Summary
Utilizando sistemas de cultura de várias etapas, relatamos uma células B in vitro para o modelo de diferenciação de células plasmáticas.
Abstract
Os plasmócitos (PCs) secretam grandes quantidades de anticorpos e desenvolver a partir de células B que foram ativadas. PCs são raras células localizadas na medula óssea ou mucosa e garantir imunidade humoral. Devido à sua baixa frequência e localização, o estudo dos PCs é difícil em humanos. Nós relatamos um B para PC modelo de diferenciação in vitro usando combinações selecionadas de citocinas e a ativação de moléculas que permitem reproduzir a diferenciação de células sequenciais ocorrem in vivo. Neste modelo in vitro, células B (MBCs) irão diferenciar em pre-plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), cedo PCes de memória e, finalmente, em Long-lived PCs, com um fenótipo perto de suas contrapartes em indivíduos saudáveis,. Também construímos uma acesso aberto bioinformática ferramentas para analisar as informações mais importantes de dados GEP relacionados à diferenciação de PC. Esses recursos podem ser usados para estudar B humano para diferenciação de PC e no atual estudo, investigamos a regulação da expressão gênica de fatores epigenéticos durante B humano para diferenciação de PC.
Introduction
A diferenciação das células B para células plasmáticas (PCs) é essencial para a imunidade humoral e proteger o hospedeiro contra infecções1. B a diferenciação de PC está associado com grandes mudanças na capacidade de transcrição e metabolismo para acomodar a secreção de anticorpos. Os fatores de transcrição que controlam a B para diferenciação de PC têm sido muito estudados e revelou redes exclusivas incluindo transcrição B PC-específicas e fatores (TFs)2. Em células B, PAX5, BCL6 e BACH2 TFs são os guardiães das células B identidade2,3. Indução de IRF4, PRDM1 , BLIMP1 e XBP1 PC TF de codificação irá extinguir genes de células B e induzir uma coordenada desegregação celular programa transcriptional3,4,5. Essas alterações transcricionais coordenadas estão associadas com a ativação de transcrição de genes de Ig juntamente com um interruptor de forma a membrana-limite para a forma secretada da imunoglobulina cadeia pesada2,3, 4. B para diferenciação de PC está relacionada com a indução de genes envolvidos no retículo endoplasmático e complexo de Golgi funções concomitante com ativação de resposta (UPR) unfolded da proteína conhecida por desempenhar um papel-chave no PC por acomodar a síntese de secretado imunoglobulinas6,7. A XBP1 de TF desempenha um papel importante nesta adaptação celular8,9,10.
As células B e PCs são jogadores-chave da imunidade humoral. Noções básicas sobre o biológico processos que controlam a produção e a sobrevivência das células de plasma normais é crítico em intervenções terapêuticas que precisam assegurar eficientes respostas imunes e prevenir auto-imunidade ou deficiência imunológica. PC são raras células com estágios iniciais de diferenciação que ocorrem em locais anatómicos que dificultam a caracterização biológica, particularmente em humanos. Utilizando sistemas de cultura de várias etapas, registramos um B in vitro para PC modelo de diferenciação. Este modelo reproduz a diferenciação celular sequencial e maturação ocorrendo em diferentes órgãos em vivo11,12,13. Numa primeira fase, as células de memória B são ativado pela primeira vez por quatro dias por combinação de CD40 ligante, oligodeoxynucleotides e citocinas em diferenciarem em preplasmablasts (PrePBs). Em uma segunda etapa, preplasmablasts são induzidas de se diferenciarem em plasmablasts (PBs) removendo estimulação CD40L e oligodeoxynucleotides e mudar a combinação do cytokine. Em uma terceira etapa, plasmablasts são induzidos a se diferenciar em PCs cedo, alterando a combinação de citocina11,12. Um quarto passo foi introduzido para obter PCs totalmente maduros pelo cultivo destes primeiros PCs com meio condicionados de células do estroma de medula óssea ou selecionado de fatores de crescimento13. Estes PCs maduros podem sobreviver vários meses in-vitro e secretam quantidades elevadas de imunoglobulina (Figura 1). Curiosamente, o nosso modelo in vitro recapitula as alterações transcricionais coordenadas e o fenótipo do B diferente fases de PC que pode ser detectado em vivo11,12,13,14 ,15. PCs são células raras e nosso modelo de diferenciação in vitro permite estudar B humano para diferenciação de PC.
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Protocol
O protocolo segue as diretrizes em conformidade com o acordo do Centro Hospital Universidade de Montpellier para recursos biológicos e a declaração de Helsinque.
1. no modelo de diferenciação de células plasmáticas Vitro Normal
Nota: PCes são gerados através de uma cultura de quatro etapas11,12,13.
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Diferenciação e amplificação de células b
- Utilize células de sangue periféricas de voluntários saudáveis para purificação de células B de memória.
- Dilua com 24,5 mL de meio RPMI 1640, 7,5 mL de sangue.
- Adicione 12,5 mL de gradiente de densidade de temperatura (por exemplo, Ficoll) para um tubo cônico estéril 50 mL. Delicadamente sobrepor o gradiente de densidade com o 32 mL de sangue diluído. Minimize a mistura das duas fases.
- Centrífuga 20 min a 500 x g com o travão de fora. Coletar os PBMCs através da interface de gradiente de densidade/plasma diluído e colocar as células em um tubo estéril 50 mL e completar a 45 mL com solução salina equilibrada do Hank.
- Centrifugar as células durante 5 min à 500 x g. Retire o sobrenadante cuidadosamente e manter a pelota.
- Adicione 45 mL de soro de vitela fetal RPMI1640/10% (FCS) e centrifugar 5min a 500 x g. Retire o sobrenadante cuidadosamente e manter a pelota. Adicione 30 mL de PBS/2% FCS.
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Remova células CD2 + usando grânulos magnético anti-CD2. Adicione 4 grânulos para a célula de um destino. Incubar 30 min a 4 ° C.
- Células grânulo-limite separadas de pilhas unbound usando um ímã para aplicação de separação de células. Recolher pilhas unbound e incubar o centrifugado com anti CD19 APC e anti anticorpos CD27 PE durante 15 minutos a 4 ° C (2 µ l de anticorpo para 106 células).
- Lave duas vezes em soro de cabra PBS/10%.
- Remova contaminantes eventos nas parcelas de ambos FSC e SSC. Plotar singletos em FSC-A vs FSC-H e SSC-A vs QUE CCD-H lotes para remover detritos e para selecionar a população total dos leucócitos. Selecione as células de memória B CD19/CD27 e CD19+CD27+.
- Purifica MBCs usando um classificador de pilha com uma pureza de 95%.
- Execute todas as etapas de cultura usando FCS IMDM e 10%, suplementado com 50mg/mL humana transferrina e 5 mg/mL de insulina humana.
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Placa purificado MBCs em placas de cultura de seis poços (1,5 x 105 MBCs/mL, 5 mL/poço), por 4 dias, com IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL).
- Adicionar Phosphorothioate CpG ODN 2006, CD40L solúvel humana recombinante com tag histidina (sCD40L; 50 ng/mL) e mAb anti-polyhistidine (5 mg/mL) para a ativação MBCs (Figura 1). Ativação por sCD40L ou ODN somente com a mesma citocina coquetel rende-se a menor amplificação12. A combinação de sinais de ativação descritos aqui com chumbo para o número máximo de ativadas as células B e PrePBs11,12 (Figura 1).
- Para gene expression profiling, purificar CD38 /CD20–– PrePBs, no dia 4, usando um classificador de pilha (Figura 2).
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Geração de célula plasmablastic
- No dia 4, conte as células.
- Células em placas de cultura de 12 poços da placa em 2.5 x 105/mL em 2 mL/bem.
- Induzir a diferenciação pela remoção dos oligonucleotides CpG e sCD40L e adição de um novo meio de cultura com uma citocina novo cocktail, incluindo IL-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL) (Figura 1). Células de cultura por 3 dias (do dia 4 ao dia 7) a 37 ° C.
- Para gene expression profiling, purificar CD38+/CD20– PBs, no dia 7, usando um classificador de pilha (Figura 2).
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Geração precoce de células plasmáticas
- No dia 7, conte as células.
- Placa de células em placas de cultura 12-poços em 5 x 105/mL em 2 mL/bem.
- Diferenciar o PB no início PCs usando o meio de cultura fresco com IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) e IFN-α (500 U/mL) por 3 dias a 37 ° C. Para gene expression profiling, purificar CD20–/CD38+/CD138+ PCs cedo, no dia 10, usando um classificador de pilha (Figura 2).
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Geração da pilha de plasma long-lived
- Diferencie os primeiros PCs em PCs há muito tempo viveu alterando as condições de cultura.
- Cultura de células em placas de cultura 12-poços em 5 x 105/mL em 2 mL/bem ou em placas de cultura de 24-poço em 1 mL/bem a 37 ° C, usando a IL-6 e células estromais condicionado médio e abril (200 ng/mL).
- Obter do estroma celular-condicionado médio por cultivo de células do estroma por 5 dias com meio de cultura. Filtrar o sobrenadante de cultura de pilha do estroma (0,2 µm) e congelar.
- Adicione 50% da mídia condicionada por células do estroma para culturas de PC com renovação toda semana. PCs long-lived gerados podem ser mantidos por meses13. Sobrevivência de longo prazo dos PCs poderia ser obtida com a IL-6 e abril apenas como relatado13.
- Secreção de Ig medida de citometria de fluxo classificado unid.
- Cultura de PCs em 106 células/mL de sobrenadante de cultura de 24 h e colheita. Medir a IgG e IgA usando humana enzima-lig da imunoabsorção kits de ensaio (ELISA)11,12,13. A secreção de IgG mediana variou de 10 pg/célula/dia, no dia 10 a 17 pg/célula/dia em 60 dias13.
2. molecular Atlas de B para diferenciação de PC
Nota: Nós construímos um acesso conveniente e aberto de ferramentas de Bioinformática para extrair e visualizar as informações mais proeminentes de dados Affymetrix GEP relacionados com PC diferenciação (GenomicScape)15. GEP estão publicamente disponíveis do banco de dados ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) incluindo purificada MBCs, PrePBs, PBs e EPCs: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 e E-MEXP-3034 e E BMPC-MEXP-2360 de14,15. Genomicscape é uma ferramenta Web livremente disponível.
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Seleção de B para PC dataset
- Selecione B para PC dataset no menu Procurar dados na ferramenta de bioinformatic de acesso aberto GenomicScape (http://www.genomicscape.com) chamado humano B células de células plasmáticas. Visualização do perfil de expressão do gene do gene original ou uma lista de genes está disponível usando a ferramenta de Relatório de expressão-Coexpression nas Ferramentas de análise disponíveis na página inicial.
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Análise de supervisão e análise de componentes principais (PCA)
- Selecione ferramentas de análise | webSAM para carregar a ferramenta de SAM.
- Escolha o dataset de células B humano de plasmócitos e selecione os grupos de amostras para comparar.
- Use os filtros diferentes disponíveis para aplicar as opções de filtragem de interesse.
- Para comparar perfis de expressão de gene com ferramenta de SAM, modifica as opções de filtragem, incluindo mudança de dobra, o número de permutações, taxa falsa da descoberta e o tipo de comparação. GenomicScape irá calcular a análise e fornecer genes diferencialmente expressados entre os grupos selecionados.
- Execute análise de componentes principais, selecionando Análise de componente Principal no menu de Ferramentas de análise .
- Escolha o dataset de células B humano de plasmócitos e selecione os grupos de interesse.
- Cole uma lista de genes de interesse ou selecionados genes de acordo com a variação. Para colar uma lista de genes, selecione Genomicscape para analisar uma lista de genes/ncRNAs, clique aqui... irá calcular PCA que poderia ser visualizada e baixada.
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Representative Results
O procedimento geral de diferenciação in vitro de PC normal é representado na Figura 1. Usando o protocolo apresentado aqui, nós poderia gerar uma quantidade adequada de células que não pode ser obtido com ex vivo amostras humanas. Embora o papel da rede complexa de fatores de transcrição envolvidos na diferenciação do PC tem sido investigado, os mecanismos de regulação principais redes de transcrição de diferenciação de PC permanecem pouco conhecidos. Diferenciação celular é conduzida principalmente por alterações epigenéticas e transcricionais. Usando nosso modelo in vitro e a B Atlas PC GEP, investigamos as mudanças de expressão dos fatores epigenéticos na diferenciação de célula de plasma normal.
Expressão do fator epigenéticas na diferenciação de célula de plasma normal
Definimos como fatores epigenéticos, aqueles que pertencem às seguintes famílias: DNA metiltransferases (DNMT), domínio de metil-CpG-binding (MBD) proteínas, histona acetiltransferases (chapéu), histona deacetilases (HDAC), metiltransferases do histone (HMT) e demethylases de histona (HDM) como descrito anteriormente para as células cancerosas16 (Supplementarytabela 1). Nós investigamos a epigenética fatores diferencialmente expressados durante a diferenciação do PC usando nosso modelo in vitro, purificado maduro PCs de medula óssea (BMPCs) e "B Atlas PC" disponível usando o webtool GenomicScape (Figura 2). Usando a análise de SAM multi-classe, encontramos 71 genes significativamente diferencialmente entre MBCs, PrePBs, PBs, primeiros PCs e BMPCs com uma taxa de detecção falsa < 5% (Figura 3A&3B e complementara tabela 2). MBC fase caracteriza-se pela superexpressão de 23 genes de jogador epigenéticas incluindo 39.13% de histona acetiltransferases (chapéus), 30,43% de histona metiltransferases (HMTs), 21.74% de histona demethylases (HDMTs), 4,35% de proteínas de ligação metil e 4,35% das HDACs (Figura 4). 14 jogadores epigenéticos foram overexpressed especificamente na fase de PrePBs, incluindo 50% de HMTs, 14,28% de DNMTs, 21.43% das HDACs, 7,14% de HDMTs e 7,14% de chapéus (Figura 3). Distingue-se pela superexpressão de 5 jogadores epigenéticos com 2 HDMTS, 2 HMTs e 1 DNMT palco de PBs. 4 jogadores epigenéticos são overexpressed em PCs precoce (1 HDAC, 1 chapéu, 1 HMT e 1 proteína metil). Em BMPCs, 10 fatores epigenéticos foram especificamente Blumental incluindo 50% de HMT (Supplementarytabela 2).
As mudanças mais importantes na expressão do fator epigenéticas ocorrem durante os MBCs para transição de PrePBs com uma downregulation de 23 genes MBCs e upregulation de 14 PrePBs epigenéticos genes (Figura 4). MBCs significativamente overexpressed chapéus envolvidos na modificação pós-traducional de histonas. Acetilação da histona afeta a estrutura da cromatina, resultando em ocorre descondensação da cromatina e aumento da transcrição de genes que são silenciados epigenetically pela compactação da cromatina. Os MBCs para transição de PrePBs também está associada com um significativo downregulation de chapéus, uma grande mudança na expressão HMTs e enriquecimento na expressão de gene HDACs e DNMTs. Curiosamente, PrePB fase também é caracterizado pela superexpressão de HMT MMSET . MMSET/WHSC1/NSD2 é um domínio conjunto contendo histona lisina methyltransferase que pode di - e trimethylate histona H3 em lisina 36. MMSET está envolvido na translocação recíproca t(4;14)(p16;q32) em um subgrupo do mieloma múltiplo que está associada com mau prognóstico. Foi relatado que o MMSET está envolvida no reparo de ADN regulamenta a indução de H4K20 metilação de histonas em torno de quebras da cadeia dupla de DNA, que, por sua vez, facilita o recrutamento de 53BP117. PrePBs altamente estão se proliferando em comparação com MBCs com 50% de células na fase S11 sugerindo que o estágio de PrePBs pode ser associado com um alto estresse replicative. Superexpressão de MMSET pode participar na prevenção de danos ao DNA replicação induzida por estresse em PrePBs.
PB e PCs início apresentaram semelhante fator epigenético perfis de expressão (Figura 2). BMPCs são caracterizados por um específico superexpressão de HMT e HDAC que estão relacionados com a adaptação de estresse de secreção Ig incluindo EHMT2 e HDAC6. BMPCs maduros têm a característica de sintetizar e secretam grandes quantidades de anticorpos. Esta elevada síntese de imunoglobulinas está associado um stress de misfolded induzida por proteína e o desenvolvimento do retículo endoplasmático (ER) resposta para acomodar esta produção. Nossos resultados demonstram alterações de expressão de gene principais dos fatores epigenéticos que podem desempenhar um papel importante durante a B para diferenciação de PC por meio de eventos de reprogramação epigenética mediada.
Figura 1 : Modelo de diferenciação In vitro de células plasmáticas. O modelo de diferenciação PC recapitula as várias etapas de geração de PC humana. Numa primeira fase, as células B de memória são ativado pela primeira vez por quatro dias por combinação de CD40 ligante, oligodeoxynucleotides e citocinas em diferenciarem em preplasmablasts. Em uma segunda etapa, preplasmablasts são induzidas de se diferenciarem em plasmablasts removendo estimulação CD40L e oligodeoxynucleotides e mudar a combinação do cytokine. Em uma terceira etapa, plasmablasts são induzidas a se diferenciar em plasmócitos cedo, alterando a combinação de citocina11,12. Um quarto passo foi introduzido para obter células de plasma totalmente maduras por cultivo essas células plasmáticas precoce com células do estroma da medula óssea ou SC condicionado médio e abril para dois meses13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Modelo de diferenciação humana PC destacando a expressão de CD20, CD38 e CD138 em pre-plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs) e células plasmáticas (PCs) que permitem que a purificação utilizando classificador da pilha e perfis de expressão de gene Affymetrix. GenomicScape webtool permite visualizar o perfil de expressão de um ou vários genes de interesse em B ao conjunto de dados de diferenciação de PC e analisar genes diferencialmente expressos entre subpopulações de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Análise de SAM multi-classe. Os sinais dos 71 fatores epigenéticos significativamente diferencialmente expressados durante B para diferenciação de PC (análise de SAM; FDR < 0,05) em células de memória B (MBCs, n = 5), preplasmablasts (PrePBs, n = 5), plasmablasts (PB, n = 5), plasmócitos precoce (primeiros PCs, n = 5) e plasmócitos normais da medula óssea (BMPCs, n = 5) são exibidos da baixa (azul escuro) a alta expressão (vermelho escuro). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Percentagem de genes epigenéticas pertencentes à DNMTs, proteínas do domínio de metil-CpG-ligação (MethylBP), histona acetiltransferases (chapéu), histona deacetilases (HDAC), metiltransferases do histone (HMT) e categorias de demethylases de histona significativamente overexpressed em MBCs ou PrePBBs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em humanos, PC são raras células com estágios de diferenciação, ocorrendo em locais anatómicos que dificultam a caracterização biológica. Nós desenvolvemos um B in vitro para PC modelo de diferenciação usando sistemas de cultura de várias etapas onde várias combinações de moléculas de ativação e citocinas posteriormente são aplicadas a fim de reproduzir a diferenciação celular sequencial ocorrendo na diferentes órgãos/tecidos em vivo11,12,13.
Outro B in-vitro eficiente para modelos de diferenciação de PCs foram relatados18,19. O modelo desenvolvido pelo Le Gallou et al explorou B dependente de células T para diferenciação de PC com uma metodologia de cultura em duas fases a partir de CD19+/CD27– ingênua B células. Cocco et al. relataram um modelo in vitro para gerar vida longa PCs a partir de células B total19. Nossa estratégia imita a ativação e diferenciação ocorrem no centro germinativo com CD40 e Toll-like receptor ativação imitando a ativação de ajuda e antígeno de células T usada em combinação com citocinas produzidas por células dendríticas, macrófagos e T helper . Ativação com sCD40L e CpG ODN produz para a geração de PrePBs que foram identificados em gânglios linfáticos, amígdalas e medula óssea em humanos11,20. Nesta fase de transição é caracterizada pela ausência de marcadores de CD20, CD38 e CD138 e o coexpression de B e PC TFs, mas em um nível reduzido em comparação com as células B, PBs, ou PC11. Nesta fase de transição é de particular interesse, pois está associada à resistência de inibidor de proteossomo em pacientes de mieloma múltiplo20,21. Mesmo que PCs podem ser gerados sem a IL-1518,19, IL-15 adição fornecida, em nossas mãos, otimizado resultados na geração de CD20–CD38 ++ células no dia 4 de11,12. Adição de IL-21 seria de particular interesse como IL-21 promove a diferenciação do PC através da indução de DIRIGÍVEL mediada por ativação de STAT3 como relatado anteriormente19,22. Conforme relatado por Cocco et al . complexo cultura condições contendo IL-21, IFN-α, IL6 e suporte médio condicionada por células estroma a geração de PCs long-lived. Informamos que a sobrevivência a longo prazo dos PCs pode ser apoiado, in vitro, usando a IL-6, abril e médio condicionada por células do estroma ou os dois fatores de crescimento só. Células do estroma produzem grandes PC fatores de crescimento, particularmente da IL-6 e galectin13,19,23,24,25 e sustentam as interações entre hematopoiéticas células e PCs26. Além disso, abril é um dos principais fatores de crescimento envolvidos na sobrevivência de PCs, produzida por células hematopoiéticas27,28. Para evitar heterogeneidade relacionada a diferentes fontes de células do estroma, células do estroma do Resto-6, desenvolvido e fornecido pelo laboratório de Karin Tarte, foram utilizadas entre passagens 8 e 1513,29. Resto-6 células expressam marcadores de células estromais CD90, CD73 e CD105 e manter eficientemente o crescimento de normais e malignas de células B29.
No entanto, uma heterogeneidade moderada pode ser observada na percentagem de células B ativadas, PrePBs, PBs e PCs dependendo do sangue do doador saudável, usado para a memória da pilha de B purificação11,12,13. Os PCs long-lived gerado são não-ciclismo PCs, sobrevivendo e produzindo imunoglobulinas para in vitro, como sua contraparte em vivo13mais de três meses. Long-lived PCs altamente expressam CD138 e gene expressão perfis relacionados ao vivo em PCs13. Além disso, uma maior taxa de emendados para unspliced XBP1 juntamente com a mais alta expressão de fatores de transcrição IRF4 e PRDM1 PCs caracterizado os PCs long-lived obtidos em vitro comparado aos primeiros PCs obtidos no Dia 10 a13.
Acredita-se epigenéticas e alterações transcricionais controlam transições celulares durante o desenvolvimento. No entanto, a terminal diferenciação dos linfócitos B em plasmócitos é um processo único, cujas modificações epigenéticas permanecem em grande parte desconhecidas. De acordo com isso, que recentemente analisou o miRnome de diferenciação de PC normal e identificado romance miRNAs chaves regulação redes de significado para normal PC diferenciação14. Nós mostramos que vários miRNAs também poderia participar na regulação da expressão de factores de transcrição chave durante PCD, incluindo IRF4, PRDM1, ELL2 e ARID3A14. De acordo com isso, nós estendemos aqui a caracterização dos perfis epigenéticos gene relacionado durante B para diferenciação de PC usando a plataforma de acesso aberto de GenomicScape. Essa abordagem nos permitiu identificar a cromatina modificando genes da enzima especificamente expressados nas diferentes fases de diferenciação de PC. MBCs significativamente overexpressed chapéus que podem causar nuleosomal remodelação que expõe os locais obrigatórios da transcrição. Pós-transcricional modificações do histone, incluindo acetilação da histona têm sido relatadas na região promotora do TFs de grandes células B, incluindo PAX5, CIITA, SPIB e BCL630,31. Além disso, a análise proteômica demonstrou que a CREBBP e EP300 (overexpressed em MBCs) interagirem com BCL6 e poderia desempenhar um papel na regulação transcricional de BCL632. PAX5, também foi mostrado para regular expressão do gene alvo, através do recrutamento de remodelamento da cromatina e histona modificando proteínas33. Pax5 foi mostrado para induzir H3K4 metilação e acetilação de H3K9 em promotores de seus de genes alvo registrados33.
Alterações de principais fatores epigenéticos GEP foram identificadas durante os MBCs para transição de PrePBs com um grande downregulation dos chapéus juntamente com um aumento na expressão de HMTs e enriquecimento das HDACs e DNMTs da expressão do gene. Fase transitória de PrePB é um altamente proliferação celular população11. De acordo com isso, vários fatores epigenéticos, conhecidos por ser envolvido no controle de proliferação de células incluindo DNMT134,38 ,37,36,do35,EZH2 e MMSET39,40 foram identificados e pode estar envolvido na indução de ativação e proliferação celular durante a fase de PrePB.
Na fase final de B para diferenciação de PC, BMPCs overexpressed fatores epigenéticos, incluindo EHMT2 e HDAC6, conhecido por ser envolvido na resposta ao estresse ER. ER e aparelho de Golgi desempenham um papel importante no PC para acomodar a síntese de Ig secretado. Em células de câncer de bexiga, inibição EHMT2 estimula o estresse de ER e induz a apoptose41. HDAC6 pertence à classe 2b família das HDACs. É conhecido por desempenhar um papel na homeostase de proteína e o UPR42,43 e inibidores de HDAC6 são testados em ensaios clínicos alvejar PCs malignas no mieloma múltiplo. Nosso sublinhado dados que fatores epigenéticos podem desempenhar um papel na homeostase de Ig long-lived secretoras de PCs.
Usando vetores Lentivirus e/ou inibidores específicos, pode ser interessante investigar o papel destas vias biológicas e cromatina modificando enzimas no remodelamento da cromatina, PC diferenciação e funções, conforme descritas pelo nosso grupo 44.
O conhecimento derivado desta pesquisa poderia informar e instruir sobre estratégias de diagnósticos e terapêuticas para distúrbios de PC, como no caso do mieloma múltiplo, um câncer sem uma cura definitiva para que as melhores estratégias terapêuticas e prognóstico melhor são criticamente necessários.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por concessões do INCA francês (Institut National du Cancer) Instituto (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) e câncer ITMO (MM & TT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD2 magnetic beads | Invitrogen | 11159D | |
| Anti-CD138-APC | Beckman-Coulter | B49219 | |
| Anti-CD19-APC | BD | 555415 | |
| Anti-CD20-PB | Beckman-Coulter | B49208 | |
| Anti-CD27-PE | BD | 555441 | |
| Anti-CD38-PE | Beckman-Coulter | A07779 | |
| Anti-histidine | R&D Systems | MAB050 | |
| CpG ODN(PT) | Sigma | T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T |
|
| human Transferin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| IFN-α | Merck | Intron A | |
| IMDM | Gibco | 31980-022 | |
| Recombinan Human CD40L-hi | R&D Systems | 2706-CL | |
| Recombinant Human APRIL | R&D Systems | 5860-AP-010 | |
| Recombinant Human IL-10 | R&D Systems | 217-IL- | |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15-10ug | |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL- | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 |
References
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