Summary
利用多步培养系统, 我们报告了体外 b 细胞对血浆细胞分化模型。
Abstract
血浆细胞 (pc) 分泌大量抗体, 并从被激活的 b 细胞中产生。pc 是位于骨髓或粘膜中的罕见细胞, 可确保体液免疫。由于其频率和位置较低, 对个人电脑的研究在人类中很困难。我们报告了 b 到 pc 体外分化模型使用选定的细胞因子和活化分子的组合, 允许重现发生在体内的细胞分化。在这个体外模型中, 记忆 b 细胞 (mbc) 将分化为前血浆 ab面 (前 pbs)、血浆 abc (pbs)、早期 pc, 最后, 分化为长寿 pc, 表型接近健康个体中的对应基因。我们还构建了一个开放访问生物信息学工具, 以分析与 pc 分化有关的 gep 数据中最突出的信息。这些资源可用于研究人 b 对 pc 分化, 在目前的研究中, 我们研究了人 b 到 pc 分化过程中表观遗传因子的基因表达调控。
Introduction
b 细胞与血浆细胞 (pc) 的分化对体液免疫和保护宿主免受感染至关重要1。b 至 pc 分化与转录能力和代谢的主要变化有关, 以适应抗体分泌。对控制 b 到 pc 分化的转录因子进行了广泛的研究, 揭示了包括 b-和 pc 特异性转录因子 (tf)2在内的专属网络。在 b 细胞中, pox5、bcl6 和 bach2 tf 是 b 细胞身份2、3 的监护人。irf4、 prdm1编码 blimp1 和xbp1 pc tf 的诱导将消灭 b 细胞基因, 并诱导一个协调的抗体分泌细胞转录程序 3,4,5。这些协调的转录变化与 ig 基因转录激活以及从膜结合形式到免疫球蛋白重链 2,3的分泌形式的转换有关,4. b 至 pc 分化与内质网和 golgi 仪器功能相关的基因诱导, 同时进行展开的蛋白质反应 (upr) 激活, 已知通过适应合成分泌免疫球蛋白6,7。tf xbp1 在这种细胞适应 8,9,10中起着重要作用。
b 细胞和 pc 是体液免疫的关键参与者。了解控制正常血浆细胞产生和存活的生物过程对于需要确保有效免疫反应和防止自身免疫或免疫缺陷的治疗干预至关重要。pc 是罕见的细胞, 早期分化阶段发生在解剖位置, 妨碍充分的生物表征, 特别是在人类。利用多步培养系统, 我们报告了一个体外 b 到 pc 分化模型。该模型再现了体内不同器官中发生的顺序细胞分化和成熟11、 12、13。第一步, 记忆 b 细胞首先被 cd40 配体、寡核苷酸和细胞因子结合激活四天, 并分化为前质体 (prepbs)。第二步, 通过去除 cd40l 和寡核苷酸刺激并改变细胞因子组合, 诱导前质体分化为质粒 (pbs)。第三步, 通过改变细胞因子组合11,12,诱导血浆 ab面体分化为早期 pc。第四步是用骨髓基质细胞条件培养基或选定的生长因子13培养这些早期的 pc, 从而获得完全成熟的 pc。这些成熟的 pc 可以在体外存活数月, 并分泌大量免疫球蛋白 (图 1)。有趣的是, 我们的体外模型重述了可在体内检测到的不同 b 到 pc 阶段的协同转录变化和表型11、12、13、14 ,15。pc 是稀有细胞, 我们的体外分化模型可以研究人的 b 到 pc 分化。
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Protocol
该议定书遵循《赫尔辛基宣言》和蒙彼利埃大学生物资源医院中心的协议。
1. 体外正常血浆细胞分化模型
请注意:pc 是通过 11、12、13的四步文化生成的。
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b 细胞扩增和分化
- 使用健康志愿者的外周血细胞进行记忆 b 细胞纯化。
- 用 rpmi 1640 培养基24.5 毫升稀释7.5 毫升血液。
- 在无菌的50毫升锥形管中加入12.5 毫升的室温密度梯度 (例如, 菲卡尔)。用稀释后的血液的32毫升轻轻覆盖密度梯度。最大限度地减少这两个阶段的混合。
- 离心20分钟在 500 x g 与刹车关闭。从稀释的等离子密度梯度界面收集 pbmc, 将细胞放入无菌的50毫升管中, 用 hank 的平衡盐溶液完成到45毫升。
- 在 500 x g处离心细胞5分钟。小心地取出上清液, 并保持颗粒。
- 加入45毫升 rpimi1640--10% 的胎儿小牛血清 (fcs), 离心剂 5分钟, 500 x克。小心地取出上清液, 并保持颗粒。加入30毫升的 pbs% fcs。
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使用抗 cd2 磁珠去除 cd2 + 细胞。为一个目标单元格添加4个珠子。在4°c 下孵化30分钟。
- 使用磁铁进行细胞分离应用, 将珠带细胞与未绑定的细胞分开。收集未结合的细胞, 并在4°c 下用抗 cd19 apc 和抗 cd27 pe 抗体孵育细胞颗粒 15分钟 (106个细胞的抗体为 2μl).
- 在 pbs% 山羊血清中清洗两次。
- 消除 fsc 和 ssc 图上的污染事件。fsc-a 与 fsc-h 和 ssc-a 与 ssc-h 地块上的地块单块, 以去除碎片并选择白细胞总数。在 cdh\ cd27 和 cd19 + cd27+上选择内存 b 单元。
- 使用纯度为95% 的细胞分选器纯化 mbc。
- 使用 imdm 和 10% fcs 进行所有培养步骤, 并辅以 50 mgml 人转铁蛋白和 5 mgml 人胰岛素。
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板纯化的六井培养基板 (1.5 x10 5 mbcsml in 5 mll 井), 为期 4天, 其中 il-2 (20 uml)、il-10 (50 ngml) 和 il-15 (10 ngml)。
- 加入磷硫代酸 cpg odn 2006, 组织标记重组重组人可溶性 cd40l (scd40l; 50 ng/ml) 和抗聚组氨酸 mab (5 mg/ml) 用于 mbc 活化 (图 1)。只有在相同的细胞因子鸡尾酒中激活 scd40l 或 odn, 以降低扩增12。这里描述的激活信号的组合导致了激活 b 细胞的最大数量和 prepbs11、12 ( 图 1)。
- 对于基因表达谱, 在第4天使用细胞分选器纯化 cd38-/cd20-cd20-prepbs (图 2)。
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等离子电池的产生
- 在第4天, 数一数细胞。
- 12井培养板中的板细胞在 2.5 x10 5/ml 中的 2 ml/井中。
- 通过去除 cpg 寡核苷酸和 scd40l 并添加一种新的培养基, 包括 il-2 (20 u/2), 促进分化, il-6 (50 ng/ml)、il-10 (50 ngml) 和 il-15 (10 ngml) (图 1)。在37°c 下培养细胞 3天 (从第4天到第7天)。
- 对于基因表达谱, 在第7天使用细胞分选器纯化 cd38+/cd20-pbs (图 2)。
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早期血浆细胞的生成
- 第7天, 数一数细胞。
- 12井板板在 5 x 10 5/ml 在 2 ml/井.
- 在37°c 条件下, 使用新鲜培养基 il-6 (50 ng/ml)、il-15 (10ng/ml) 和 ifn-α (500 uml) 在早期 pc 中区分 pb 3天。对于基因表达谱, 在第10天使用细胞分选器纯化cd20-/cd38 + cd138+早期 pc (图 2)。
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长寿命等离子体细胞的产生
- 通过改变文化条件, 将早期 pc 区分为长寿命的 pc。
- 在25°c 的 2 ml/井或 2, ml/井的24井培养板中, 用 il-6 和基质细胞条件培养基和 april (200 ngml) 培养12井培养板中的细胞.
- 用培养基培养基质细胞 5天, 获得基质细胞条件培养基。过滤基质细胞培养上清液 (0.2μm) 并冷冻。
- 添加50% 的基质细胞条件的媒体到 pc 培养与更新每周。生成的长寿命 pc 可以维持 13个月.只有在报告的 13种情况下, 白细胞介素-6 和 april 才能获得 pc 的长期生存。
- 测量流式细胞仪分类 pc 的 ig 分泌。
- 在 106 细胞培养24小时的 pc 和收获培养上清液。使用人酶联免疫吸附法 (elisa) 试剂盒11、12、13测量 igg 和 iga。中位 igg 分泌物从10分10分到60天的17细胞日不等.
2. b 到 pc 分化的分子图集
请注意:我们构建了一个方便和开放的访问生物信息学工具, 从 affymetrix gep 数据中提取和可视化与 pc 分化 (基因组景观)15有关的最突出的信息。gep 可从 arrayexpress 数据库 (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) 公开查阅, 包括纯化的 mbc、prebbs、pbs 和 epc: e-mtab-1771、e-mexp-2360 和 e-mexp-3034 和 bmpe-mexp-236014、15。基因共用是一个免费提供的网络工具。
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选择 b 到 pc 数据集
- 在 "基因视图" 开放访问生物信息工具 (http://www.genomicscape.com) 中的"浏览数据" 菜单中选择 "b 到 pc" 数据集, 称为"人 b 细胞到血浆细胞"。使用主页上提供的分析工具中的 "表达表达报告" 工具, 可以可视化独特基因的基因表达谱或基因列表。
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监督分析和主成分分析 (pca)
- 选择"分析工具" web sam以加载 sam 工具。
- 选择"人 b" 单元格到等离子单元数据集, 然后选择要比较的样本组。
- 使用可用的不同筛选器应用感兴趣的筛选选项。
- 要将基因表达谱与 sam 工具进行比较, 请修改筛选选项, 包括折叠变化、排列次数、错误发现率和比较类型。基因组学将计算分析, 并提供选定组之间的差异表达的基因。
- 通过在"分析工具"菜单中选择"主成分分析" 来运行主成分分析。
- 选择"人 b" 单元格到等离子单元数据集, 然后选择感兴趣的组。
- 粘贴感兴趣的基因列表或根据方差选择基因。要粘贴基因列表, 请选择 "要分析 genes\ ncrna 列表, 请单击此处...... genomicscape 将计算可可视化和下载的 pca。
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Representative Results
体外正常 pc 分化的总体过程如图 1所示。利用这里提出的协议, 我们可以产生足够数量的细胞, 而这些细胞无法从体内人体样本中获得。尽管研究了复杂的转录因子网络在 pc 分化中的作用, 但调节关键 pc 分化转录网络的机制仍然鲜为人知。细胞分化主要是由表观遗传和转录的变化驱动的。利用我们的体外模型和 b 到 pc gep 图集, 研究了表观遗传因子在正常血浆细胞分化中的表达变化。
表观遗传因子在正常血浆细胞分化中的表达
我们定义为表观遗传因素属于以下家族: dna 甲基转移酶 (dnmt), 甲基 cpg 结合域 (mbd) 蛋白, 组蛋白乙酰转移酶 (hat), 组蛋白去乙酰化酶 (hdac), 组蛋白甲基转移酶 (hmt) 和组蛋白去甲酰化酶 (hdm), 如前面所述的癌细胞 16 (补充表 1)。我们研究了表观遗传因素差异表达在 pc 分化过程中使用我们的体外模型, 纯化成熟骨髓 pc (bmpc) 和 "b 到 pc 地图集" 可用的基因显示网络工具 (图 2)。利用多级 sam 分析, 我们发现 mbc、prepbs、pbs、早期 pc 和 bmpc 之间的71个基因有显著差异, 发现率和 lt;5% (图 3a &3b 和补充表 2)。mbc 阶段的特点是过度表达23个表观遗传的球员基因, 包括39.13% 的组蛋白乙酰转移酶 (hat), 30.43% 的组蛋白甲基转移酶 (hmt), 21.74 的组蛋白去甲二化酶 (hds), 4.35 的甲基结合蛋白和4.35 的 hdac (图 4)。14位表观遗传玩家在预置方案阶段被过度表达, 其中50% 的 hmt、14.28 的 dmt、21.43 的 hdac、7.14 的 hdmt 和7.14 的 hat (图 3)。pbs 级的特点是5个表观遗传播放器的过度表达与 2个 hdmts, 2个 hmt 和 1个 dnmt。4个表观遗传播放器在早期 pc (1 hdac、1 hat、1 hmt 和1甲基结合蛋白) 中被过度表达。在 bmpc 中, 10个表观遗传因子被特别夸大, 包括50% 的 hmt (补充表 2)。
表观遗传因子表达最重要的变化发生在 mbc 向前 pbbs 过渡过程中, 23个 mbc 基因的下调和14个前 pbs 表观遗传基因的提高 (图 4)。mbc 明显超显 hat 参与组蛋白的翻译后修饰。组蛋白乙酰化影响染色质结构, 导致染色质的去密度和增加转录的基因是表观遗传沉默的染色质压实。mbc 与预 pbs 过渡也与 hat 的显著下调有关, hmt 在 hdac 和 dnmt 基因表达中的表达和富集发生了重大转变。有趣的是, 前 pb 阶段的另一个特点是mset hmt 的过度表达。mmetmsc:whscnsd2 是一个 set 域, 含有组蛋白赖氨酸甲基转移酶, 可在赖氨酸36上二化和三甲基化组蛋白 h3。mmset 参与了与预后不良相关的多发性骨髓瘤亚群中的对等 t(4;14)(p16;q32) 移位。据报道, mmset 参与 dna 修复, 调节 h4k20 甲基化诱导在基因组周围 dna 双链断裂, 这反过来又促进53bp1 招募17。与 mbc 相比, 在 s 阶段11中, 50% 的细胞的预 pbs 具有高度的增殖能力, 这表明预 pbs 阶段可能与高复制应力有关。mmset 的过度表达可参与预防预 pbs 中复制应激诱导的 dna 损伤。
pb 和早期 pc 呈现类似的表观遗传因子表达式配置文件 (图 2)。bmpc 的特征是 hmt 和 hdac 的特定过度表达, 这些表达与 ig 分泌应力适应有关, 包括ehmt2和hdac6。成熟的 bmpc 具有合成和分泌大量抗体的特点。这种免疫球蛋白的高合成与错误折叠的蛋白质引起的应激和内质网 (er) 反应的发展, 以适应这种生产。我们的研究结果表明, 表观遗传因子的主要基因表达变化可能在 b 到 pc 分化过程中通过表观遗传介导的重新规划事件发挥重要作用。
图 1: 体外血浆细胞分化模型.pc 微分模型概括了人类 pc 生成的各个步骤。第一步, 记忆 b 细胞首先被 cd40 配体、寡核苷酸和细胞因子结合激活四天, 并分化为前血浆。第二步, 通过去除 cd40l 和寡核苷酸刺激并改变细胞因子组合, 诱导前血浆 abc 分解分化为血浆 ab完。第三步, 通过改变细胞因子组合11,12, 诱导血浆 ab面体分化为早期血浆细胞。第四步是用骨髓基质细胞或 sc 条件培养基和 april 培养这些早期血浆细胞, 使其完全成熟, 为期两个月。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 人类 pc 分化模型突出 cd20、cd38 和 cd138 在前血浆 abc (前 pbs)、血浆 abc (pbs) 和血浆细胞 (pc) 中的表达, 允许使用细胞分选和 affymetrix 基因表达谱进行纯化.基因组网工具可以可视化 b 到 pc 分化数据集中一个或多个感兴趣的基因的表达谱, 并分析细胞亚群之间的差异表达基因。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 多级 sam 分析.71种遗传因子信号在 b 到 pc 分化过程中表达显著差异 (sam 分析;fdr < 0.05) 在记忆 b 细胞 (mbc, n = 5)、前浆体 (prepbs, n = 5)、血浆 ab洋溢 (pb, n = 5)、早期血浆细胞 (早期 pc, n = 5) 和正常骨髓浆细胞 (bmpc, n = 5) 从低 (深蓝色) 显示到高 (深红色) 表达。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:属于 dnmt、甲基-cpg 结合域 (甲基 bp) 蛋白、组蛋白乙酰转移酶 (hat)、组蛋白去乙酰化酶 (hdac)、组蛋白甲基转移酶 (hmt) 和组化酶类的表观遗传基因显著百分比在 mbc 或前多溴联苯中过度表达。请点击这里查看此图的较大版本.
补充表 1:请点击此处下载此文件.
补充表 2:请点击此处下载此文件.
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Discussion
在人类中, pc 是罕见的细胞, 分化阶段发生在解剖的地方, 妨碍充分的生物表征。我们已经开发了一个体外 b 到 pc 分化模型使用多步骤培养系统, 其中激活分子和细胞因子的各种组合随后应用, 以再现发生在体内不同的器官组织 11,12,13。
其他有效的体外 b 对 pc 分化模型报告为18,19。le gallou 等人开发的模型采用 cd19+/cd27--天真 b 细胞为研究的两步培养方法, 探讨了 t 细胞依赖性 b 至 pc 分化.cocco 等人报告了一个体外模型, 从 b 细胞总数 19开始生成长寿命 pc。我们的策略模仿在生殖细胞中心发生的激活和分化与 cd40 和 toll 样受体激活模仿 t 细胞帮助和抗原激活使用结合产生的树突状细胞, 巨噬细胞和 t 辅助体.用 scd40l 和 cpg odn 激活产生的是在人类11,20的淋巴结、扁桃体和骨髓中发现的预 pbs 的产生。这一过渡阶段的特点是没有 cd20、cd38 和 cd138 标记以及 b 和 pc tf 的协同表达, 但与 b 细胞、pbs 或 pc11相比, 水平有所下降。这个过渡阶段是特别令人感兴趣的, 因为它与蛋白酶体抑制剂耐药在多个骨髓瘤患者20,21。即使 pc 可以在没有 il-1518、19、il-15 的情况下生成, 但在我们手中也能在第411、12天生成 cd20-cd38++细胞方面获得优化的结果。增加 il-21 将是特别重要的, 因为 il-21 促进 pc 分化通过 blimp 诱导介导的 stat3 激活, 如先前报告的 19,22。据 cocco等人报告, 含有 il-21、ifn-α、il6 和基质细胞条件的复杂培养条件支持长寿命 pc 的生成。我们报告说, pc 的长期生存可以支持, 在体外, 使用 il-6, april 和基质细胞条件的培养基或两个生长因子只。基质细胞产生主要的 pc 生长因子, 特别是 il-6 和半素13、19、23、24、25,并维持造血相互作用单元和 pc26。此外, april 是 pc 生存的主要生长因子之一, 由造血细胞27,28产生。为了避免与不同来源的基质细胞有关的异质性, 卡琳·塔特实验室开发和提供的 resto-6 基质细胞在通道8至15 13,29之间使用。雷托-6 细胞表达 cd90、cd73 和 cd105 间质细胞标记, 有效地支持正常和恶性b 细胞的生长29。
然而, 根据用于记忆 b 细胞纯化 11、12、13的健康献血者血液, 在活化 b 细胞、预pbs、pbs和 pc 的百分比中可以观察到适度的异质性。生成的长寿命 pc 是非循环 pc, 在体外存活和产生免疫球蛋白超过三个月, 作为它们体内的对应物 13.长寿命的个人计算机高度表达 cd138 并且基因表示外形相关在体内个人计算机13。此外, 与早期获得的 pc 相比, 在体外获得的长寿命 pc 具有较高的拼接与无拼接 xbp1的比例, 以及较高的irf4 和 prdm1 pc 转录因子表达。第10天13.
它被认为是表观遗传和转录变化控制细胞在发展过程中的转变。然而, b 淋巴细胞最终分化为浆细胞是一个独特的过程, 其表观遗传修饰在很大程度上仍是未知的。在此, 我们最近分析了正常 pc 分化的 mirnome, 并确定了新的关键 mirna 调节网络, 对正常 pc 分化14具有重要意义。我们表明, 一些 mirna 也可以参与调节 pcd 期间关键转录因子的表达, 包括 irf4、prdm1、el2 和 arid3a14。在此基础上, 利用基因睡眠开放平台, 扩展了 b 到 pc 分化过程中表观遗传相关基因谱的表征。这种方法使我们能够识别染色质修饰酶基因, 特别是在不同阶段的 pc 分化表达。mbc 显着过度表达的 hat 已知会导致核细胞重塑, 暴露转录结合位点。在包括 pax5、ciita、spib 和bcl630、31在内的主要 b 细胞 tf 的启动子区, 包括组蛋白乙酰化在内的组蛋白后修饰报告。此外, 蛋白质组学分析表明, crebbp 和 ep300 (mbc 中的过度表达) 与 bcl6 相互作用, 并可在 bcl632 的转录调控中发挥作用。pax5 也被证明通过招募染色质重塑和组蛋白修饰蛋白33来调控靶点基因表达。pax5 被证明能诱导 h3k4 甲基化和 H3K4 乙酰化在其激活靶向基因33的启动子中。
在 mbc 向预 pbs 过渡过程中, 发现了主要的表观遗传因子 gep 变化, hat 的大幅下调, 以及 hmt 表达的增加以及 hdac 和 dnmts 基因表达的丰富程度。过渡前 pb 阶段是一个高度增殖的细胞群11。据此, 已知参与细胞增殖控制的几个表观遗传因素包括 dnmt1 34、ezh235、36、37、38和 mmset39、40已被确定, 并可能参与细胞活化和增殖诱导在前 pb 阶段。
在 b 到 pc 分化的最后阶段, bmpc 过度表达表观遗传因子, 包括ehmt2和hdac6, 已知与 er 应激反应有关。er 和 golgi 仪器在 pc 中发挥着重要作用, 以适应分泌 ig 的合成。在膀胱癌细胞中, ehmt2 抑制刺激 er 应激并诱导细胞凋亡41。hdac6 属于 hdac 的2b 类。据悉, 它在蛋白质稳态中发挥着重要作用, upr42、43和 hdac6 抑制剂在针对多发性骨髓瘤恶性 pc 的临床试验中进行了测试。我们的数据强调, 表观遗传因素可能在长寿命 ig 分泌 pc 的稳态中起一定作用。
使用慢病毒载体和/或特定的抑制剂, 它可能是有趣的研究这些生物途径和染色质修饰酶在染色质重塑, pc 分化和功能, 如我们小组之前描述的44岁
从这项研究中获得的知识可以为 pc 疾病的诊断和治疗策略提供信息和指导, 例如在多发性骨髓瘤的情况下, 一种没有明确治愈方法的癌症, 对其进行更好的预后和改进的治疗策略是非常需要的。
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Disclosures
作者们没有什么可以透露的
Acknowledgments
这项工作得到了法国国家癌症研究所 (PLBIO15-256)、anr (tie-leot 跳过) 和 itmo 癌症 (mm & tt) 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD2 magnetic beads | Invitrogen | 11159D | |
| Anti-CD138-APC | Beckman-Coulter | B49219 | |
| Anti-CD19-APC | BD | 555415 | |
| Anti-CD20-PB | Beckman-Coulter | B49208 | |
| Anti-CD27-PE | BD | 555441 | |
| Anti-CD38-PE | Beckman-Coulter | A07779 | |
| Anti-histidine | R&D Systems | MAB050 | |
| CpG ODN(PT) | Sigma | T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T |
|
| human Transferin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| IFN-α | Merck | Intron A | |
| IMDM | Gibco | 31980-022 | |
| Recombinan Human CD40L-hi | R&D Systems | 2706-CL | |
| Recombinant Human APRIL | R&D Systems | 5860-AP-010 | |
| Recombinant Human IL-10 | R&D Systems | 217-IL- | |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15-10ug | |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL- | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 |
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