利用多步骤培养系统，我们报道了一种体外B细胞向浆细胞分化的模型。
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摘要
摘要
浆细胞（PCs）分泌大量抗体，由已活化的B细胞发育而来。浆细胞是稀有细胞，主要位于骨髓或黏膜组织中，负责介导体液免疫。由于其频率低且定位特殊，在人体中研究浆细胞具有较大难度。我们报道了一种从B细胞向浆细胞 利用特定细胞因子和活化分子的组合构建体外分化模型，可重现体内发生的连续性细胞分化过程。在此体外模型中，记忆B细胞（MBCs）将依次分化为前浆母细胞（prePBs）、浆母细胞（PBs）、早期浆细胞（early PCs），最终形成长寿浆细胞（long-lived PCs），其表型接近健康个体中的相应细胞. 我们还开发了一个开放获取的生物信息学工具，用于分析与浆细胞分化相关的基因表达谱（GEP）数据中最显著的信息。这些资源可用于研究人类B细胞向浆细胞的分化过程；在本研究中，我们探讨了人类B细胞向浆细胞分化过程中表观遗传因子的基因表达调控。
引言
B细胞向浆细胞（PCs）的分化对于体液免疫至关重要，可保护宿主免受感染1。B细胞向浆细胞的分化伴随着转录能力和代谢的显著改变，以适应抗体的分泌。调控B细胞向浆细胞分化的转录因子已被广泛研究，并揭示了包括B细胞和浆细胞特异性转录因子（TFs）在内的独特调控网络2。在B细胞中，PAX5、BCL6和BACH2转录因子是维持B细胞身份的关键因子2,3。诱导表达IRF4、编码BLIMP1的PRDM1以及浆细胞特异性转录因子XBP1，将抑制B细胞相关基因的表达，并启动协调一致的抗体分泌细胞转录程序3,4,5。这些协调的转录变化伴随着免疫球蛋白基因的转录激活，以及免疫球蛋白重链从膜结合型向分泌型的转换2,3,4。B细胞向浆细胞的分化还伴随着内质网和高尔基体功能相关基因的上调，同时激活未折叠蛋白反应（UPR），后者....
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方案
该方案遵循《赫尔辛基宣言》的指导原则以及蒙彼利埃大学生物资源中心的协议。
1. 体外正常浆细胞分化模型
注意：浆细胞通过四步培养法获得11,12,13。
- B 细胞扩增与分化
- 使用健康志愿者的外周血细胞进行记忆 B 细胞的纯化。
- 将 7.5 mL 血液用 24.5 mL RPMI 1640 培养基稀释。
- 在无菌的 50 mL 锥形管中加入 12.5 mL 室温密度梯度液（例如 Ficoll），然后将 32 mL 稀释后的血液轻轻叠加在密度梯度液上方，尽量减少两相之间的混合。
- 以 500 × g 离心 20 分钟，关闭刹车。收集稀释血浆与密度梯度液界面处的外周血单个核细胞（PBMCs），转移至无菌 50 mL 管中，并用 Hank's 平衡盐溶液补至 45 mL。
- 以 500 × g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，保留沉淀细胞。
- 加入 45 mL RPMI1640/10% 胎牛血清....
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结果
体外正常浆细胞分化的整体流程如图1所示。通过本方案，我们能够生成足够数量的细胞，而这些细胞无法通过人源原代样本直接获得。尽管参与浆细胞分化的复杂转录因子网络的作用已被研究，但调控关键浆细胞分化转录网络的机制仍知之甚少。细胞分化主要由表观遗传学和转录水平的变化驱动。利用我们的体外模型以及B细胞至浆细胞的基因表达谱图谱（GEP atlas），我们研究了正常浆细胞分化过程中表观遗传调控因子的表达变化。
正常浆细胞分化过程中表观遗传因子的表达
我们将表观遗传因子定义为属于以下家族的因子：DNA甲基转移酶（DNMT）、甲基-CpG结合结构域（MBD）蛋白、组蛋白乙酰转移酶（HAT）、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）、组蛋白甲基转移酶（HMT）和组蛋白去甲基化酶（HDM），其分类依据此前在癌细胞中的描述16 (
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讨论
在人体中，浆细胞（PC）是稀有的细胞，其分化阶段发生在解剖位置上，这阻碍了对其进行全面的生物学表征。我们建立了一种体外B细胞向浆细胞分化的多步骤培养模型，通过依次添加不同组合的激活分子和细胞因子，以模拟体内不同器官或组织中发生的有序细胞分化过程11,12,13。
其他高效的体外B细胞向浆细胞分化的模型已有报道18,19由 Le Gallou 建立的模型 等人采用两步培养法，从CD19开始研究T细胞依赖的B细胞向浆细胞分化过程+/CD27- 初始B细胞。Cocco 等人报道了一种从总B细胞体外生成长寿浆细胞的模型19我们的策略模拟了生发中心中的活化与分化过程.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本工作获得了法国国家癌症研究所（Institut National du Cancer，INCA）（项目编号：PLBIO15-256）、法国国家研究局（ANR）（Tie-Skip 项目）以及癌症研究部际主题（ITMO Cancer）（MM&TT 项目）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗CD2磁珠 | Invitrogen | 11159D | |
| 抗CD138-APC | Beckman-Coulter | B49219 | |
| 抗CD19-APC | BD | 555415 | |
| 抗CD20-PB | Beckman-Coulter | B49208 | |
| 抗CD27-PE | BD | 555441 | |
| 抗CD38-PE | Beckman-Coulter | A07779 | |
| 抗组氨酸抗体 | R&D Systems | MAB050 | |
| CpG ODN(PT) | Sigma | T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T | |
| 人转铁蛋白 | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| IFN-α | Merck | Intron A | |
| IMDM | Gibco | 31980-022 | |
| 重组人CD40L-hi | R&D Systems | 2706-CL | |
| 重组人APRIL | R&D Systems | 5860-AP-010 | |
| 重组人IL-10 | R&D Systems | 217-IL- | |
| 重组人IL-15 | Peprotech | 200-15-10ug | |
| 重组人IL-2蛋白 | R&D Systems | 202-IL- | |
| 重组人IL-6 | Peprotech | 200-06 |
参考文献
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-17....
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