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Immunology and Infection

In Vitro modello di differenziazione delle cellule di memoria umana normale B a plasmacellule longevo

Published: January 20, 2019 doi: 10.3791/58929
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3
1IGH, CNRS, Univ Montpellier, 2Laboratory for Monitoring Innovative Therapies, Department of Biological Hematology, CHU Montpellier, 3UFR de Médecine, Univ Montpellier

Summary

Utilizzando sistemi di coltura di multi-step, segnaliamo un in vitro delle cellule B al modello di differenziazione delle cellule di plasma.

Abstract

Le cellule di plasma (pz) secernono grandi quantità di anticorpi e si sviluppano dalle cellule di B che sono state attivate. PC sono rare cellule situate nel midollo osseo o mucosa e garantire l'immunità umorale. A causa della loro bassa frequenza e la posizione, lo studio dei PC è difficile nell'essere umano. Abbiamo segnalato un B per PC modello di differenziazione in vitro utilizzando combinazioni selezionate di citochine e l'attivazione di molecole che consentono di riprodurre la differenziazione delle cellule sequenziale che si verificano in vivo. In questo modello in vitro, cellule di B (MBCs) differenzierà in pre-plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), presto PC memoria e infine, longevo pz, con un fenotipo vicino alle loro controparti in individui sani. Abbiamo inoltre sviluppato un accesso aperto bioinformatica strumenti per analizzare le informazioni più importanti dai dati GEP legate alla differenziazione di PC. Queste risorse possono essere utilizzate per studiare umano B alla differenziazione di PC e nello studio corrente, abbiamo studiato la regolazione dell'espressione genica di fattori epigenetici durante B umana alla differenziazione di PC.

Introduction

La differenziazione dei linfociti B a plasmacellule (pz) è essenziale per l'immunità umorale e proteggere l'ospite contro le infezioni1. B alla differenziazione di PC è associata con importanti cambiamenti nel metabolismo e capacità di trascrizione per ospitare a secrezione dell'anticorpo. I fattori di trascrizione che controllano B alla differenziazione di PC sono stati ampiamente studiati e rivelate reti esclusive tra cui trascrizione B - e PC-specifici fattori (TFs)2. In cellule di B, PAX5, BCL6 e BACH2 TFs sono i guardiani delle cellule B identità2,3. Induzione di IRF4, PRDM1 codifica BLIMP1 e XBP1 PC TF sarà estinguere i geni delle cellule B e indurre un coordinato disecrezione cella programma trascrizionale3,4,5. Queste modifiche trascrizionali coordinate sono associate con attivazione di trascrizione di geni Ig insieme con un interruttore dal modulo membrana-limita per la forma secreta della catena pesante dell'immunoglobulina2,3, 4. B alla differenziazione di PC è collegato con l'induzione di geni coinvolti nel reticolo endoplasmatico e Apparato del Golgi funzioni concomitante con l'attivazione di risposta (UPR) spiegata della proteina conosciuta per svolgere un ruolo chiave nel PC ospitando la sintesi di secreto immunoglobuline6,7. Il TF XBP1 svolge un ruolo importante in questo adattamento cellulare8,9,10.

Linfociti B e i PC sono attori chiave della immunità umorale. Comprendere il biologico, i processi che controllano la produzione e la sopravvivenza delle cellule di plasma normale è cruciale in interventi terapeutici che devono garantire efficienti risposte immunitarie e prevenire l'autoimmunità o immunodeficienza. PC sono rare cellule con le fasi iniziali di differenziazione che si svolgono nelle posizioni anatomiche che ostacolano la caratterizzazione biologico completo, particolarmente nell'uomo. Utilizzando sistemi di coltura di multi-step, abbiamo segnalato un B in vitro al modello di differenziazione del PC. Questo modello riproduce il sequenziale di differenziamento e maturazione che si verificano in diversi organi in vivo11,12,13. In una prima fase, le cellule B di memoria sono attivate in primo luogo per quattro giorni da CD40 ligando, oligodeoxynucleotides e citochina combinazione e differenziano in preplasmablasts (PrePBs). In una seconda fase, preplasmablasts sono indotte a differenziarsi in plasmablasts (PBs) rimuovendo la stimolazione CD40L e oligodeoxynucleotides e cambiando la combinazione di citochina. In una terza fase, plasmablasts sono indotte a differenziarsi nei primi PC modificando la citochina combinazione11,12. Un quarto passo è stato introdotto per ottenere pienamente matura pz coltivando questi primi PC con medium condizionate di cellule stromali di midollo osseo o selezionati fattori di crescita13. Questi PC maturi potrebbero sopravvivere parecchi mesi in vitro e secernono una quantità elevata di immunoglobulina (Figura 1). È interessante notare che, il nostro modello in vitro ricapitola le modifiche trascrizionali coordinate e il fenotipo della B diverso a fasi di PC che possono essere rilevati in vivo11,12,13,14 ,15. I PC sono rare cellule e il nostro modello di differenziazione in vitro permette di studiare umano B alla differenziazione di PC.

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Protocol

Il protocollo segue le linee guida in conformità con l'accordo del centro ospedale università di Montpellier per le risorse biologiche e la dichiarazione di Helsinki.

1. in Vitro normale modello di differenziazione delle cellule di Plasma

Nota: Pezzi vengono generati attraverso una cultura di quattro fasi11,12,13.

  1. Differenziazione e amplificazione delle cellule di b
    1. Utilizzare globuli periferici da volontari sani per la purificazione delle cellule di B di memoria.
    2. Diluire 7,5 mL di sangue con 24,5 mL di terreno RPMI 1640.
    3. Aggiungere 12,5 mL di pendenza di densità temperatura ambiente (ad es., Ficoll) in una provetta conica sterile 50 mL. Delicatamente e sovrapporre il gradiente di densità con il 32 mL di sangue diluito. Ridurre al minimo la miscelazione delle due fasi.
    4. Centrifugare 20 min a 500 x g con il freno fuori. Raccogliere i PBMCs dall'interfaccia di gradienti di densità/plasma diluito e collocare le cellule in una provetta sterile da 50 mL e portare a 45 mL con soluzione salina bilanciata di Hank.
    5. Centrifugare le cellule per 5 min a 500 x g. Con attenzione rimuovere il supernatante e tenere il pellet.
    6. Aggiungere 45 mL di siero fetale di vitello RPMI1640/10% (FCS) e centrifugare 5 min a 500 x g. Con attenzione rimuovere il supernatante e tenere il pellet. Aggiungere 30 mL di FCS PBS/2%.
    7. Rimuovere le cellule CD2 + usando i branelli magnetici anti-CD2. Aggiungere 4 perline per cella uno obiettivo. Incubare 30 min a 4 ° C.
      1. Celle di tallone associato separate dalle cellule non associate utilizzando un magnete per applicazione di separazione cellulare. Raccogliere le cellule non associate e incubare il pellet cellulare con CD19 APC e anti anticorpi CD27 PE per 15 minuti a 4 ° C (2 µ l di anticorpo per 106 cellule).
      2. Lavare due volte in siero di capra PBS/10%.
      3. Rimuovere gli eventi contaminanti su trame sia FSC e SSC. Trama camiciole su FSC-A vs FSC-H e SSC-A vs CHE SSC-H trame per rimuovere i detriti e per selezionare la popolazione totale del leucocita. Selezionare le celle di memoria B CD19/CD27 e CD19+CD27+.
      4. Purificare MBCs utilizzando un sorter delle cellule con una purezza del 95%.
    8. Eseguire tutti i passaggi di cultura utilizzando IMDM e 10% FCS, completati con umana insulina umana della transferrina e 5 mg/mL 50 mg/mL.
    9. Piastra purificato MBCs in piastre di coltura di sei-pozzo (1,5 x 105 MBCs/mL a 5 mL/pozzetto), per 4 giorni, con il-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL).
      1. Aggiungere fosforotioato CpG ODN 2006, istidina-etichettate ricombinante umana solubile CD40L (sCD40L; 50 ng/mL) e anti-polyhistidine mAb (5 mg/mL) per l'attivazione MBCs (Figura 1). Attivazione di sCD40L o ODN solo con la citochina stessa cocktail cede alla più bassa amplificazione12. La combinazione di segnali di attivazione descritta qui al piombo per il numero massimo di attivato le cellule B e PrePBs11,12 (Figura 1).
      2. Per profili di espressione genica, purificare CD38 /CD20–– PrePBs, al giorno 4, utilizzando un sorter delle cellule (Figura 2).
  2. Generazione di cellule plasmoblastico
    1. Al giorno 4, contare le celle.
    2. Cellule di piastra in piastre di coltura 12-pozzetti a 2,5 x 105/ml a 2 mL/pozzetto.
    3. Indurre la differenziazione dalla rimozione di oligonucleotidi CpG e sCD40L e aggiunta di un nuovo terreno di coltura con una citochina nuovo cocktail compreso il-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL) (Figura 1). Cellule di coltura per 3 giorni (dal giorno 4 al giorno 7) a 37 ° C.
    4. Per profili di espressione genica, purificare CD38+/CD20– PBs, giorno 7, utilizzando un sorter delle cellule (Figura 2).
  3. Generazione delle cellule di plasma anticipata
    1. Al giorno 7, contare le celle.
    2. Piastra di cellule in piastre di coltura 12-pozzetti a 5 x 105/ml a 2 mL/bene.
    3. Differenziare PB nei primi PC utilizzando il terreno di coltura fresco con IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) e IFN-α (500 U/mL) per 3 giorni a 37 ° C. Per profili di espressione genica, purificare CD20–/CD38+/CD138+ pz precoce, al giorno 10, utilizzando un sorter delle cellule (Figura 2).
  4. Generazione delle cellule di plasma longevo
    1. Differenziarsi primi pz in longevo PC modificando le condizioni di coltura.
    2. Cultura le cellule in piastre di coltura 12-pozzetti a 5 x 105/ml a 2 mL/bene o in piastre di coltura 24 pozzetti in 1ml/bene a 37 ° C, utilizzando IL-6 e cellule stromali condizionata medio e aprile (200 ng/mL).
    3. Ottenere stromal cell-condizionato medium di coltura delle cellule stromale per 5 giorni con terreno di coltura. Filtrare il surnatante della cultura di cellule stromali (0,2 µm) e congelare.
    4. Aggiungere il 50% di media stromal cell-condizionato alle culture di PC con rinnovo ogni settimana. Generato pz longevo essere conservato per mesi13. Sopravvivenza a lungo termine di PC potrebbe essere ottenuto con IL-6 e aprile solo come segnalati13.
    5. Secrezione di Ig misura da citometria a flusso ordinato pz.
    6. Cultura pz a 106 cellule/mL per 24 h e raccogliere il surnatante della cultura. Misurare IgG e IgA usando umano enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) l'analisi Kit11,12,13. La secrezione di IgG mediana ha variata da 10 pg/cellula/giorno al giorno 10 a 17 pg/cellula/giorno al giorno 6013.

2. molecolare Atlas di B alla differenziazione di PC

Nota: Abbiamo costruito un accesso comodo e strumenti bioinformatici per estrarre e visualizzare le informazioni più importanti dai dati Affymetrix GEP relazionati al PC differenziazione (GenomicScape)15. GEP sono pubblicamente disponibili da ArrayExpress database (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) tra cui purificato MBCs, PrePBs, PBs ed EPCs: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 ed E-MEXP-3034 e BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape è un webtool liberamente disponibile.

  1. Selezione di B per PC dataset
    1. Selezionare B per PC dataset nel menu Sfoglia dati nello strumento di bioinformatica di accesso aperto di GenomicScape (http://www.genomicscape.com) chiamato B umano cellule alle cellule di plasma. Visualizzazione del profilo di espressione genica del gene unico o una lista di geni è disponibile utilizzando lo strumento di Espressione-Coexpression Report negli Strumenti di analisi disponibili nella home page.
  2. Analisi di supervisione e analisi delle componenti principali (PCA)
    1. Selezionare Analysis Tools | Webcam per caricare lo strumento di SAM.
    2. Selezionare il dataset B umano cellule alle cellule di plasma e selezionare i gruppi di campioni da confrontare.
    3. Utilizzare i diversi filtri disponibili per applicare le opzioni di filtro di interesse.
    4. Per confrontare i profili di espressione genica con strumento di SAM, modificare le opzioni di filtro tra cui il cambiamento di Fold, numero di permutazioni, tasso di False discovery e il tipo di confronto. GenomicScape calcola l'analisi e fornire geni differenzialmente espressi tra i gruppi selezionati.
    5. Eseguire analisi delle componenti principali selezionando Analisi delle componenti principali nel menu Strumenti di analisi .
    6. Selezionare il dataset B umano cellule alle cellule di plasma e selezionare i gruppi di interesse.
    7. Incollare un elenco di geni di interesse o selezionare geni secondo la varianza. Per incollare un elenco di geni, selezionare Genomicscape per analizzare una lista di geni/ncRNAs, clicca qui... calcolerà PCA che poteva essere visualizzato e scaricato.

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Representative Results

La procedura complessiva di differenziazione in vitro di PC normale è rappresentata nella Figura 1. Utilizzando il protocollo presentato qui, potremmo generiamo un'adeguata quantità di cellule che non potrebbero essere ottenuti con campioni ex vivo umano. Anche se è stato studiato il ruolo della complessa rete di fattori di trascrizione coinvolti nella differenziazione dei PC, i meccanismi che regolano la reti di trascrizione chiave PC differenziazione ancora poco conosciuti. Differenziazione cellulare è guidata principalmente dai cambiamenti epigenetici e trascrizionali. Utilizzando il nostro modello in vitro e la B Atlante PC GEP, abbiamo studiato i cambiamenti di espressione dei fattori epigenetici nel differenziamento delle cellule di plasma normale.

Espressione di fattore epigenetico nella differenziazione delle cellule di plasma normale
Abbiamo definito come fattori epigenetici coloro che appartengono alle seguenti famiglie: methyltransferases del DNA (DNMT), proteine metilico-CpG-binding domain (MBD), istone acetiltransferasi (HAT), istone deacetilasi (HDAC), i methyltransferases dell'istone (HMT) e istone JmjC (HDM) come precedentemente descritto per il cancro cellule16 (integrativatabella 1). Abbiamo studiato l'epigenetica fattori differenzialmente espressi durante la differenziazione del PC utilizzando il nostro modello in vitro, purificato maturo midollo osseo pz (BMPCs) e "B Atlante PC" disponibili utilizzando il webtool GenomicScape (Figura 2). Usando l'analisi di multi-classe SAM, abbiamo trovato 71 geni significativamente differenzialmente tra MBCs, PrePBs, PBs, primi PC e BMPCs con un tasso di falsi scoperta < 5% (Figura 3A&3B e integrativatabella 2). MBC stadio è caratterizzato dalla sovraespressione di 23 geni epigenetici giocatore tra cui 39,13% di utilizzando istone acetiltransferasi (Hat), 30,43% delle istone metiltransferasi (HMTs), 21,74% di istone JmjC (HDMTs), 4,35% delle proteine leganti di metile e 4.35% di HDAC (Figura 4). 14 giocatori epigenetici overexpressed in particolare nella fase PrePBs compresi 50% di HMTs, 14,28% di DNMTs, 21.43% di HDAC, 7,14% del HDMTs e 7,14% del Cappelli (Figura 3). Fase di PBs si distingue per la sovraespressione di 5 giocatori epigenetici con 2 HDMTS, 2 HMTs e 1 DNMT. 4 giocatori epigenetici sono sovraespressi nei primi PC (1 HDAC, 1 cappello, 1 HMT e 1 methyl-binding protein). In BMPCs, 10 fattori epigenetici sono stati specificamente iperespresso compreso il 50% di HMT (integrativatabella 2).

I più importanti cambiamenti nell'espressione del fattore epigenetico si verificano durante il MBCs PrePBs transizione con un downregulation dei 23 MBCs geni e upregulation di 14 PrePBs geni epigenetici (Figura 4). MBCs overexpressed significativamente cappelli coinvolti nelle modifiche post-traduzionali degli istoni. Acetilazione dell'istone influisce sulla struttura della cromatina conseguente decondensazione della cromatina e aumentando la trascrizione di geni che vengono taciuti epigeneticamente mediante compattazione della cromatina. Il MBCs alla transizione di PrePBs inoltre è associato con un significativo downregulation di cappelli, un importante cambiamento nell'espressione HMTs e arricchimento nell'espressione genica HDAC e DNMTs. Interessante, PrePB fase inoltre è caratterizzata dalla sovraespressione di MMSET HMT. MMSET/WHSC1/NSD2 è un dominio SET contenente Istone lisina metiltransferasi che può di - e trimethylate istone H3 a lisina 36. MMSET è coinvolto nello spostamento reciproco t(4;14)(p16;q32) in un sottogruppo di mieloma multiplo che è associato con la prognosi difficile. E ' stato riferito che MMSET è coinvolto nella riparazione del DNA che regolano l'induzione di metilazione di H4K20 sugli istoni intorno a rotture del doppio filamento del DNA, che, a sua volta, facilita 53BP1 reclutamento17. PrePBs sono altamente proliferanti rispetto a MBCs con 50% delle cellule in fase S11 suggerendo che la fase di PrePBs potrebbe essere associata con un alto sforzo replicativo. Sovraespressione di MMSET poteva partecipare alla prevenzione di danni al DNA indotti da stress replica in PrePBs.

PB e PC presto presentato fattore epigenetico simili profili di espressione (Figura 2). BMPCs sono caratterizzati da una sovraespressione specifica di HMT e HDAC che sono legate alla Ig secrezione stress adattamento tra cui EHMT2 e HDAC6. Maturo BMPCs hanno la caratteristica di sintetizzare e secernere grandi quantità di anticorpi. Questa alta sintesi delle immunoglobuline è associata con un sforzo indotto da proteine misfolded e lo sviluppo del reticolo endoplasmatico (ER) risposta a ospitare questa produzione. I nostri risultati dimostrano cambiamenti di espressione genica principali di fattori epigenetici che possono svolgere un ruolo importante durante B alla differenziazione di PC attraverso eventi riprogrammazione epigenetica-mediati.

Figure 1
Figura 1 : Modello di differenziazione In vitro delle cellule di plasma. Il modello di differenziazione PC ricapitola i vari passaggi della generazione umana del PC. In una prima fase, le cellule B di memoria sono attivate in primo luogo per quattro giorni da CD40 ligando, oligodeoxynucleotides e citochina combinazione e differenziano in preplasmablasts. In una seconda fase, preplasmablasts sono indotte a differenziarsi in plasmablasts rimuovendo CD40L e oligodeoxynucleotides stimolazione e cambiando la combinazione di citochina. In una terza fase, plasmablasts sono indotte a differenziarsi in cellule del plasma iniziale modificando la citochina combinazione11,12. Un quarto passo è stato introdotto per ottenere cellule di plasma completamente mature coltivando queste cellule di plasma precoce con cellule stromali del midollo osseo o SC condizionata medio e aprile per due mesi13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Modello di differenziazione umana PC evidenziando espressione CD20, CD38 e CD138 in pre-plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs) e cellule di plasma (PC) che consentono la purificazione mediante Classificatore celle e profili di espressione genica di Affymetrix. GenomicScape webtool permette di visualizzare il profilo di espressione di uno o più geni di interesse in B per PC differenziazione set di dati ed analizzare geni differenzialmente espressi tra sottopopolazioni delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Analisi di multi-classe SAM. I segnali dei 71 fattori epigenetici significativamente differenzialmente espressi durante B alla differenziazione di PC (analisi di SAM; FDR < 0.05) in cellule B memoria (MBCs, n = 5), preplasmablasts (PrePBs, n = 5), plasmablasts (PB, n = 5), presto le cellule di plasma (primi PC, n = 5) e le cellule di plasma normale del midollo osseo (BMPCs, n = 5) vengono visualizzate dal basso (profondo blu) al alta espressione (profondo rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 4
Figura 4 : Percentuale di geni epigenetici appartenendo a DNMTs, proteine metilico-CpG-binding dominio (MethylBP), istone acetiltransferasi (HAT), istone deacetilasi (HDAC), i methyltransferases dell'istone (HMT) e istone JmjC categorie significativamente sovraespresso in MBCs o PrePBBs. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Complementare tabella 1: Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Complementare tabella 2: Per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Negli umani, PC sono rare cellule con fasi di differenziazione che si svolgono in luoghi anatomici che ostacolare la caratterizzazione biologico completo. Abbiamo sviluppato un B in vitro per modello di differenziazione PC utilizzando sistemi di coltura multifase dove varie combinazioni di molecole di attivazione e citochine vengono successivamente applicate al fine di riprodurre il differenziamento sequenziale che si verificano nella diversi organi/tessuti in vivo11,12,13.

Altri efficiente B in vitro ai modelli di differenziazione pz sono stati segnalati18,19. Il modello sviluppato da Le Gallou et al. esplorato T-cellula dipendente B alla differenziazione di PC con una metodologia di cultura in due fasi a partire da CD19+/CD27– le cellule di B ingenui. Cocco et al ha riferito un modello in vitro per generare longevo pz a partire da totale B cellule19. La nostra strategia imita l'attivazione e differenziazione che accade nel centro germinativo con CD40 e del recettore Toll-like attivazione che imita attivazione delle cellule T aiuto e l'antigene usato in combinazione con le citochine prodotte da cellule dendritiche, macrofagi e T helper . Attivazione con sCD40L e CpG ODN cede alla generazione di PrePBs che sono stati identificati nei linfonodi, tonsille e midollo osseo umano11,20. Questa fase di transizione è caratterizzata dall'assenza di indicatori CD20, CD38 e CD138 e il coexpression di B e PC TFs, ma ad un livello ridotto rispetto alle cellule di B, PBs, o PC11. Questa fase di transizione è di particolare interesse poiché è associato a resistenza agli inibitori del proteasoma in mieloma multiplo pazienti20,21. Anche se il PC potrebbe essere generato senza IL-1518,19, aggiunta di IL-15 fornito, nelle nostre mani, ottimizzato risultati nella generazione di CD20–CD38 ++ cellule al giorno 411,12. Aggiunta di IL-21 sarebbe di particolare interesse poiché IL 21 promuove la differenziazione del PC attraverso l'induzione di BLIMP mediato dall'attivazione STAT3 come precedentemente segnalati19,22. Come riportato da Cocco et al complesso cultura condizioni contenenti IL 21, IFN-α, IL6 e stromal cell-condizionato medio sostegno la generazione di PC longevi. Abbiamo segnalato che la sopravvivenza a lungo termine di PC potrebbe essere supportati, in vitro, utilizzando IL-6, aprile e stromal cell-condizionato medie o solo i due fattori di crescita. Cellule stromali producono fattori di crescita importanti PC, particolarmente IL-6 e galectin13,19,23,24,25 e sostengono le interazioni tra ematopoietico cellule e pz26. Inoltre, aprile è uno dei principali fattori di crescita coinvolti nella sopravvivenza pz, prodotto da cellule ematopoietiche27,28. Per evitare di eterogeneità relazionati a diverse fonti di cellule stromali, Resto-6 cellule stromali, sviluppati e forniti da laboratorio di Karin Tarte, sono state utilizzate tra i passaggi 8 e 1513,29. Resto-6 cellule esprimono marcatori di cellule stromali CD90, CD73 e CD105 e supportano in modo efficiente la crescita dei normali e maligne di cellule di B29.

Tuttavia, potrebbe essere osservata una moderato eterogeneità della percentuale di cellule B attivate, PrePBs, PBs e PC a seconda del sangue del donatore sano utilizzato per la memoria delle cellule di B purificazione11,12,13. I PC generato longevi sono non in bicicletta pz, sopravvivere e produrre immunoglobuline per più di tre mesi in vitro, come loro controparti in vivo13. Longevo pz rapidi altamente CD138 e gene expression profili correlati a in vivo pz13. Inoltre, un più alto rapporto di impiombato a unspliced XBP1 insieme più alta espressione di fattori di trascrizione di IRF4 e PRDM1 PC caratterizzato i longevi pezzi ottenuti in vitro rispetto ai primi PC ottenuto a Giorno 1013.

Si pensa epigenetici e modifiche trascrizionali controllano transizioni cellulare durante lo sviluppo. Tuttavia, la differenziazione terminale dei linfociti B nelle cellule di plasma è un processo unico cui modificazioni epigenetiche rimangono in gran parte sconosciuti. Secondo quello, abbiamo recentemente analizzato il miRnome di differenziamento normale PC e identificato romanzo Mirna chiavi regolazione reti di significato per normali PC differenziazione14. Abbiamo mostrato che diversi Mirna potevano partecipare anche nella regolazione dell'espressione di fattori di trascrizione durante PCD, compreso IRF4, PRDM1, ELL2 e ARID3A14. Secondo quello, abbiamo esteso qui la caratterizzazione dei profili epigenetici genica correlate durante B alla differenziazione di PC utilizzando la piattaforma di accesso aperto GenomicScape. Questo approccio ci ha permesso di identificare geni enzima specificamente espressi nelle varie fasi di differenziazione di PC di rimodellamento della cromatina. MBCs overexpressed significativamente cappelli noti per causare nuleosomal rimodellamento che espone i siti di legame di trascrizione. Modificazioni post-trascrizionali dell'istone, tra cui acetilazione dell'istone sono stati segnalati nella regione del promotore di TFs principali delle cellule di B, compreso PAX5, CIITA, SPIB e BCL630,31. Inoltre, analisi proteomica ha dimostrato che CREBBP ed EP300 (sovraespresso in MBCs) interagiscono con BCL6 e potrebbero svolgere un ruolo nella regolazione trascrizionale di BCL632. PAX5, inoltre è stato indicato per regolare l'espressione genica di destinazione con l'assunzione di rimodellamento della cromatina e istone modificando proteine33. PAX5 è stato indicato per indurre la metilazione H3K4 e acetilazione di H3K9 presso promotori della loro destinazione attivato geni33.

Principali fattori epigenetici GEP cambiamenti sono stati identificati durante il MBCs alla transizione di PrePBs con un downregulation principali di cappelli insieme ad un aumento nell'espressione di HMTs e arricchimento dell'espressione genica di HDAC e DNMTs. Fase transitoria di PrePB è un'elevata proliferazione cellulare popolazione11. Secondo che, diversi fattori epigenetici, noti per essere coinvolti nel controllo della proliferazione cellulare tra cui DNMT134, EZH235,36,37,38 e MMSET39,40 sono stati identificati e potrebbe essere coinvolta nell'induzione di attivazione e proliferazione delle cellule durante la fase di PrePB.

Presso lo stadio finale della B alla differenziazione di PC, BMPCs sovraespresso fattori epigenetici, tra cui EHMT2 e HDAC6, noti per essere coinvolti nella risposta allo stress di ER. ER e Golgi apparato gioca un ruolo importante nel PC per ospitare la sintesi di Ig secrete. In cellule di cancro alla vescica, EHMT2 inibizione stimola ER stress e induce apoptosi41. HDAC6 appartiene alla famiglia di classe 2b di HDAC. È conosciuto per svolgere un ruolo nella omeostasi della proteina e la UPR42,43 e HDAC6 inibitori sono testati in studi clinici di indirizzare maligno pz in mieloma multiplo. Nostra sottolineatura di dati che i fattori epigenetici possono svolgere un ruolo nell'omeostasi del longevo Ig secernenti pz.

Utilizzo di vettori lentivirali e/o inibitori specifici, potrebbe essere interessante studiare il ruolo di queste vie biologiche e gli enzimi nel rimodellamento della cromatina, differenziazione di PC e funzioni come descritte in precedenza dal nostro gruppo di rimodellamento della cromatina 44.

La conoscenza derivata da questa ricerca potrebbe informare e istruire sulle strategie diagnostiche e terapeutiche per i disturbi di PC, come nel caso del mieloma multiplo, un tumore senza una cura definitiva per quale migliore prognosi e strategie terapeutiche migliori sono criticamente necessari.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal francese INCA (Institut National du Cancer) Institute (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) e cancro ITMO (MM & TT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-CD2 magnetic beads Invitrogen 11159D
Anti-CD138-APC Beckman-Coulter  B49219
Anti-CD19-APC BD 555415
Anti-CD20-PB Beckman-Coulter  B49208
Anti-CD27-PE BD 555441
Anti-CD38-PE Beckman-Coulter  A07779
Anti-histidine R&D Systems MAB050
CpG ODN(PT) Sigma T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human Transferin Sigma-Aldrich T3309
IFN-α Merck Intron A
IMDM Gibco 31980-022
Recombinan Human CD40L-hi R&D Systems 2706-CL
Recombinant Human APRIL R&D Systems 5860-AP-010
Recombinant Human IL-10 R&D Systems 217-IL-
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-
Recombinant Human IL-6 Peprotech 200-06

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Immunologia e infezione numero 143,
In Vitro modello di differenziazione delle cellule di memoria umana normale B a plasmacellule longevo
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Jourdan, M., de Boussac, H.,… More

Jourdan, M., de Boussac, H., Viziteu, E., Kassambara, A., Moreaux, J. In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells. J. Vis. Exp. (143), e58929, doi:10.3791/58929 (2019).

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