Summary
Bruker flertrinns kultur systemer, rapportere vi en i vitro B-celle til plasma celle differensiering modell.
Abstract
Plasma celler (stk.) skiller ut store mengder av antistoffer og utvikle fra B-celler som har blitt aktivert. PCer er sjeldne celler finnes i benmarg eller mucosa og sikre humoral immunitet. Deres lav frekvens og plassering, studiet av PCer er vanskelig i menneskelig. Vi rapporterte en B til PC i vitro differensiering modellen med valgte kombinasjoner av cytokiner og aktivisering molekyler som kunne reprodusere sekvensiell celledifferensiering forekommer i vivo. I denne i vitro modellen, minne B-celler (MBCs) vil skille ut før plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), tidlig PCer og til slutt i varige nær PCer, med en fenotypen sine kolleger i friske individer. Vi har også bygget en åpen tilgang Bioinformatikk verktøy for å analysere den mest fremtredende informasjonen fra GEP data relatert til PC differensiering. Disse ressursene kan brukes til å studere human B til PC differensiering og i denne studien, vi undersøkt genet uttrykk regulering av epigenetic faktorer i human B til PC differensiering.
Introduction
Differensiering av B-celler til plasma celler (stk.) er avgjørende for humoral immunitet og beskytte verten mot infeksjoner1. B å PC differensiering er forbundet med store endringer i transkripsjon kapasitet og metabolisme å imøtekomme til antistoff sekret. Transkripsjonsfaktorer som kontrollerer B til PC differensiering har vært grundig studert og avdekket eksklusive nettverk inkludert B - og PC-spesifikke transkripsjon faktorer (TFs)2. B celler er PAX5, BCL6 og BACH2 TFs voktere av B celle identitet2,3. Induksjon av IRF4, PRDM1 koding BLIMP1 og XBP1 PC TF vil slukke B celle gener og indusere en koordinert antistoff-sekresjon celle transcriptional programmet3,4,5. Koordinerte transcriptional endringene er forbundet med Ig gener transkripsjon aktivisering med en bryter fra skjemaet membran-bundet til secreted form av immunglobulin tunge kjeden2,3, 4. B til PC differensiering er knyttet til induksjon i gener involvert i endoplasmatiske retikulum og Golgi apparatet fungerer samtidig med oppslåtte protein svar (UPR) aktivisering kjent for å spille en nøkkelrolle i PC ved imøtekommende syntesen av utskilles immunglobuliner6,7. TF-XBP1 spiller en viktig rolle i denne mobilnettet tilpasning8,9,10.
B-celler og PCer er sentrale aktører i humoral immunitet. Forstå biologiske prosesser som kontrollerer produksjonen og overlevelse av normale plasma celler er kritisk i terapeutiske tiltak som skal sikre effektiv immunreaksjoner og forhindre autoimmunitet eller uimottakelig mangel. PC er sjeldne celler differensiering-tidligfasen som finner sted i anatomisk steder som hemmer full biologiske karakterisering, spesielt i menneskelig. Bruker flertrinns kultur systemer, har vi rapportert en i vitro B PC differensiering modellen. Denne modellen reproduserer den sekvensielle celledifferensiering og modning forekommer i forskjellige organer i vivo11,12,13. I et første skritt, minne B-celler er først aktivert for fire dager av CD40 ligand, oligodeoxynucleotides og cytokin kombinasjon og differensiere i preplasmablasts (PrePBs). Under det andre trinnet hjulpet preplasmablasts til å skille ut plasmablasts (PBs) ved å fjerne CD40L og oligodeoxynucleotides stimulering og endre cytokin kombinasjonen. I en tredje trinnet er plasmablasts overtalt til å skille ut tidlig PCer ved å endre de cytokin kombinasjon11,12. En fjerde trinnet ble innført for å få fullt ut modne PCer ved dyrking disse tidlige PCs med benmarg stromal celler betinget medium eller valgt vekstfaktorer13. Disse eldre PCer kan overleve flere måneder i vitro og skiller ut store mengder immunglobulin (figur 1). Interessant, viser vår i vitro modell koordinerte transcriptional endringene og fenotypen av ulike B til PC stadier som kan være oppdaget i vivo11,12,13,14 ,15. PCer er sjeldne cellene våre i vitro differensiering modellen kan studere human B til PC differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger retningslinjene i henhold til erklæringen i Helsinki og avtalen av Montpellier University Hospital for biologiske ressurser.
1. i Vitro Normal Plasma celle differensiering modell
Merk: PCer er generert gjennom en fire-trinns kultur11,12,13.
-
B celle forsterkning og differensiering
- Bruk perifert blod celler fra friske frivillige for minne B celle rensing.
- Fortynne 7,5 mL blod med 24,5 mL RPMI 1640 medium.
- Legge til 12,5 mL rommet tetthet gradert (f.eks Ficoll) i et sterilt 50 mL konisk rør. Forsiktig overlegg tetthet gradient med de 32 mL utvannet blod. Minimere blanding av de to fasene.
- Sentrifuge 20 min på 500 x g med bremsen av. Samle PBMCs fra utvannet plasma/tetthet gradert grensesnittet og plasserer cellene i et sterilt 50 mL rør og fullføre til 45 mL med Hanks balansert salt løsning.
- Sentrifuge celler for 5 min på 500 x g. Nøye fjerne nedbryting og holde pellet.
- Legge til 45 mL RPMI1640/10% fosterets kalv serum (FCS) og sentrifuger 5 min på 500 x g. Nøye fjerne nedbryting og holde pellet. Legge til 30 mL av PBS/2% FCS.
-
Fjerne CD2 + celler ved hjelp av anti-CD2 magnetiske perler. Legge til 4 perler for en Målcelle. Inkuber 30 min på 4 ° C.
- Separate perle-bundet celler fra ubundet celler ved hjelp av en magnet for cellen separasjon program. Samle ubundet celler og ruge celle pellets med anti CD19 APC og anti CD27 PE antistoffer i 15 minutter på 4 ° C (2 µL antistoff for 106 celler).
- Vask to ganger i PBS/10% geit serum.
- Fjern skadelige hendelser på begge FSC og SSC tomter. Tegne singleter på FSC-A vs FSC-H og SSC-A vs SSC-H tomter å fjerne rusk og velg befolkningen totale leukocytter. Velg minne B-celler på CD19/CD27 og CD19+CD27+.
- Rense MBCs celle sortering med en 95% renhet.
- Utføre alle kultur trinnene bruker IMDM og 10% FCS, supplert med 50 mg/mL menneskelige transferrin og 5 mg/mL menneskelige insulin.
-
Plate renset MBCs i seks-brønnen plater (1,5 x 105 MBCs/mL i 5 mL/godt), for 4 dager, med IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL), og IL-15 (10 ng/mL).
- Legge til Phosphorothioate CpG ODN 2006 histidin-merket rekombinant menneskelige løselig CD40L (sCD40L; 50 ng/mL) og anti-polyhistidine mAb (5 mg/mL) for MBCs Aktivisering (figur 1). Aktivering av sCD40L eller ODN bare med samme cytokin cocktail gir lavere forsterkning12. Kombinasjonen av aktivisering signaler beskrevet her ledet til maksimalt antall aktivert B celler og PrePBs11,12 (figur 1).
- For gene expression profilering, rense CD38-/CD20- PrePBs, på dag 4, med cellen sortering (figur 2).
-
Plasmablastic generasjon
- På dag 4, telle celler.
- Plate cellene i 12-brønnen plater på 2.5 x 105/mL i 2 mL/godt.
- Indusere differensiering av fjerning av CpG oligonucleotides og sCD40L og tillegg av en ny kultur medium med en ny cytokin cocktail inkludert IL-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) og IL-15 (10 ng/mL) (figur 1). Kultur celler for 3 dager (fra dag 4 til dag 7) på 37 ° C.
- For gene expression profilering, rense CD38+/CD20- PBs, på dagen 7, bruker celle sortering (figur 2).
-
Tidlig plasmacelle generasjon
- På dag 7 telle celler.
- Plate celler i 12-brønnen plater på 5 x 105/mL i 2 mL/godt.
- Skille PB i tidlig PCer bruker ferske kultur medium med IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) og IFN-α (500 U/mL) for 3 dager på 37 ° C. For gene expression profilering, rense CD20-/CD38+/CD138+ tidlig PCer, på dagen 10, bruker celle sortering (figur 2).
-
Lang levetid plasma generasjon
- Skille tidlig PCer til lenge levde PCer ved å endre kulturen betingelsene.
- Kultur cellene i 12-brønnen plater på 5 x 105/mL i 2 mL/godt eller i 24-brønnen plater i 1 mL/bra på 37 ° C, IL-6 og stromal cell betinget medium og APRIL (200 ng/mL).
- Få stromal cell-conditioned medium ved dyrking stromal celler i 5 dager med kultur medium. Filtrere stromal cell kulturen supernatant (0,2 µm) og fryse.
- Legge til 50% av stromal cell-conditioned media PC kulturer med fornyelse hver uke. Genererte varige PCer kan opprettholdes for måneder13. Langsiktige overlevelse av PCer kan hentes og IL-6 APRIL som rapporterte13.
- Grad Ig sekret fra flowcytometri sortert PCer.
- Kultur PCer på 106 celler/mL 24 h og høste kultur nedbryting. Måle IgG og IgA med menneskelige enzymet knyttet immunosorbent analysen (ELISA) kits11,12,13. Median IgG utskillelsen fra 10 pg/cellen/dag på 10 til 17 pg/cellen/dag dag 6013.
2. molekylær Atlas b til PC differensiering
Merk: Vi bygget en praktisk og åpen tilgang Bioinformatikk verktøy for å trekke ut og visualisere fremste informasjonen fra Affymetrix GEP data relatert til PC differensiering (GenomicScape)15. GEP er offentlig tilgjengelig fra ArrayExpress database (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) inkludert renset MBCs, PrePBs, PBs og EPCs: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 og E-MEXP-3034 og BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape er en fritt tilgjengelig webtool.
-
Utvalg av B PC DataSet
- Velg B PC DataSet i menyen Bla gjennom dataene i GenomicScape åpen tilgang bioinformatic verktøyet (http://www.genomicscape.com) kalles menneskelige B-celler til plasma celler. Visualisering av gene expression profil av unike genet eller en liste over gener er tilgjengelig ved hjelp av verktøyet Uttrykk-Coexpression rapport i Analyseverktøy som finnes på hjemmesiden.
-
Veiledet analyse og viktigste komponenten analyse (PCA)
- Velg verktøy | webSAM laste verktøyet SAM.
- Velg den menneskelige B-celler til plasma celler datasettet og velg grupper av prøver å sammenligne.
- Bruke ulike filtre tilgjengelig bruke filtreringsalternativene av interesse.
- For å sammenligne genet uttrykket profiler med SAM verktøyet, endre filtreringsalternativene inkludert Fold endring, antallet permutasjoner, False oppdagelsen rate og sammenligningstypen. GenomicScape vil beregne analyse og gi gener ulikt uttrykt mellom de valgte gruppene.
- Kjør viktigste komponenten analyse ved å velge Viktigste komponenten analyse Verktøy -menyen.
- Velg den menneskelige B-celler til plasma celler datasettet og velg gruppene av interesse.
- Lim inn en liste over gener av interesse eller velg gener i henhold til avviket. Lim inn en liste av gener, velger for å analysere en liste over gener/ncRNAs, klikk her... Genomicscape vil beregne PCA som kunne bli visualisert og lastet ned.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generelle prosedyren av i vitro normal PC differensiering er representert i figur 1. Ved hjelp av protokollen som presenteres her, kan vi generere tilstrekkelig mengde celler som ikke kunne hentes med ex vivo prøver fra mennesker. Selv om rollen av komplekse nettverk av transkripsjonsfaktorer involvert i PC differensiering har blitt undersøkt, fortsatt mekanismer regulere nøkkel PC differensiering transkripsjon nettverk lite kjent. Differensiering er hovedsakelig drevet av epigenetic og transcriptional. Bruke vår i vitro modell og B til PC GEP atlas, undersøkt vi endres uttrykket epigenetic faktorer i normal plasma celledifferensiering.
Epigenetic faktor uttrykk i normal plasma celledifferensiering
Vi definert som epigenetic faktorer de tilhører følgende familier: DNA methyltransferases (DNMT), metyl-CpG-bindende domene (MBD) proteiner, histone acetyltransferases (HAT), histone deacetylases (HDAC), histone methyltransferases (HMT) og histone demethylases (HDM) som tidligere beskrevet for kreft celler16 (utfyllendetabell 1). Vi undersøkt den epigenetic faktorer ulikt uttrykt under PC differensiering benytter våre i vitro modell, renset modne benmarg PCer (BMPCs) og "B til PC atlas" tilgjengelig bruker GenomicScape webtool (figur 2). Bruker multi klasse SAM analyse, vi fant 71 gener vesentlig ulikt mellom MBCs, PrePBs, PBs, tidlig PCer og BMPCs med en false oppdagelsen rate < 5% (Figur 3A&3B og utfyllendetabell 2). MBC scene er preget av overuttrykte av 23 epigenetic spiller gener inkludert 39.13% av histone acetyltransferases (luer), 30.43% av histone methyltransferases (HMTs), 21.74% av histone demethylases (HDMTs), 4,35% av methyl bindende proteiner og 4,35% av HDACs (Figur 4). 14 epigenetic spillere var overexpressed spesielt på PrePBs scenen inkludert 50% av HMTs, 14.28% av DNMTs, 21.43% av HDACs, 7.14% av HDMTs og 7.14% hatter (Figur 3). PBs scene er preget av overuttrykte 5 epigenetic spillere med 2 HDMTS, 2 HMTs og 1 DNMT. 4 epigenetic spillere er overexpressed i tidlig PCer (1 HDAC, 1 HATTEN, 1 HMT og 1 methyl bindende protein). I BMPCs var 10 epigenetic faktorer spesielt overexpressed inkludert 50% av HMT (utfyllendetabell 2).
De viktigste endringene i epigenetic faktor uttrykk oppstå under MBCs PrePBs overgang med en downregulation av 23 MBCs gener og oppregulering av 14 PrePBs epigenetic gener (Figur 4). MBCs betydelig overexpressed hatter involvert i posttranslational modifikasjoner av histones. Histone acetylation påvirker chromatin struktur som resulterer i decondensation av chromatin og øke transkripsjon av gener som er epigenetically silenced chromatin komprimeres. MBCs PrePBs overgang er også forbundet med en betydelig downregulation hatter, et stort skifte i HMTs uttrykk og berikelse i HDACs og DNMTs genuttrykk. Interessant, er PrePB scenen også preget av overuttrykte MMSET HMT. MMSET/WHSC1/NSD2 er et sett domene som inneholder histone lysin methyltransferase som kan di- og trimethylate histone H3 på lysin 36. MMSET er involvert i gjensidige t(4;14)(p16;q32) translokasjon i en undergruppe av myelom som er forbundet med dårlig prognose. Det ble rapportert at MMSET er involvert i DNA reparasjon regulere induksjon av H4K20 metylering på histones rundt DNA dobbel-strand bryter, som i sin tur forenkler 53BP1 rekruttering17. PrePBs er svært voksende forhold til MBCs med 50% av celler i S fase11 antyder at PrePBs scenen kan være knyttet til en høy replicative stress. Overuttrykte MMSET kan delta i forebygging av replikering stress-indusert DNA skade i PrePBs.
PB og tidlig PCer presentert lignende epigenetic faktor uttrykket profiler (figur 2). BMPCs kjennetegnes av en bestemt overuttrykte HMT og HDAC som er relatert til Ig sekresjon stress tilpasning inkludert EHMT2 og HDAC6. Eldre BMPCs har karakteristiske til synthetize og skiller ut store mengder av antistoffer. Denne høy syntese av immunglobuliner er forbundet med en misfolded protein-indusert stress og utvikling av endoplasmatiske retikulum (ER) svar for denne produksjonen. Våre resultater viser store gene expression endringer epigenetic faktorer som kan spille en viktig rolle under B til PC differensiering gjennom epigenetic-mediert omprogrammering hendelser.
Figur 1 : In vitro plasma celle differensiering modell. PC differensiering modellen viser de ulike trinnene av menneskelig PC generasjon. I et første skritt, minne B-celler er først aktivert for fire dager av CD40 ligand, oligodeoxynucleotides og cytokin kombinasjon og differensiere i preplasmablasts. Under det andre trinnet hjulpet preplasmablasts differensiere i plasmablasts ved å fjerne CD40L og oligodeoxynucleotides stimulering og endre cytokin kombinasjonen. I en tredje trinnet er plasmablasts overtalt til å skille ut tidlig plasma celler ved å endre de cytokin kombinasjon11,12. En fjerde trinnet ble introdusert for å få fullt ut modne plasma celler av dyrking disse tidlige plasma celler med benmarg stromal celler eller SC betinget medium og APRIL for to måneder13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Human PC differensiering modell utheving CD20, CD38 og CD138 uttrykk i pre plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs)-plasma celler (stk.) at rensing cellen sorter og Affymetrix gene expression profilering. GenomicScape webtool kan visualisere profilen for expression av ett eller flere gener interesse B til PC differensiering datasett, og analysere ulikt uttrykt gener mellom cellen subpopulasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Multi klasse SAM analyse. Signalene fra 71 epigenetic faktorene vesentlig ulikt uttrykt under B til PC differensiering (SAM analyse; FDR < 0,05) i minne B-celler (MBCs, n = 5), preplasmablasts (PrePBs, n = 5), plasmablasts (PB, n = 5), tidlig plasma celler (tidlig PCer, n = 5) og vanlig benmarg plasma celler (BMPCs, n = 5) vises fra lav (mørkeblå) til høy (dyp rød) uttrykk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Andelen epigenetic gener tilhører DNMTs, metyl-CpG-bindende domene (MethylBP) proteiner, histone acetyltransferases (HAT), histone deacetylases (HDAC), histone methyltransferases (HMT) og histone demethylases kategorier betydelig overexpressed i MBCs eller PrePBBs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende tabell 1: Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 2: Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I menneskelige, PC er sjeldne celler differensiering stadier foregår anatomiske steder som hemmer full biologiske karakterisering. Vi har utviklet et i vitro B PC differensiering modellen bruker flertrinns kultur systemer der ulike kombinasjoner av aktivisering molekyler og cytokiner brukes deretter for å reprodusere sekvensiell celledifferensiering forekommer i den forskjellige organer/vev i vivo11,12,13.
Andre effektive i vitro B PCer differensiering modeller ble rapportert18,19. Modellen utviklet av Le Gallou et al. utforsket T-celle avhengige B til PC differensiering med en to-trinns kultur metodikk fra CD19+/CD27- naiv B celler. Cocco et al. rapporterte en i vitro modell å skape varige PCer fra total B celler19. Vår strategi etterligner aktivisering og differensiering forekommer i germinal sentrum med CD40 og Toll-like reseptor aktivisering mimicking T celle hjelp og antigen Aktivering brukes i kombinasjon med cytokiner produsert av dendrittiske celler, makrofager og T helper . Aktivisering med sCD40L og CpG ODN gir generering av PrePBs som er identifisert i lymfeknuter, mandel og benmarg i menneskelig11,20. Dette overgangsreglene stadium er preget av fravær av CD20 og CD38 CD138 indikatorer og coexpression B og PC TFs, men på et redusert sammenlignet med B-celler, PBs, eller PC11. Dette overgangsreglene stadium er av spesiell interesse siden den er forbundet proteasome hemmer motstand i myelom pasienter20,21. Selv om PCer kan genereres uten IL-1518,19, IL-15 tillegg gitt, i våre hender, optimalisert resultater i generasjon CD20-CD38++ cellene på dag 411,12. Tillegg av IL-21 vil være av spesiell interesse siden IL-21 fremmer PC differensiering gjennom BLIMP induksjon formidlet av STAT3 aktivisering idet tidligere rapportert19,22. Som rapportert av Cocco et al. komplekse forhold kultur som inneholder IL-21, IFN-α, IL6 og stromal cell-conditioned middels støtte generering av varige PCer. Vi rapporterte at langsiktige overlevelse av PCer kunne støttes, i vitro, bruker IL-6 APRIL og stromal cell-conditioned medium eller to vekstfaktorer bare. Stromal celler produserer store PC vekstfaktorer, spesielt IL-6 og galectin13,19,23,24,25 og opprettholde samspillet mellom blodkreft celler og PCer26. Videre er APRIL en av de store vekst faktorene involvert i PCer overlevelse, produsert av blodkreft cellene27,28. For å unngå heterogenitet knyttet til ulike kilder stromal celler, ble Resto-6 stromal celler, utviklet og levert av Karin Tarte lab, brukt mellom avsnitt 8 og 1513,29. Resto-6 celler uttrykke CD90, CD73 og CD105 stromal cell markører og støtte effektivt veksten av normal og ondartet B celler29.
Men kan en moderat heterogenitet være observert i andelen aktivert B celler, PrePBs, PBs og PCer avhengig av frisk donor's blood benyttes for minne B celle rensing11,12,13. Genererte varige PCer er ikke-sykling PCer, overlevende og produsere immunglobuliner for mer enn tre måneder i vitro, som deres i vivo motpart13. Varige PC express svært CD138 og gene expression profiler knyttet til i vivo PCer13. Videre preget en høyere andel av skjøtes til unspliced XBP1 sammen med høyere uttrykk for IRF4 og PRDM1 PC transkripsjonsfaktorer varige PCer innhentet i vitro sammenlignet med tidlig PCer oppnådd ved Dag 1013.
Det er antatt epigenetic og transcriptional endringer kontrollere mobilnettet overganger under utvikling. Terminal differensiering av B lymfocytter til plasma celler er imidlertid en unik prosess som epigenetic endringer forblir hovedsakelig ukjent. Etter at vi nylig analysert miRnome av normal PC differensiering og identifisert romanen nøkkel miRNAs regulerer nettverk av betydning for normal PC differensiering14. Vi viste at flere miRNAs kan også delta i regulering av uttrykk for viktige transkripsjonsfaktorer under PCD, inkludert IRF4, PRDM1, ELL2 og ARID3A14. Etter at utvidet vi her karakterisering av epigenetic beslektede gener profiler under B til PC differensiering bruker GenomicScape åpen tilgang-plattformen. Denne tilnærmingen mulig for oss å identifisere chromatin endring av enzymet gener spesielt uttrykt i forskjellige stadier av PC differensiering. MBCs betydelig overexpressed hatter kan forårsake nuleosomal remodeling som eksponerer transkripsjon bindende områder. Histone post-transcriptional modifikasjoner, inkludert histone acetylation har blitt rapportert i promoter regionen store B celle TFs inkludert PAX5, CIITA, SPIB og BCL630,31. Videre proteomic analyse viste at CREBBP og EP300 (overexpressed i MBCs) samhandle med BCL6 og kunne spille en rolle i transcriptional regulering av BCL632. PAX5, ble også vist til å regulere målet genuttrykk rekruttere chromatin remodeling og histone endre proteiner33. Pax5 ble vist å indusere H3K4 metylering og H3K9 acetylation på arrangører av deres aktivert målet gener33.
Epigenetic Hovedfaktoren GEP endringer ble identifisert under MBCs PrePBs overgang med en stor downregulation hatter med en økning i HMTs uttrykk og berikelse av HDACs og DNMTs genuttrykk. Transitional PrePB fasen er en sterkt voksende celle befolkningen11. Etter at flere epigenetic faktorer kjent være involvert i spredning cellekontroll inkludert DNMT134, EZH235,36,37,38 og MMSET39,40 er identifisert og kan bli involvert i celle aktivering og spredning induksjon under PrePB stadium.
På slutten scenen B til PC differensiering, BMPCs overexpressed epigenetic faktorer, inkludert EHMT2 og HDAC6, kjent for å være involvert i ER stressrespons. ER og Golgi apparatet spiller en viktig rolle i PC for syntese av utskilles Ig. Blære kreftceller, EHMT2 hemming stimulerer ER stress og induserer apoptose41. HDAC6 tilhører klassen 2b familien til HDACs. Det er kjent for å spille en rolle i protein homeostase og UPR42,43 og HDAC6 hemmere er testet i kliniske studier for å målrette ondartet PCer i myelom. Våre data understreke at epigenetic faktorer kan spille en rolle i homeostase av varige Ig sekresjon PCer.
Bruker lentiviral vektorer og/eller bestemte hemmere, kan det være interessant å undersøke rollen disse biologiske banene og chromatin endre enzymer i chromatin remodeling, PC differensiering og funksjoner som tidligere beskrevet av vår gruppe 44.
Kunnskap fra denne forskningen kan informere og instruere på diagnostiske og terapeutiske strategier for PC lidelser, som i myelom, kreft uten definitive kur som bedre prognose og forbedret strategier er kritisk nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra fransk INCA (Institut nasjonale du kreft) Institute (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) og ITMO kreft (MM & TT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD2 magnetic beads | Invitrogen | 11159D | |
| Anti-CD138-APC | Beckman-Coulter | B49219 | |
| Anti-CD19-APC | BD | 555415 | |
| Anti-CD20-PB | Beckman-Coulter | B49208 | |
| Anti-CD27-PE | BD | 555441 | |
| Anti-CD38-PE | Beckman-Coulter | A07779 | |
| Anti-histidine | R&D Systems | MAB050 | |
| CpG ODN(PT) | Sigma | T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T |
|
| human Transferin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| IFN-α | Merck | Intron A | |
| IMDM | Gibco | 31980-022 | |
| Recombinan Human CD40L-hi | R&D Systems | 2706-CL | |
| Recombinant Human APRIL | R&D Systems | 5860-AP-010 | |
| Recombinant Human IL-10 | R&D Systems | 217-IL- | |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15-10ug | |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL- | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 |
References
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
- Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
- Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
- Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
- Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
- Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
- Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
- Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
- Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
- Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
- Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
- Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
- Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
- Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077 (2015).
- Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).
- Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
- Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
- Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
- Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
- Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
- Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
- Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
- Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
- Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
- Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
- Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
- Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
- McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
- Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
- Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
- Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
- Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877 (2017).
- Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121 (2018).
- Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
- Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
- Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4 (2015).
- Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
- Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
- Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).
