur 12-Well Platten am 5 x 105/mL in 2 mL/gut oder in Kultur 24-Well-Platten in 1 mL/auch bei 37 ° C mit IL-6 und Stromazellen Zelle konditionierten Medium und APRIL (200 ng/mL).
- Stromale Zelle konditioniertes Medium durch Kultivierung Stromazellen Zellen für 5 Tage mit Nährmedium zu erhalten. Filtern Sie die stromale Zellkultur überstand (0,2 µm) und Einfrieren.
- Fügen Sie 50 % der Stromazellen Zelle konditioniertes Medien PC Kulturen mit Erneuerung jede Woche. Generierte langlebigen PCs konnte für Monate13gehalten werden. Langfristige Überleben von PCs konnte mit IL-6 und APRIL nur als gemeldete13abgerufen werden.
- Maßnahme Ig Sekret Durchflusszytometrie sortiert PCs.
- Kultur-PCs bei 106 Zellen/mL für 24 h und Ernte Kultur überstand. Messen Sie IgG und IgA mit menschlichen Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) Kits11,12,13. Die mittlere IgG-Sekretion reichte von 10 Pg/Zelle/Tag bei 10 bis 17 Pg/Zelle/Tag um Tag 6013.
2. molekulare Atlas von B zu PC-Differenzierung
Hinweis: Wir bauten eine bequeme und open Access Bioinformatik zu extrahieren und zu visualisieren, die prominenteste Informationen von Affymetrix GEP Daten in Bezug auf PC Differenzierung (GenomicScape)15. GEP sind öffentlich zugänglich, aus ArrayExpress-Datenbank (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) einschließlich der gereinigten MBCs, PrePBs, PBs und EPC: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 und E-MEXP-3034 und BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape ist eine frei verfügbare Webtool.
-
Auswahl der B PC-Dataset
- Wählen Sie B PC-Dataset im Menü Durchsuchen Daten in GenomicScape open-Access Bioinformatic Tool (http://www.genomicscape.com) namens menschlichen B-Zellen zu Plasmazellen. Visualisierung des Genexpressionsprofils eindeutig Gens oder eine Liste von Genen steht zur Verfügung, mit dem Ausdruck Coexpression Bericht -Werkzeug in der Analyse-Tools zur Verfügung, auf der Startseite.
-
Betreute Analyse und Hauptkomponentenanalyse (PCA)
- Wählen Sie Analysetools | WebSAM , das SAM-Tool zu laden.
- Wählen Sie das Dataset menschlichen B-Zellen zu Plasmazellen und die Gruppen der Proben zu vergleichen.
- Verwenden Sie die verschiedenen Filter zur Verfügung, um die Filteroptionen von Interesse gelten.
- Um gen Expressionsprofile mit SAM-Tools vergleichen, ändern Sie die Filteroptionen inklusive Falte, Anzahl der Permutationen, False Discovery Rate und die Art des Vergleichs. GenomicScape wird die Analyse zu berechnen und Gene differentiell zwischen den ausgewählten Gruppen.
- Führen Sie Hauptkomponentenanalyse Principal Component Analysis im Analyse-Tools -Menü auswählen.
- Wählen Sie das Dataset menschlichen B-Zellen zu Plasmazellen und die Gruppen von Interesse.
- Fügen Sie eine Liste von Genen von Interesse oder wählen Sie Gene nach der Varianz. Eine Liste von Genen einfügen, wählen eine Liste der Gene/NcRNAs analysieren klicken Sie hier... Genomicscape wird PCA berechnen, die visualisiert und heruntergeladen werden können.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Das gesamte Verfahren der in-vitro-normale PC-Differenzierung wird in Abbildung 1dargestellt. Mit den hier vorgestellten Protokoll, konnte wir ausreichenden Menge an Zellen generiert werden, die nicht mit ex-Vivo humanen Proben gewonnen werden konnte. Obwohl die Rolle des komplexen Netzwerks von Transkriptionsfaktoren PC Differenzierung beteiligt untersucht worden ist, bleiben die Mechanismen, die Regulierung der wichtigsten PC Differenzierung Transkription Netze schlecht bekannt. Zelluläre Differenzierung wird meist durch epigenetische und transcriptional Änderungen angetrieben. Mit unserem in-vitro-Modell und die B PC GEP Atlas, untersuchten wir die Veränderungen der epigenetischen Faktoren bei der normalen Plasma-Zell-Differenzierung.
Epigenetische Faktor Ausdruck in normalen Plasma-Zell-Differenzierung
Wir definierten als epigenetische Faktoren gehören den folgenden Familien: DNA-Methyltransferasen (DNMT), Methyl--CpG-bindende Domäne (MBD) Proteine, Histon-Acetyltransferases (Hut), Histon Deacetylases (HDAC), Histon-Methyltransferasen (HMT) und Histon-Demethylases (HDM) wie oben beschrieben für16 (ergänzendeTabelle 1 Krebszellen). Wir untersuchten die epigenetische Faktoren differenziell ausgedrückt, während PC-Differenzierung mit unserem in-vitro-Modell, gereinigt Reifen Knochenmark PCs (BMPCs) und "B, PC-Atlas" mit dem GenomicScape-Webtool (Abbildung 2). Mit Multiklassen-SAM-Analyse, wir fanden 71 Gene signifikant differentiell zwischen MBCs, PrePBs, PBs, frühen PCs und BMPCs mit einer false Discovery Rate < 5 % (Abbildung 3Aund3 b und ergänzendeTabelle 2). MBC Bühne zeichnet sich durch die Überexpression von 23 epigenetische Spieler Genen einschließlich 39.13 % der Histon-Acetyltransferases (Hüte), 30.43 % der Histon-Methyltransferasen (HMTs), 21,74 % der Histon-Demethylases (HDMTs), 4,35 % Methyl-bindende Proteine und 4,35 % der HDACs (Abbildung 4). 14 epigenetische Spieler wurden speziell auf die PrePBs Bühne, darunter 50 % der HMTs, 14,28 % der DNMTs, 21,43 % der HDACs, 7,14 % der HDMTs und 7,14 % der Hüte (Abbildung 3) überexprimiert. PBs-Bühne zeichnet sich durch die Überexpression von 5 epigenetische Spieler mit 2 HDMTS, 2 HMTs und 1 DNMT. 4 epigenetische Spieler sind in frühen PCs (1 HDAC, 1 Hut, 1 HMT und 1-Methyl-bindendes Protein) überexprimiert. In BMPCs wurden 10 epigenetische Faktoren speziell überexprimieren, darunter 50 % der HMT (ergänzendeTabelle 2).
Die wichtigsten Änderungen in epigenetische Faktor Ausdruck auftreten, während die MBCs PrePBs Übergang mit einer Downregulation von 23 MBCs-Genen und Hochregulation der 14 PrePBs epigenetische Gene (Abbildung 4). MBCs überexprimiert deutlich Hüte posttranslationale Modifikationen der Histone beteiligt. Histon-Acetylierung beeinflußt Chromatinstruktur was zu Enttauung des Chromatins und steigenden Transkription von Genen, die durch Verdichtung des Chromatins epigenetisch zum Schweigen gebracht werden. Die MBCs PrePBs Übergang ist auch eine bedeutende Herabregulation der Hüte, eine Hauptverschiebung in HMTs Ausdruck und Bereicherung in der HDACs und DNMTs Genexpression zugeordnet. PrePB Bühne zeichnet sich interessanterweise auch durch die Überexpression von MMSET HMT. MMSET/WHSC1/NSD2 ist ein SET Domäne mit Histon-Lysin-Methyltransferase, die di und Trimethylate Histon H3 an Lysin 36 kann. MMSET engagiert sich in der gegenseitigen t(4;14)(p16;q32) Translokation in einer Untergruppe des multiplen Myeloms, der mit einer schlechten Prognose verbunden ist. Es wurde berichtet, dass MMSET beteiligt ist DNA-Reparatur zur Regelung der Induktions von H4K20 Methylierung auf Histone um DNA-Doppelstrang Brüchen, erleichtert, die wiederum 53BP1 Rekrutierung17. PrePBs sind sehr wuchern im Vergleich zu MBCs mit 50 % der Zellen in der S-Phase11 darauf hindeutet, dass die PrePBs-Bühne mit einer hohen replikativen Stress verbunden sein könnte. Überexpression des MMSET konnte bei der Prävention von Replikation Stress-induzierten DNA-Schäden in PrePBs teilnehmen.
PB und frühen PCs präsentiert ähnliche epigenetische Faktor Expressionsprofile (Abbildung 2). BMPCs zeichnen sich durch eine spezifische Überexpression des HMT und HDAC, die Ig Sekretion Stress Anpassung einschließlich EHMT2 und HDAC6verbunden sind. Reife BMPCs haben die Eigenschaft, Programmbenutzer und absondern von großen Mengen von Antikörpern. Diese hohe Synthese von Immunglobulinen ist verbunden mit einer fehlgefaltete Protein-induzierte Spannung und die Entwicklung des endoplasmatischen Retikulum (ER) als Reaktion auf diese Produktion aufnehmen. Unsere Ergebnisse zeigen Veränderungen der großen Genexpression von epigenetischen Faktoren, die eine wichtige Rolle, während B PC Differenzierung durch epigenetische vermittelte Neuprogrammierung Ereignisse spielen können.
Abbildung 1 : In-vitro-Plasmazelle Differenzierung Modell. Die PC-Differenzierung-Modell rekapituliert die verschiedenen Schritte der menschlichen PC-Generation. In einem ersten Schritt B Speicherzellen sind zunächst vier Tage lang durch CD40-Liganden, Oligodeoxynukleotiden und Zytokin-Kombination aktiviert und in Preplasmablasts zu unterscheiden. In einem zweiten Schritt werden Preplasmablasts induziert, in Plasmablasts zu unterscheiden, indem CD40L und Oligodeoxynukleotiden Anregung zu entfernen und ändern die Zytokin-Kombination. In einem dritten Schritt werden Plasmablasts induziert, in frühen Plasmazellen zu unterscheiden, indem Sie ändern die Cytokine Kombination11,12. Ein vierter Schritt wurde eingeführt, um ausgereifte Plasmazellen Kultivierung dieser frühen Plasmazellen mit Stromazellen Knochenmarkzellen oder SC konditioniert Medium und APRIL für zwei Monate13auskommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Menschliche PC Differenzierung Modell Hervorhebung CD20, CD38 und CD138 Ausdruck in Pre-Plasmablasts (PrePBs), Plasmablasts (PBs) und Plasmazellen (PCs), die Reinigung zu ermöglichen mit Zelle Sorter und Affymetrix Gene Expression profiling. GenomicScape-Webtool ermöglicht das Expressionsprofil eines oder mehrere Gene des Interesses an B auf PC Differenzierung Dataset zu visualisieren und analysieren differentiell exprimierten Genen zwischen Zelle Subpopulationen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Multi-SAM Klassenanalyse. Die Signale der 71 epigenetischen Faktoren signifikant differentiell ausgedrückt während B PC Differenzierung (SAM-Analyse; FDR < 0,05) in B-Gedächtniszellen (MBCs, n = 5), Preplasmablasts (PrePBs, n = 5), Plasmablasts (PB, n = 5), frühe Plasmazellen (frühen PCs, n = 5) und normalen Knochenmarkzellen Plasma (BMPCs, n = 5) sind zu hoch (dunkelrot) Ausdruck von Low (tief blau) angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Anteil der epigenetischen Gene DNMTs, Methyl--CpG-bindende Domäne (MethylBP) Proteine, Histon-Acetyltransferases (Hut), Histon Deacetylases (HDAC), Histon-Methyltransferasen (HMT) und Histon Demethylases Kategorien deutlich überexprimiert in MBCs oder PrePBBs. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Tabelle 1: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Tabelle 2: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In der Human-PC sind seltene Zellen mit Differenzierung Stufen statt an anatomischen stellen, die volle biologische Charakterisierung zu behindern. Haben wir einen in-vitro-B mit PC Differenzierung Modell mehrstufige Systeme wo sind verschiedene Kombinationen von Aktivierung Moleküle und Zytokine anschließend angewendet, um die sequenzielle Zelldifferenzierung im reproduzieren der verschiedene Organe/Gewebe in Vivo11,12,13.
Weitere effiziente in-vitro-B auf PCs Differenzierung Modelle waren gemeldeten18,19. Das Modell von Le Gallou entwickelte Et Al. erforschte T-Zell-abhängigen B PC Differenzierung mit einer zweistufigen Kultur Methodik CD19 ab+/CD27– -naive B-Zellen. Cocco Et Al. berichtet eine in-vitro-Modell, langlebigen PCs ab insgesamt B Zellen19zu generieren. Unsere Strategie imitiert die Aktivierung und Differenzierung in germinal Center mit CD40 und Toll-Like-Rezeptor auftretenden Aktivierung imitiert T Zelle Hilfe und Antigen Aktivierung verwendet in Kombination mit Zytokine produziert von dendritischen Zellen, Makrophagen und T-Helfer . Aktivierung mit sCD40L und CpG ODN Erträge an die Generation der PrePBs, die in Lymphknoten, Tonsillen und Knochenmark in menschlichen11,20identifiziert wurden. Diese Übergangsphase zeichnet sich durch das Fehlen von Markierungen CD20, CD38 und CD138 und der Coexpression von B und PC TFs, sondern auf einem reduzierten Niveau im Vergleich zu B-Zellen, PBs, oder PC11. Diese Übergangsphase ist von besonderem Interesse, da sie Proteasom-Inhibitor Widerstand in multiplen Myelom-Patienten20,21verknüpft ist. Auch wenn PCs ohne IL-1518,19generiert werden konnte, IL-15 zusätzlich zur Verfügung gestellt, in unseren Händen, optimierte Ergebnisse bei der Erzeugung von CD20–CD38++ Zellen am 4. Tag11,12. Zugabe von IL-21 wäre von besonderem Interesse, da IL-21 PC Differenzierung durch BLIMP Induktion vermittelt durch Aktivierung STAT3 als zuvor gemeldeten19,22fördert. Wie berichtet von Cocco Et Al. komplexe Bedingungen Kultur mit IL-21, IFN-α, IL6 und Stromazellen Zelle konditioniertes mittlere Unterstützung eines langlebigen PCs der Generation. Wir berichteten, dass langfristige Überlebensfähigkeit des PCs unterstützt wird, in-vitro-sein könnte mit IL-6, APRIL und Stromazellen Zelle konditioniertes Medium oder nur die zwei Wachstumsfaktoren. Stromale Zellen produzieren große PC Wachstumsfaktoren, insbesondere IL-6 und Galectin13,19,23,24,25 und unterstützen die Wechselwirkungen zwischen hämatopoetischen Zellen und PCs26. APRIL ist darüber hinaus eines der wichtigsten Wachstumsfaktoren beteiligt PCs überleben, produziert von blutbildenden Zellen27,28. Zur Vermeidung von Heterogenität, die im Zusammenhang mit verschiedenen Quellen von Stromazellen Zellen dienten Resto-6 Stromazellen Zellen, entwickelt und zur Verfügung gestellt von Karin Tarte Lab, zwischen 8 und 15 Abschnitte13,29. Resto-6 Zellen express CD90, CD73 und CD105 Stromazellen Zelle Marker und das Wachstum von normalen und malignen B Zellen29effizient zu unterstützen.
Jedoch konnte eine moderate Heterogenität des Anteils der aktivierten B-Zellen, PrePBs, PBs und PCs abhängig von gesunden Spenderblut verwendet für das Gedächtnis B Zellen Reinigung11,12,13beobachtet werden. Die generierten langlebigen PCs sind nicht-PCs, zu überleben und produzieren Immunglobuline für mehr als drei Monate in vitro, als ihre in-vivo Gegenstück13Radfahren. Langlebige PCs express hoch CD138 und gen Ausdruck Profile im Zusammenhang mit in-vivo-PCs13. Darüber hinaus zeichnet sich ein höheres Verhältnis von gespleißt, unspliced XBP1 zusammen mit höheren Ausdruck von IRF4 und PRDM1 PCs Transkriptionsfaktoren die langlebigen PCs erhaltenen in Vitro im Vergleich zu frühen PCs im erzielt Tag 10-13.
Es wird gedacht, epigenetische und transcriptional Änderungen kontrollieren zellulären Übergänge während der Entwicklung. Allerdings ist die terminal Differenzierung der B-Lymphozyten zu Plasmazellen ein einzigartiges Verfahren, deren epigenetischen Veränderungen weitgehend unbekannt bleiben. Demnach haben wir vor kurzem analysiert die MiRnome der normalen PC-Differenzierung und neuartige zentrale MiRNAs, die Regulierung der Netze von Bedeutung für den normalen PC Differenzierung14identifiziert. Wir haben gezeigt, dass verschiedene MiRNAs auch in die Regulierung der Expression von zentralen Transkriptionsfaktoren während PCD, darunter IRF4, PRDM1, ELL2 und ARID3A14teilnehmen konnte. Demnach haben wir hier die Charakterisierung der epigenetischen Verwandten gen Profile während B PC Differenzierung mit GenomicScape-open-Access-Plattform erweitert. Dieser Ansatz erlaubt uns, Chromatin ändern Enzym Gene gezielt in den verschiedenen Phasen des PC Differenzierung zu identifizieren. MBCs überexprimiert deutlich Hüte bekanntermaßen verursachen Nuleosomal umgestaltet, die Transkription Bindungsstellen verfügbar macht. In Promotor-Region des großen B-Zell-TFs einschließlich PAX5, CIITA, SPIB und BCL630,31wurden Histon posttranskriptionelle Modifikationen, einschließlich Histon Acetylierung gemeldet. Darüber hinaus Proteomic Analysen gezeigt, dass BCL6 CREBBP und EP300 (überexprimiert in MBCs) interagieren und könnte eine Rolle bei der transkriptionellen Regulation des BCL632. PAX5, zeigte auch Ziel Genexpression regulieren durch die Rekrutierung von Chromatin umgestalten und Histon Proteine33ändern. Pax5 zeigte H3K4 Methylierung und H3K9 Acetylierung an Promotoren ihre aktivierten Ziel Gene33induzieren.
Epigenetische Hauptfaktor GEP Änderungen wurden während der MBCs PrePBs Übergang mit einer großen Herabregulation der Hüte zusammen mit erhöhtem HMTs Ausdruck und Bereicherung der HDACs und DNMTs Genexpression identifiziert. PrePB Übergangsphase ist ein stark wuchernden Zelle Bevölkerung11. Demnach mehrere epigenetische Faktoren bekannt, in Zelle Proliferationskontrolle einschließlich DNMT134, EZH235,36,37,38 und MMSET39,40 einbezogen wurden identifiziert und Zelle Aktivierung und Proliferation Induktion in der PrePB Phase beteiligt sein könnte.
Zeitpunkt Ende des B zu PC Differenzierung BMPCs überexprimiert epigenetische Faktoren, einschließlich EHMT2 und HDAC6, bekannt, dass ER Stress-Reaktion beteiligt sein. ER und Golgi-Apparat spielen eine wichtige Rolle im PC, die Synthese von sekretierten Ig unterzubringen. In Blase Krebszellen EHMT2 Hemmung stimuliert ER Stress und induziert Apoptose41. HDAC6 gehört zu der Klasse 2 b-Familie von HDACs. Es ist bekannt, eine Rolle in Protein-Homöostase und die UPR42,43 und HDAC6-Hemmer in klinischen Studien auf bösartige PCs in Multiple Myelom/Plasmozytom getestet. Unsere Daten unterstreichen, dass epigenetische Faktoren sezernierenden PCs in Homöostase der langlebigen Ig eine Rolle spielen können.
Mit Lentivirale Vektoren und/oder spezifische Inhibitoren, könnte es interessant zu untersuchen, die Rolle dieser biologischen Bahnen und Chromatin ändern Enzyme im Chromatin remodeling, PC Differenzierung und Funktionen wie oben beschrieben von unserer Gruppe sein 44.
Die Erkenntnisse aus dieser Forschung könnte informieren und weisen auf diagnostische und therapeutische Strategien für PC-Störungen, wie z. B. bei multiplem Myelom, eine Krebserkrankung ohne eine endgültige Heilung für die bessere Prognose und verbesserte therapeutische Strategien kritisch werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von INCA Französisch (Institut National du Cancer) Institut (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) und ITMO Krebs (MM & TT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD2 magnetic beads | Invitrogen | 11159D | |
| Anti-CD138-APC | Beckman-Coulter | B49219 | |
| Anti-CD19-APC | BD | 555415 | |
| Anti-CD20-PB | Beckman-Coulter | B49208 | |
| Anti-CD27-PE | BD | 555441 | |
| Anti-CD38-PE | Beckman-Coulter | A07779 | |
| Anti-histidine | R&D Systems | MAB050 | |
| CpG ODN(PT) | Sigma | T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T |
|
| human Transferin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| IFN-α | Merck | Intron A | |
| IMDM | Gibco | 31980-022 | |
| Recombinan Human CD40L-hi | R&D Systems | 2706-CL | |
| Recombinant Human APRIL | R&D Systems | 5860-AP-010 | |
| Recombinant Human IL-10 | R&D Systems | 217-IL- | |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15-10ug | |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL- | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 |
References
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
- Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
- Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
- Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
- Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
- Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
- Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
- Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
- Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
- Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
- Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
- Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
- Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
- Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077 (2015).
- Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).
- Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
- Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
- Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
- Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
- Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
- Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
- Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
- Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
- Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
- Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
- Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
- Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
- McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
- Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
- Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
- Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
- Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877 (2017).
- Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121 (2018).
- Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
- Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
- Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4 (2015).
- Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
- Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
- Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).
