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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Dans modèle de différenciation in Vitro des cellules de la mémoire humaine normale B à longue durée de vie des cellules de Plasma

Published: January 20, 2019 doi: 10.3791/58929
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3
1IGH, CNRS, Univ Montpellier, 2Laboratory for Monitoring Innovative Therapies, Department of Biological Hematology, CHU Montpellier, 3UFR de Médecine, Univ Montpellier

Summary

À l’aide de systèmes de culture de plusieurs étapes, les auteurs rapportent une in vitro de cellules B au modèle de différenciation de cellules de plasma.

Abstract

Plasmocytes (PCs) sécrètent de grandes quantités d’anticorps et se développent à partir des cellules de B qui ont été activés. SCP est rares cellules localisées dans la moelle osseuse ou de la muqueuse et assurent l’immunité humorale. En raison de leur faible fréquence et de l’emplacement, l’étude de la SCP est difficile chez l’homme. Nous avons signalé un B PC modèle de différenciation in vitro à l’aide de certaines combinaisons de cytokines et l’activation des molécules qui permettent de reproduire la différenciation des cellules séquentielles survenant in vivo. Dans ce modèle in vitro, mémoire des cellules B (MBCs) permet de différencier en pre plasmablasts (prePBs), plasmablasts PCs (PBs), au début et enfin, dans la longue durée de vie avec un phénotype PCs, fermer à leurs homologues chez les individus sains. Nous avons construit également un libre accès bioinformatique outils pour analyser les informations principales de données LGE liées à la différenciation de PC. Ces ressources peuvent être utilisées pour étudier les humain B à la différenciation de PC et dans la présente étude, nous avons étudié la régulation de l’expression génique des facteurs épigénétiques pendant B humaine à la différenciation de PC.

Introduction

La différenciation des cellules B à plasmocytes (PCs) est essentielle à l’immunité humorale et protéger l’hôte contre l’infection1. B à la différenciation de la PC est associée à des changements majeurs dans la capacité de la transcription et le métabolisme pour accueillir à la sécrétion d’anticorps. Les facteurs de transcription qui contrôlent B à la différenciation de PC ont été largement étudiées et révélées réseaux exclusifs y compris spécifiques PC et B transcription factors (TFs)2. Dans les cellules de B, PAX5, BCL6 et BACH2 TFs sont les gardiens des lymphocytes B identité2,3. Induction IRF4, PRDM1 , codant pour BLIMP1 et XBP1 PC TF va éteindre les gènes de cellules B et induire une coordonnée sécrétant des anticorps cellule programme transcriptionnel3,4,5. Ces changements de transcriptional coordonnés sont associés à Ig gènes transcription activation avec un passage de la forme liée à la membrane à la forme sécrétée des immunoglobulines chaîne lourde2,3, 4. B à la différenciation de la PC est lié à l’induction de gènes impliqués dans le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi fonctionne concomitante avec l’activation de la protéine dépliée réponse (UPR) connue pour jouer un rôle clé dans le PC en accueillant la synthèse de sécrétion d’immunoglobulines6,7. Le TF XBP1 joue un rôle majeur dans cette adaptation cellulaire8,9,10.

Les cellules B et les PC est des acteurs clés de l’immunité humorale. Comprendre le biologique des processus qui contrôlent la production et la survie des cellules de plasma normales est essentiel dans les interventions thérapeutiques qui doivent assurer des réponses immunitaires efficaces et empêcher l’auto-immunité ou un déficit immunitaire. PC sont des cellules rares avec les premiers stades de différenciation se déroulant dans des lieux anatomiques qui entravent la caractérisation biologique complet, en particulier chez l’homme. À l’aide de systèmes de culture de plusieurs étapes, nous avons rapporté un B in vitro au modèle de différenciation de PC. Ce modèle reproduit la différenciation cellulaire séquentielle et la maturation qui se produisent dans les différents organes en vivo11,12,13. Dans un premier temps, les cellules B mémoire sont activés pendant quatre jours par CD40 ligand, oligodeoxynucleotides et cytokines combinaison et se différencient en preplasmablasts (PrePBs). Dans un second temps, preplasmablasts sont amenées à se différencier en plasmablasts (PBs) en supprimant la stimulation CD40L et oligodeoxynucleotides et changer la combinaison de cytokine. Dans une troisième étape, les plasmablasts sont induites à se différencier dans les premiers PC en changeant la cytokine combinaison11,12. Une quatrième étape a été introduite pour obtenir la pleine maturités PCs en cultivant ces premiers PCs avec milieu de la moelle osseuse des cellules stromales conditionnés ou sélectionné des facteurs de croissance,13. Ces PC mature pourrait survivre plusieurs mois in vitro et sécrètent des quantités élevées d’immunoglobuline (Figure 1). Fait intéressant, notre modèle in vitro récapitule les modifications de transcriptional coordonnées et le phénotype du B différent stades de PC qui peuvent être détectées in vivo11,12,13,14 ,,15. PC sont des cellules rares et notre modèle de différenciation in vitro permet d’étudier les humain B à la différenciation de PC.

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Protocol

Le protocole suit les directives conformément à la déclaration d’Helsinki et l’accord du Centre hospitalier de l’Université de Montpellier pour les ressources biologiques.

1. dans le modèle de différenciation pour le plasmocyte Vitro normale

Remarque : SCP est générés par une culture de quatre étapes11,12,13.

  1. Différenciation et l’amplification de lymphocytes b
    1. Utiliser des cellules du sang périphérique chez des volontaires sains pour mémoire purification de cellules B.
    2. Diluer 7,5 mL de sang par 24,5 mL du milieu RPMI 1640.
    3. Ajouter 12,5 mL de gradient de densité de température ambiante (par exemple, gradient de Ficoll) dans un tube conique stérile de 50 mL. Doucement, superposer le gradient de densité avec les 32 mL de sang dilué. Réduire au minimum le mélange des deux phases.
    4. Centrifuger 20 min à 500 x g avec le frein au large. Recueillir les PBMC de l’interface gradient de densité du plasma dilué/et placer les cellules dans un tube stérile de 50 mL et compléter jusqu'à 45 mL avec la solution saline équilibrée de Hank.
    5. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g. Avec précaution, retirez le surnageant et garder le diabolo.
    6. Ajouter 45 mL de sérum de veau foetal RPMI1640/10% (FCS) et centrifuger 5 min à 500 x g. Avec précaution, retirez le surnageant et garder le diabolo. Ajouter 30 mL de FCS PBS/2%.
    7. Supprimer CD2 + des cellules à l’aide de billes magnétiques anti-CD2. Ajouter 4 perles pour cellule une seule cible. Incuber 30 min à 4 ° C.
      1. Cellules séparées de perle-bondissent des cellules non liés à l’aide d’un aimant pour la demande de séparation de cellules. Prélever des cellules non liés et laisser incuber le culot cellulaire avec anti CD19 APC et anti anticorps CD27 PE 15 minutes à 4 ° C (2 µL d’anticorps de 106 cellules).
      2. Laver deux fois dans le sérum de chèvre PBS/10%.
      3. Supprimer les événements contaminantes sur les parcelles les FSC et SSC. Tracer les maillots sur FSC-A vs FSC-H et SSC-A vs QUE SSC-H parcelles pour enlever les débris et de sélectionner la population totale de leucocytes. Sélectionnez les cellules mémoire B CD19/CD27 et CD19+CD27+.
      4. Purifier MBCs à l’aide d’un trieur de cellules avec une pureté de 95 %.
    8. Effectuez toutes les étapes de la culture à l’aide de FCS IMDM et 10 %, additionné de 50 mg/mL 5 mg/mL et transferrine humaine l’insuline humaine.
    9. Plaque purifiée MBCs en plaques 6 puits culture (1,5 x 105 MBCs/mL à 5 mL/puits), pendant 4 jours, avec IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL) et IL-15 (10 ng/mL).
      1. Ajouter Phosphorothioate CpG ODN 2006, histidine-étiquetée recombinante humaine CD40L solubles (sCD40L ; 50 ng/mL) et anti-polyhistidine mAb (5 mg/mL) pour l’activation de MBCs (Figure 1). Activation par sCD40L ou ODN seulement avec la même cocktail de cytokine cède à plus faible amplification12. La combinaison des signaux d’activation décrite ici au plomb pour le nombre maximal d’activé les cellules B et PrePBs11,12 (Figure 1).
      2. Pour le profil d’expression génique, purifier CD38 /CD20–– PrePBs, au jour 4, à l’aide d’un trieur de cellules (Figure 2).
  2. Génération de cellules plasmablastique
    1. Au jour 4, compter les cellules.
    2. Cellules de plaques en plaques de culture de 12 puits à 2,5 x 105/ml à 2 mL/puits.
    3. Induire la différenciation par l’enlèvement des oligonucléotides CpG et sCD40L et ajout d’un nouveau milieu de culture avec une cytokine nouveau cocktail dont IL-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) et IL-15 (10 ng/mL) (Figure 1). Cellules en culture pendant 3 jours (du 4 au jour 7) à 37 ° C.
    4. Pour le profil d’expression génique, purifier CD38+/CD20– PBs, au jour 7, à l’aide d’un trieur de cellules (Figure 2).
  3. Première génération de cellules de plasma
    1. Au 7e jour, compter les cellules.
    2. Assiette de cellules dans des boîtes de culture 12-puit à 5 x 105/ml à 2 mL/bien.
    3. Différencier les PB dans les premiers PC à l’aide de milieu de culture fraîche à l’IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) et IFN-α (500 U/mL) pendant 3 jours à 37 ° C. Pour le profil d’expression génique, purifier CD20–/CD38+/CD138+ PC précoce, au jour 10, à l’aide d’un trieur de cellules (Figure 2).
  4. Génération de longue durée de vie des cellules de plasma
    1. Se différencient PCs précoce en PCs a longtemps vécus en changeant les conditions de culture.
    2. Culture de cellules dans des boîtes de culture 12-puit à 5 x 105/ml à 2 mL/bien ou en plaques 24 puits culture dans 1 mL/bien à 37 ° C, à l’aide d’IL-6 et des cellules stromales conditionné medium et avril (200 ng/mL).
    3. Obtenir stromal milieu conditionné par cellule en cultivant des cellules stromales pendant 5 jours avec milieu de culture. Filtrer le surnageant de culture de cellules stromales (0,2 µm) et congeler.
    4. Ajouter 50 % des médias de conditionnées en cellules stromales aux cultures de PC avec renouvellement chaque semaine. Généré PCs de longue durée de vie pourraient être maintenus pour mois13. La survie à long terme de PC pourrait être obtenue avec l’IL-6 et avril uniquement comme signalé13.
    5. Sécrétion d’Ig mesure de cytométrie tri PCs.
    6. La culture de PCs à 106 cellules/mL pendant 24 h et récolter le surnageant de culture. Mesurer les IgG et IgA, à l’aide humaine enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) trousses11,12,13. La sécrétion d’IgG médiane, varie de 10 pg/cellule/jour à 10 à 17 pg/cellule/jour à jour 6013.

2. moléculaire Atlas de B à la différenciation de PC

Remarque : Nous avons construit un accès commode et outils bioinformatiques pour extraire et visualiser les informations principales de données Affymetrix GEP associées à PC différenciation (GenomicScape)15. GEP sont accessibles au public de base de données ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) y compris purifiée MBCs, PrePBs, PBs et EPCs : E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 et E-MEXP-3034 et BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape est un outil Internet disponible gratuitement.

  1. Sélection de B au dataset de PC
    1. Sélectionnez B au dataset de PC dans le menu de Parcourir les données dans l’outil de bioinformatique de libre accès GenomicScape (http://www.genomicscape.com) appelé les cellules B humaines de plasma. Visualisation du profil d’expression génique de gènes unique ou une liste de gènes est disponible à l’aide de l’outil d’Expression-Coexpression rapport dans les Outils d’analyse disponibles dans la page d’accueil.
  2. Analyse sous surveillance et analyse en composantes principales (PCA)
    1. Sélectionnez Analysis Tools | webSAM pour charger l’outil SAM.
    2. Choisir le dataset les cellules B humaines de plasma , puis sélectionnez les groupes d’échantillons à comparer.
    3. Utiliser les différents filtres disponibles pour appliquer les options de filtrage d’intérêt.
    4. Pour comparer les profils d’expression génique avec outil de SAM, modifier les options de filtrage y compris changement de pli, nombre de permutations, taux de fausse découverte et le type de comparaison. GenomicScape va calculer l’analyse et de fournir des gènes différentiellement exprimés entre groupes sélectionnés.
    5. Exécuter l’analyse en composantes principales en sélectionnant Analyse en composantes principales dans le menu Outils de l’analyse .
    6. Choisir le dataset les cellules B humaines de plasma , puis sélectionnez les groupes d’intérêt.
    7. Coller une liste de gènes d’intérêt ou de certains gènes selon la variance. Pour coller une liste de gènes, sélectionnez analyser une liste de gènes/Ncrna, cliquez ici... Genomicscape calculera PCA qui pourrait être visualisé et téléchargé.

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Representative Results

La procédure globale de différenciation in vitro de PC normale est représentée dans la Figure 1. En utilisant le protocole présenté ici, nous pourrions produire une quantité suffisante de cellules qui ne peut pas être obtenu avec ex vivo des échantillons humains. Bien que le rôle du réseau complex de facteurs de transcription impliqués dans la différenciation de PC a été étudié, les mécanismes qui régissent les principaux réseaux de transcription de différenciation PC restent mal connus. Différenciation cellulaire est principalement conduite par changements épigénétiques et transcriptionnelles. En utilisant notre modèle in vitro et le B à atlas PC GEP, nous avons étudié les modifications de l’expression des facteurs épigénétiques dans la différenciation des cellules de plasma normal.

Expression du facteur de l’épigénétique dans la différenciation des cellules de plasma normal
Nous avons défini comme facteurs épigénétiques, ceux qui appartiennent aux familles suivantes : ADN méthyltransférases (DNMT), methyl-CpG-binding domain (MBD) protéines, histones acétyltransférases (chapeau), histones désacétylases (HDAC), histone methyltransferases (HMT) et déméthylases d’histones (HDM) comme décrit précédemment pour les cellules cancéreuses16 (complémentairestableau 1). Nous avons étudié l’épigénétique facteurs différentiellement exprimées au cours de la différenciation de PC à l’aide de notre modèle in vitro, purifié mature PCs (BMPCs) de la moelle osseuse et le « B pour atlas PC » disponible à l’aide du webtool GenomicScape (Figure 2). Selon l’analyse de SAM Multiclasse, nous avons trouvé 71 gènes sensiblement différemment entre MBCs, PrePBs, PBs, premiers PCs et BMPCs avec un taux de fausse découverte < 5 % (Figure 3A&3 b et complémentaires,tableau 2). Stade MBC se caractérise par la surexpression des gènes de joueur épigénétique 23 y compris 39,13 % des histones acétyltransférases (chapeaux), 30,43 % d’histone methyltransferases (HMTs), 21,74 % de déméthylases d’histones (HDMTs), 4,35 % de protéines de liaison de méthyle et de 4,35 % des HDACs (Figure 4). 14 joueurs épigénétiques sont surexprimés spécifiquement au stade PrePBs dont 50 % de HMTs, 14,28 % de DNMTs, 21.43 % des HDACs, 7,14 % de HDMTs et 7,14 % des chapeaux (Figure 3). Stade de PBs se distingue par la surexpression de 5 joueurs épigénétiques avec 2 HDMTS, 2 HMTs et 1 DNMT. 4 joueurs épigénétiques sont surexprimés dans les premiers PC (1 HDAC, 1 chapeau, 1 HMT et 1 protéine de liaison de méthyle). Dans BMPCs, les 10 facteurs épigénétiques ont été spécifiquement surexprimées dont 50 % de HMT (supplémentaire,tableau 2).

Les changements les plus importants dans l’expression du facteur de l’épigénétique se produisent pendant les MBCs à transition de PrePBs avec une diminution de 23 gènes MBCs et upregulation de 14 PrePBs épigénétiques gènes (Figure 4). MBCs significativement surexprimée chapeaux impliqués dans les modifications post-traductionnelles des histones. L’acétylation des histones affecte la structure de la chromatine, résultant en une décondensation de la chromatine et augmentant la transcription des gènes qui sont épigénétiquement réduits au silence par la compaction de la chromatine. Les MBCs à transition de PrePBs est également associée à une importante downregulation de chapeaux, un changement majeur dans l’expression HMTs et enrichissement dans l’expression des gènes HDACs et DNMTs. Fait intéressant, PrePB stade se caractérise également par la surexpression de MMSET HMT. MMSET/WHSC1/NSD2 est un domaine SET contenant méthyltransférase de lysine histone qui peut l’histone H3 sur la lysine 36 di - et trimethylate. MMSET est impliqué dans la translocation réciproque t(4;14)(p16;q32) dans un sous-groupe de myélome multiple qui est associée à un pronostic sombre. Il a été signalé que MMSET est impliquée dans la réparation de l’ADN réglementant l’induction de la méthylation de l’H4K20 sur les histones autour de cassures double brin de l’ADN, qui, à son tour, facilite la 53BP1 recrutement17. PrePBs se multiplient très comparativement à 50 % des cellules en phase S11 suggérant que l’étape de PrePBs pourrait être associée à un stress élevé réplicatif à MBCs. La surexpression des MMSET pourrait participer à la prévention des lésions de l’ADN induite par le stress réplication dans PrePBs.

PB et les premiers PC présenté facteur épigénétique similaire des profils d’expression (Figure 2). BMPCs sont caractérisées par une surexpression spécifique de HMT et HDAC qui sont liées à l’adaptation de stress de sécrétion Ig y compris EHMT2 et HDAC6. BMPCs matures ont la particularité de synthétisent et sécrètent de grandes quantités d’anticorps. Cette grande synthèse d’immunoglobulines est associée à une contrainte induite sur les protéines mal repliée et le développement du réticulum endoplasmique (re) réponse à accueillir cette production. Nos résultats démontrent des modifications de l’expression des facteurs épigénétiques qui peuvent jouer un rôle important au cours B à la différenciation de la PC par le biais de manifestations reprogrammation épigénétique médiée par gène majeur.

Figure 1
Figure 1 : Modèle de différenciation In vitro des cellules plasmatiques. Le modèle de différenciation PC récapitule les différentes étapes de la génération humaine de PC. Dans un premier temps, les cellules B mémoire sont activés pendant quatre jours par CD40 ligand, oligodeoxynucleotides et cytokines combinaison et se différencient en preplasmablasts. Dans un second temps, les preplasmablasts sont amenées à se différencient en plasmablasts en retirant la stimulation CD40L et oligodeoxynucleotides et changer la combinaison de cytokine. Dans une troisième étape, les plasmablasts sont amenées à se différencier en plasmocytes précoces en changeant la cytokine combinaison11,12. Une quatrième étape a été introduite pour obtenir la pleine maturité de plasmocytes en cultivant ces cellules plasmatiques au début avec les cellules stromales de la moelle osseuse ou milieu SC conditionné et avril pour deux mois13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Modèle de différenciation de PC humain mettant en évidence l’expression CD20, CD38 et CD138 en pre plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs) et plasmocytes (PCs) qui permettent la purification à l’aide de trieur de cellules et le profil d’expression génique Affymetrix. Webtool GenomicScape permet de visualiser le profil d’expression d’un ou plusieurs gènes d’intérêt b au PC jeu de différenciation des données et analyser les gènes différentiellement exprimés entre sous-populations de cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Analyse SAM multi-classes. Les signaux des facteurs épigénétiques 71 significativement différentiellement exprimées au cours de la B à la différenciation de PC (analyse SAM ; FDR < 0,05) en cellules B mémoire (MBCs, n = 5), preplasmablasts (PrePBs, n = 5), plasmablasts (PB, n = 5), début des plasmocytes (début PCs, n = 5) et les plasmocytes moelle osseuse normale (BMPCs, n = 5) sont affichés du bas (bleu foncé) à forte expression (rouge foncé). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 4
Figure 4 : Pourcentage d’épigénétiques gènes appartenant à DNMTs, protéines de methyl-CpG-binding domain (MethylBP), histones acétyltransférases (chapeau), histones désacétylases (HDAC), histone methyltransferases (HMT) et catégories déméthylases histone significativement surexprimés dans MBCs ou PrePBBs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire tableau 1 : S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaires tableau 2 : S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Chez l’homme, PC sont rares cellules avec des stades de différenciation qui ont lieu dans des endroits anatomiques qui entravent la caractérisation biologique complet. Nous avons développé un B in vitro au modèle de différenciation de PC à l’aide de systèmes de culture de plusieurs étapes où les différentes combinaisons de molécules d’activation et de cytokines sont appliquées par la suite afin de reproduire la différenciation des cellules séquentielles qui se produisent dans la différents organes/tissus en vivo11,12,13.

Autre B efficace in vitro aux modèles de différenciation de PCs ont été signalés18,19. Le modèle mis au point par Le Gallou Al exploré lymphocytes B dépendant à la différenciation de PC avec une méthode de culture en deux étapes à partir de CD19+/CD27– cellules de B de naïve. Cocco et coll. ont signalé un modèle in vitro pour générer des PCs de longue durées à partir de cellules de B total19. Notre stratégie imite l’activation et la différenciation qui se produisent dans le centre germinatif avec CD40 et Toll-like receptor activation imitant l’activation des cellules T aide et de l’antigène utilisée en combinaison avec les cytokines produites par T helper, les macrophages et les cellules dendritiques . Activation sCD40L et CpG ODN cède à la génération de PrePBs qui ont été identifiées dans les ganglions lymphatiques, amygdales et la moelle osseuse humaine11,,20. Cette étape de transition est caractérisée par l’absence de marqueurs CD20, CD38 et CD138 et la coexpression de B et PC TFs, mais à un niveau réduit par rapport aux lymphocytes B, PBs, ou PC11. Cette étape de transition est particulièrement intéressante car elle est associée à la résistance aux inhibiteurs du protéasome dans le myélome multiple patients20,21. Même si les ordinateurs pourraient être générés sans IL-1518,19, IL-15 ajout fourni, dans nos mains, optimisé les résultats dans la génération de CD20–CD38++ cellules au jour 411,12. Ajout de IL-21 serait d’un intérêt particulier car IL-21 favorise la différenciation PC par induction BLIMP médiée par l’activation de STAT3 comme indiqué précédemment19,22. Tel que rapporté par Cocco et coll. complexe culture conditions contenant IL-21, IFN-α, IL6 et soutien moyen conditionnées en cellules stromal la génération de PC longue durée de vie. Nous avons signalé que la survie à long terme des PC pourrait être pris en charge, in vitro, à l’aide d’IL-6, avril et moyen de conditionnées en cellules stromal ou seulement les deux facteurs de croissance. Cellules stromales produisent des principaux facteurs de croissance des PC, notamment IL-6 et galectine13,19,23,24,25 et soutiennent les interactions entre hématopoïétique cellules et PCs26. En outre, avril est l’un des principaux facteurs de croissance impliqués dans la survie de PCs, produite par les cellules hématopoïétiques27,28. Pour éviter l’hétérogénéité liée aux différentes sources de cellules stromales, Resto-6 cellules stromales, développé et fourni par le laboratoire de Karin Tarte, ont été utilisés entre passages 8 et 1513,29. Resto-6 cellules expriment des marqueurs de cellules stromales CD90, CD73 et CD105 et soutiennent efficacement la croissance de cellules normales et malignes de B29.

Toutefois, une hétérogénéité modérée pourrait être observée dans le pourcentage de cellules de B activées, PrePBs, PBs et PC selon le sang du donneur sain destiné à la mémoire cellulaire B purification11,12,13. Les PCs de longue durée de vie générées sont non-cyclisme PCs, survivre et produire des immunoglobulines in vitro, comme leur homologue in vivo13plus de trois mois. Longue durée de vie PC express hautement CD138 et gene expression profiles liés à in vivo PC13. En outre, un ratio plus élevé d’épissé à unspliced XBP1 ainsi que de l’expression plus élevée de facteurs de transcription de IRF4 et PRDM1 PCs caractérisé les vivaces PC obtenus in vitro par rapport aux premiers PC obtenus à Jour 1013.

On pense épigénétique et changements transcriptionnelles contrôlent transitions cellulaires au cours du développement. Cependant, la différenciation terminale des lymphocytes B en plasmocytes est un procédé unique dont les modifications épigénétiques demeurent largement inconnues. Selon qui, nous avons récemment analysé la miRnome de la différenciation normale de PC et identifié roman miARN clés régissant les réseaux de l’importance de la différenciation normale PC14. Nous avons montré que plusieurs miARN pourrait également participer dans la régulation de l’expression des facteurs de transcription clé au cours de PCD, dont IRF4, PRDM1, ELL2 et ARID3A14. Après cela, nous avons étendu ici la caractérisation des profils d’épigénétique gènes liés au cours B à la différenciation de PC à l’aide de la plate-forme d’accès ouvert GenomicScape. Cette approche a permis d’identifier la chromatine modification des gènes d’enzymes spécifiquement exprimés dans les différentes étapes de la différenciation de PC. MBCs significativement surexprimée chapeaux connus pour provoquer nuleosomal remodelage qui expose des sites de fixation de transcription. Modification post-transcriptionnelle histone, incluant l’acétylation des histones ont été signalées dans la région promotrice de grandes cellules B TFs dont PAX5, CIITA, SPIB et BCL630,31. En outre, l’analyse protéomique ont démontré que le CREBBP et EP300 (surexprimés dans MBCs) interagissent avec BCL6 et pourrait jouer un rôle dans la régulation transcriptionnelle de BCL632. PAX5, a été également montré pour réguler l’expression des gènes cibles en recrutant le remodelage de la chromatine et l’histone modifie les protéines33. Pax5 a été montré pour induire la méthylation H3K4 et acétylation H3K9 aux promoteurs de leurs gènes de cible activés33.

Des changements épigénétiques facteur GEP ont été identifiés au cours des MBCs à transition de PrePBs avec une diminution importante des chapeaux ainsi qu’une augmentation HMTs expression et l’enrichissement de l’expression génique HDACs et DNMTs. Phase de transition PrePB est un hautement proliferating cell population11. Après cela, plusieurs facteurs épigénétiques, connus pour être impliqués dans le contrôle de la prolifération cellulaire y compris DNMT134, EZH235,36,37,38 et MMSET39,40 ont été identifiés et pourraient être impliqués dans l’induction de l’activation et la prolifération cellulaire au cours de la phase de PrePB.

À l’étage du B à la différenciation de la PC, BMPCs surexprimé facteurs épigénétiques, y compris EHMT2 et HDAC6, connus pour être impliqués dans la réponse au stress ER. ER et appareil de Golgi jouent un rôle majeur dans le PC pour accueillir la synthèse d’Ig sécrétée. Dans les cellules cancéreuses de la vessie, inhibition EHMT2 stimule le stress du re et induit l’apoptose41. HDAC6 appartient à la famille de HDACs 2 b de la classe. Il est connu pour jouer un rôle dans l’homéostasie des protéines et l’UPR42,43 et inhibiteurs de la HDAC6 sont testés dans des essais cliniques pour cibler malins PCs dans le myélome multiple. Notre soulignement de données que facteurs épigénétiques peuvent jouer un rôle dans l’homéostasie de longue durée de vie Ig sécrétant des PCs.

À l’aide de vecteurs lentiviraux et/ou inhibiteurs spécifiques, il pourrait être intéressant d’examiner le rôle de ces voies biologiques et la chromatine modification des enzymes dans le remodelage de la chromatine, différenciation des PC et des fonctions comme décrites précédemment par notre groupe 44.

La connaissance de cette recherche pourrait informer et instruire sur les stratégies diagnostiques et thérapeutiques pour les troubles de PC, comme dans le cas de myélome multiple, un cancer sans un remède définitif pour lesquelles la meilleur pronostic et des stratégies thérapeutiques améliorées critique nécessaires.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de Français INCA (Institut National du Cancer) Institut (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) et ITMO Cancer (MM & TT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-CD2 magnetic beads Invitrogen 11159D
Anti-CD138-APC Beckman-Coulter  B49219
Anti-CD19-APC BD 555415
Anti-CD20-PB Beckman-Coulter  B49208
Anti-CD27-PE BD 555441
Anti-CD38-PE Beckman-Coulter  A07779
Anti-histidine R&D Systems MAB050
CpG ODN(PT) Sigma T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human Transferin Sigma-Aldrich T3309
IFN-α Merck Intron A
IMDM Gibco 31980-022
Recombinan Human CD40L-hi R&D Systems 2706-CL
Recombinant Human APRIL R&D Systems 5860-AP-010
Recombinant Human IL-10 R&D Systems 217-IL-
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-
Recombinant Human IL-6 Peprotech 200-06

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Immunologie et Infection numéro 143,
Dans modèle de différenciation in Vitro des cellules de la mémoire humaine normale B à longue durée de vie des cellules de Plasma
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Jourdan, M., de Boussac, H.,… More

Jourdan, M., de Boussac, H., Viziteu, E., Kassambara, A., Moreaux, J. In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells. J. Vis. Exp. (143), e58929, doi:10.3791/58929 (2019).

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