Summary
שימוש במערכות רב שלבי תרבות, מדווחים תא B במבחנה למודל התמיינות תאים פלזמה.
Abstract
תאים פלזמה (אישיים) מפרישים כמויות גדולות של נוגדנים, לפתח מתאי B שעברו. מחשבים הם נדירים תאים ממוקם במח העצם או רירית ולהבטיח humoral חסינות. בשל תדירות נמוכה והמיקום שלהם, המחקר של מחשבים קשה-אנוש. דיווחנו a B ל- PC מודל בידול במבחנה באמצעות שילובים הנבחר של מולקולות ציטוקינים והפעלה המאפשרות לשחזר את הבידול תא רציפים המתרחשים ויוו. במודל זה במבחנה, הזיכרון בתאי B (MBCs) להבדיל לתוך טרום plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), מוקדם מחשבים ולבסוף, חיים ארוכים, מחשבים אישיים עם פנוטיפ קרוב המקבילים אצל אנשים בריאים. בנינו גם ביואינפורמטיקה גישה פתוחה כלים לנתח את המידע הבולטים GEP נתונים הקשורים PC בידול. משאבים אלה ניתן ללמוד B האנושי PC בידול, במחקר הנוכחי, חקרנו את הביטוי הכונה של גורמים epigenetic במהלך האנושי B ל- PC בידול.
Introduction
הבידול של תאים B לתאי פלזמה (אישיים) חיוני humoral חסינות ולהגן על המחשב המארח נגד זיהומים1. B ל- PC בידול מזוהה עם שינויים משמעותיים שעתוק קיבולת ואת חילוף החומרים כדי להכיל את הפרשת נוגדנים. גורמי שעתוק השולטים B ל PC בידול נחקרו בהרחבה, חשף רשתות בלעדי כולל שעתוק ספציפיים B או PC גורמים (TFs)2. בתאי B, PAX5, BCL6, BACH2 שר הם השומרים של תא B-זהות-2,-3. אינדוקציה של IRF4, PRDM1 קידוד BLIMP1 ו XBP1 PC TF לכבות את הגנים תא B, זירוז מתואמת מפריש נוגדן תא תוכנית תעתיק3,4,5. שינויים תעתיק מתואם אלה קשורים עם הפעלה שעתוק של גנים Ig יחד עם מתג מהטופס ממברנה מאוגד לטופס המופרש של אימונוגלובולינים שרשרת כבדה2,3, 4. B ל- PC בידול קשורה אינדוקציה של גנים מעורבים רשתית תוך-פלזמית ופונקציות גולג'י בו-זמני עם חלבון פרש התגובה (UPR) הפעלת ידוע לשחק תפקיד מפתח מחשב לפי אדיב הסינתזה של מופרש immunoglobulins6,7. XBP1 TF ממלאת תפקיד מרכזי זה הסתגלות הסלולר8,9,10.
בתאי B מחשבים שחקני המפתח של חסינות humoral בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. הבנת הביולוגי תהליכים פקד זה הייצור והישרדות תאים פלזמה נורמלי הוא קריטי התערבויות טיפוליות צריך להבטיח תגובות חיסוניות יעילה למנוע מחלת חיסון עצמי או חיסוני. PC הם תאים נדיר בשלבים המוקדמים של בידול מתרחש במיקומים אנטומיים ה"בלתי אפיון מלא ביולוגי, במיוחד אצל האדם. שימוש במערכות רב שלבי תרבות, דיווחנו על B במבחנה למודל בידול PC. מודל זה מתרבה התמיינות תאים רציפים של התבגרות המתרחשים באיברים שונים vivo11,12,13. בשלב הראשון, זיכרון B התאים מופעלים קודם במשך ארבעה ימים על ידי שילוב CD40 ליגנד, oligodeoxynucleotides וציטוקינים, להבדיל לתוך preplasmablasts (PrePBs). בשלב השני, preplasmablasts הם המושרה כדי להתמיין plasmablasts (PBs) על-ידי הסרת גירוי CD40L ו oligodeoxynucleotides ושינוי השילוב ציטוקין. בשלב השלישי, plasmablasts הם המושרה להבדיל אל מחשבים אישיים מוקדם על-ידי שינוי ציטוקין שילוב11,12. לצעד הרביעי הוצג להגיע לבגרות מלאה מחשבים על ידי culturing אלה מחשבים מוקדם עם מח עצם סטרומה תאים ממוזגים בינוני או שנבחרו גורמי גדילה13. אלה מחשבים בוגר יכול לשרוד במבחנה מספר חודשים ולא מפרישות כמויות גבוהות של אימונוגלובולינים (איור 1). מעניין, המודל במבחנה שלנו recapitulates את השינויים תעתיק מתואמת ולא על פנוטיפ של B שונים בשלבים PC שניתן ויוו שזוהו11,12,13,14 ,15. מחשבים הם תאים נדיר, מודל בידול במבחנה שלנו מאפשר ללמוד האנושי B ל- PC בידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות בהתאם הצהרת הלסינקי והסכמה של מרכז בית החולים של אוניברסיטת מונפלייה עבור המשאבים הביולוגיים.
1. במודל חוץ גופית רגילה תאים פלזמה בידול
הערה: מחשבים נוצרים עד12,11,תרבות ארבעה שלבים13.
-
תא b הגברה ובידול
- השתמש כדוריות הדם ההיקפיים של מתנדבים בריאים זיכרון תא B טיהור.
- לדלל 7.5 מ של דם עם 24.5 mL RPMI 1640 בינוני.
- להוסיף מ"ל של טמפרטורת החדר צפיפות הצבע (לדוגמה, Ficoll) צינור חרוטי סטרילי 50 מ. בעדינות מכסים את המילוי ההדרגתי של צפיפות 32 מ של דם מדולל. מזער מערבוב שני השלבים.
- צנטריפוגה 20 דקות ב 500 x g עם הבלם חופש. לאסוף את PBMCs מממשק מעבר צבע מדולל פלזמה/צפיפות למקם את התאים בשפופרת סטרילי 50 מ ל, להשלים עד 45 מ"ל עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק.
- Centrifuge את התאים עבור 5 דקות ב 500 x g. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע ולשמור בגדר.
- להוסיף 45 מ של RPMI1640/10% עגל עוברית סרום (FCS), צנטריפוגה 5 דקות ב 500 x g. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע ולשמור בגדר. להוסיף 30 מ של PBS/2% FCS.
-
הסר CD2 + תאים באמצעות אנטי-CD2 beads מגנטי. להוסיף חרוזים 4 עבור תא היעד אחד. דגירה 30 דקות ב 4 º C.
- נפרד חרוז מכורך תאים תאים לא מאוגד באמצעות מגנט ליישום הפרדת תאים. איסוף תאים לא מאוגד, דגירה בגדר תא עם אנטי-CD19 APC ואנטי CD27 PE נוגדנים במשך 15 דקות ב 4 ° C (2 µL של נוגדנים עבור 106 תאים).
- לשטוף פעמיים בנסיוב עזים PBS/10%.
- הסרת מזהמים אירועים על מגרשים FSC והן האס. מגרש ללבישה-FSC-A vs vs FSC-H, האס-A שהאס-H מתווה כדי הסרת לכלוך וכדי לבחור את האוכלוסייה ליקוציט הכולל. בחר תאים זיכרון B CD19/CD27 ו- CD19+CD27+.
- לטהר MBCs באמצעות של סדרן התא עם טוהר 95%.
- בצע את כל השלבים תרבות באמצעות FCS IMDM ו-10%, בתוספת 50 מ"ג/מ"ל האנושי transferrin ו- 5 מ"ג/מ"ל האנושי אינסולין.
-
צלחת מטוהרים MBCs ב 6-ובכן תרבות צלחות (1.5 x 105 MBCs/mL בבאר/5 מ"ל), במשך ארבעה ימים, עם il-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL), ו- IL-15 (10 ng/mL).
- להוסיף Phosphorothioate CpG ODN 2006, מתויג היסטידין רקומביננטי האנושי מסיסים CD40L (sCD40L; 50 ng/mL), mAb אנטי-polyhistidine (5 מ"ג/מ"ל) להפעלה MBCs (איור 1). הפעלה על ידי sCD40L או ODN רק עם הירידה בתשואות באותו קוקטייל ציטוקין הגברה נמוך יותר12. השילוב של אותות ההפעלה המתוארים כאן עופרת למספר המרבי של הפעלת תאי B ו- PrePBs11,12 (איור 1).
- עבור פרופיל ביטוי גנטי, לטהר CD38 /CD20–– PrePBs, ביום 4, שימוש של סדרן התא (איור 2).
-
תא plasmablastic דור
- יום 4, לספור את התאים.
- צלחת בתאים תרבות. ובכן 12 צלחות ב 2.5 x 10 /mL5מ ל 2/היטב.
- זירוז בידול על-ידי הסרה של CpG oligonucleotides ו- sCD40L, תוספת של מדיום תרבות חדשה עם ציטוקין חדש קוקטייל כולל il-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) ו- IL-15 (10 ng/mL) (איור 1). התרבות התאים למשך 3 ימים (יום ד' ליום 7) ב 37 º C.
- עבור פרופיל ביטוי גנטי, לטהר CD38+/CD20– PBs, ביום 7, משתמש סדרן התא (איור 2).
-
דור תאים פלזמה מוקדם
- יום 7, לספור את התאים.
- צלחת בתאים תרבות. ובכן 12 צלחות ב 5 x 105/mL ב 2 מ"ל/טוב.
- להבדיל PB מוקדם במחשבים שימוש בינוני תרבות טריים עם IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL), IFN-α (500 U/mL) במשך 3 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס. עבור פרופיל ביטוי גנטי, לטהר CD20–/CD38+/CD138+ מוקדם במחשבים, ביום 10, שימוש של סדרן התא (איור 2).
-
תאים פלזמה מאריכים דור
- להבדיל מחשבים מוקדם אל מחשבים אישיים חיו זמן רב על-ידי שינוי התנאים תרבות.
- התרבות התאים תרבות. ובכן 12 צלחות ב 5 x 105/mL ב 2 מ"ל/או ב- 24-ובכן תרבות צלחות 1 מ"ל/טוב ב 37 מעלות צלזיוס, באמצעות IL-6 וסטרומה תאים ממוזגים בינוני, אפריל (200 ng/mL).
- לקבל סטרומה תאים ממוזגים בינוני על-ידי culturing תאי סטרומה 5 ימים עם תרבות בינוני. לסנן את סטרומה תרבית תאים supernatant (0.2 µm) ו...
- להוסיף 50% של מדיה סטרומה תאים ממוזגים לתרבויות PC עם חידוש כל שבוע. מחשבים מאריכים שנוצר יכול להימשך חודשים13. ההישרדות לטווח ארוך של מחשבים יכולה להיות מושגת עם IL-6, אפריל בלבד כפי שדווח13.
- הפרשת Ig מידה של cytometry זרימה מיון מחשבים אישיים.
- תרבות מחשבים-106 תאים למ"ל במשך 24 שעות ביממה, למסוק את תגובת שיקוע תרבות. למדוד IgG ואיגה באמצעות האדם מקושר-אנזים immunosorbent assay (אליסה) ערכות11,12,13. הפרשה IgG החציוני נע בין 10 pg/תא/יום-יום 10-17 pg/תא/יום-יום 6013.
2. אטלס מולקולרית של B ל- PC בידול
הערה: בנינו גישה נוחה ופתוחה ושפור כדי לחלץ את המידע הבולטים של Affymetrix GEP נתונים הקשורים PC בידול (GenomicScape)15באופן חזותי. GEP זמינים בפומבי ממסד ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) כולל מטוהרים MBCs, PrePBs, PBs, EPCs: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 ו- E-MEXP-3034 ו- BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape הוא webtool זמינה בחופשיות.
-
מבחר B PC הנתונים (dataset)
- בחר B PC הנתונים (dataset) בתפריט נתונים עיין בכלי GenomicScape גישה פתוחה bioinformatic (http://www.genomicscape.com) המכונים תאים אנושיים B לתאי פלזמה. ויזואליזציה של ג'ין פרופיל ביטוי של גנים ייחודיים או רשימה של גנים זמין באמצעות כלי ביטוי-Coexpression הדוח ב כלי ניתוח הזמינים בדף הבית.
-
ניתוח תחת פיקוח, ניתוח גורמים ראשיים (PCA)
- בחר כלי ניתוח | webSAM כדי לטעון את הכלי סם.
- בחר את ערכת הנתונים תאים אנושיים B לתאי פלזמה ובחר את הקבוצות של דוגמיות להשוואה.
- להשתמש במסננים שונים זמינים להחיל את אפשרויות הסינון של עניין.
- כדי להשוות בין ביטוי גנים פרופילים עם סאם הכלי, לשנות את אפשרויות הסינון כולל קיפול קטן, מספר התמורות, גילוי שקר קצב ואת הסוג של השוואה. GenomicScape לחשב את הניתוח ומספקים גנים ביטוי באופן שונה בין הקבוצות שנבחרו.
- להפעיל ניתוח גורמים ראשיים על-ידי בחירת המנהל רכיב ניתוח בתפריט כלי ניתוח .
- בחר את ערכת הנתונים תאים אנושיים B לתאי פלזמה ובחר את קבוצות עניין.
- הדבק רשימה של הגנים של עניין או בחר הגנים על פי השונות. הדבק רשימה של גנים, בחר Genomicscape כדי לנתח את רשימת גנים/ncRNAs, לחץ כאן. לחשב PCA זה יכול להיות דמיינו והורדת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההליך הכולל של בידול PC רגיל אין ויטרו מיוצג באיור1. באמצעות פרוטוקול המובאת כאן, אנו יכול לייצר כמות מספקת של תאים לא הצליחה עם ex-vivo דגימות אנושי. למרות התפקיד של הרשת מורכבת של גורמי שעתוק מעורב PC בידול נחקר, מנגנוני ויסות רשתות שעתוק של בידול PC מפתח יישארו מוכרים. התמיינות הוא מונע בעיקר על ידי שינויים epigenetic, גנים ברמת השעתוק. באמצעות המודל במבחנה שלנו, את B ל- PC GEP אטלס, חקרנו את השינויים ביטוי הגורמים epigenetic התמיינות תאים פלזמה נורמליים.
פקטור epigenetic ביטוי התמיינות תאים פלזמה נורמליים
אנחנו מגדירים epigenetic גורמים אלה השייכים למשפחות הבאות: דנ א methyltransferases (DNMT), תחום מתיל-CpG מחייב (מבד) חלבונים, היסטון acetyltransferases (כובע), היסטון deacetylases (HDAC), היסטון methyltransferases (HMT), היסטון demethylases (השוכנים) תיאר כאמור עבור סרטן תאים16 (Supplementaryטבלה 1). . חקרנו את epigenetic גורמים לידי ביטוי באופן שונה במהלך PC בידול באמצעות המודל שלנו במבחנה, מטוהרים בוגר מח העצם (BMPCs) ומחשבי באמצעות זמין "B ל- PC אטלס" webtool GenomicScape (איור 2). שימוש מרובה מחלקה סאם ניתוח, מצאנו גנים 71 משמעותית באופן שונה בין MBCs, PrePBs, PBs, בראשית יח BMPCs עם שיעור גילוי שקר < 5% (איור 3A&3B ו Supplementaryבטבלה 2). MBC שלב מאופיין של ביטוי של גנים נגן epigenetic 23 כולל % 39.13 היסטון acetyltransferases (כובעים), % 30.43 צפון היסטון methyltransferases (HMTs), 21.74% היסטון demethylases (HDMTs), 4.35% של מתיל מחייב חלבונים ו 4.35% HDACs (איור 4). 14 שחקנים epigenetic היו overexpressed באופן ספציפי בשלב PrePBs כולל 50% HMTs, 14.28% DNMTs, 21.43% HDACs, 7.14% HDMTs ו- 7.14% כובעים (איור 3). שלב PBs מאופיינת על ביטוי של 5 שחקנים epigenetic עם 2 HDMTS, 2 HMTs, 1 DNMT. 4 שחקנים epigenetic overexpressed מחשבים מוקדם (1 HDAC, הכובע 1, 1 HMT ו- 1 מתיל מחייב חלבון). BMPCs, 10 epigenetic גורמים היו במיוחד overexpressed כולל 50% HMT (Supplementaryבטבלה 2).
השינויים החשובים ביותר בביטוי פקטור epigenetic להתרחש במהלך MBCs המעבר PrePBs עם downregulation של 23 MBCs גנים, קולטנים upregulation של PrePBs 14 epigenetic גנים (איור 4). MBCs overexpressed באופן משמעותי כובעים מעורב שינויים posttranslational של שינויים היסטוניים. Acetylation היסטון משפיע הכרומטין וכתוצאה מכך decondensation של כרומטין והגברת שעתוק של גנים אשר epigenetically מושתקים על-ידי דחיסת כרומטין. MBCs למעבר PrePBs קשורה גם downregulation משמעותית של כובעים, תזוזה בביטוי HMTs והעשרה בביטוי הגנים HDACs ו- DNMTs. מעניין, PrePB שלב גם מאופיין של ביטוי של MMSET HMT. MMSET/WHSC1/NSD2 הוא תחום ערכה המכילה היסטון ליזין methyltransferase יכול di - ו trimethylate היסטון H3-ליזין 36. MMSET מעורב רוברטסונית t(4;14)(p16;q32) הדדיים בקבוצת משנה של מיאלומה נפוצה אשר מזוהה עם פרוגנוזה גרועה. דווח כי MMSET מעורב ב- DNA לתקן המסדיר את תנאי הגיוס של מתילציה H4K20 על שינויים היסטוניים סביב מעברי זוגי גדיל DNA, אשר, בתורו, מקלה על גיוס 53BP117. PrePBs הם מתרבים מאוד בהשוואה ל- MBCs עם 50% של תאים ב- שלב S11 רומז כי השלב PrePBs עשויה להיות משויכת הלחץ replicative גבוהה. ביטוי של MMSET יכול להשתתף במניעה של שכפול מפגינות נזק לדנ א ב- PrePBs.
PB ומחשבים המוקדמות הציג גורם epigenetic דומה הביטוי פרופילים (איור 2). BMPCs מאופיינים של ביטוי מסוים של HMT ושל HDAC הקשורות Ig הפרשת מתח הסתגלות כולל EHMT2 ו- HDAC6. BMPCs בוגר יש את המאפיינים synthetize, מפרישים כמויות גדולות של נוגדנים. זו סינתזה גבוהה של immunoglobulins מזוהה עם דגש הנוצרות על-ידי חלבונים misfolded, התפתחות התגובה (ER) רשתית תוך-פלזמית כדי להכיל את ההפקה הזו. התוצאות שלנו להדגים שינויים ביטוי הגנים העיקריים של epigenetic גורמים שעשויים לשחק תפקיד חשוב במהלך B ל PC בידול באמצעות epigenetic בתיווך אירועים התיכנות.
איור 1 : דגם התמיינות תאים פלזמה במבחנה. המודל בידול PC recapitulates השלבים השונים של דור המחשב האנושי. בשלב הראשון, זיכרון B התאים מופעלים קודם במשך ארבעה ימים על ידי שילוב CD40 ליגנד, oligodeoxynucleotides וציטוקינים, להבדיל לתוך preplasmablasts. בשלב השני, preplasmablasts הם המושרה כדי להתמיין plasmablasts על-ידי הסרת גירוי CD40L ו oligodeoxynucleotides ושינוי השילוב ציטוקין. בשלב השלישי, plasmablasts הם המושרה להבדיל לתאי פלזמה מוקדם על-ידי שינוי ציטוקין שילוב11,12. לצעד הרביעי הוצג להגיע לבגרות מלאה תאים פלזמה culturing אלו תאים פלזמה מוקדם עם מח עצם סטרומה תאים או SC ממוזגים בינוני ואפריל עבור חודשיים13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : מחשב אנושי בידול דגם סימון CD20, CD38 ו- CD138 ביטוי טרום plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs) ושימוש תאים פלזמה (אישיים) המאפשרים טיהור סדרן התא, יצירת פרופיל ביטוי גנטי Affymetrix. GenomicScape webtool מאפשר להמחיש את פרופיל ביטוי של גנים אחד או יותר עניין ב- B לערכת הנתונים בידול PC ולנתח באופן שונה ביטוי גנים בין תא subpopulations. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : מרובה מחלקה סאם ניתוח. האותות הגורמים epigenetic 71 משמעותית באופן שונה הביע במהלך B ל PC בידול (סם ניתוח; רוזוולט < 0.05) בתאי הזיכרון B (MBCs, n = 5), preplasmablasts (PrePBs, n = 5), plasmablasts (PB, n = 5), תאים פלזמה מוקדם (בראשית יח ', n = 5) ותאי פלזמה רגיל מח עצם (BMPCs, n = 5) מוצגים מ נמוך (כחול עמוק) לביטוי (אדום עמוק) גבוהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : אחוז epigenetic גנים השייכים DNMTs, חלבונים מתיל-CpG מחייב תחום (MethylBP), היסטון acetyltransferases (כובע), היסטון deacetylases (HDAC), היסטון methyltransferases (HMT) וקטגוריות היסטון demethylases באופן משמעותי overexpressed MBCs או PrePBBs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים טבלה 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
משלים בטבלה 2: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשפת בני אדם, PC הם תאים נדיר עם בידול שלבים המתרחשים במקומות אנטומיים ה"בלתי אפיון מלא ביולוגי. פיתחנו של B במבחנה למודל בידול PC, שימוש במערכות רב שלבי תרבות שבו שילובים שונים של מולקולות הפעלה, ציטוקינים מוחלות לאחר מכן כדי לשחזר את הבידול תא רציפים המתרחשים איברים/ברקמות שונות vivo11,12,13.
אחרים B במבחנה יעיל למודלים בידול מחשבים היו שדווחה18,19. המודל שפותח על ידי Le Gallou et al. חקר B תלויים תא T כדי בידול PC עם מתודולוגיה תרבות בשני שלבים, החל מ- CD19+/CD27– תמים B תאים. Cocco et al. דיווח על מודל במבחנה כדי ליצור חיים ארוכים מחשבים החל מ- B הכולל תאים19. האסטרטגיה שלנו מחקה את הפעלת ובידול המתרחשים מרכז נבטי ועם CD40 קולטן דמוי אגרה הפעלה מחקה תא T אנטיגן ועזרה הפעלה בשילוב עם ציטוקינים מיוצר על ידי תאים דנדריטים, מקרופאגים, T helper . הפעלה עם sCD40L ו- CpG ODN התשואות לדור של PrePBs אשר זוהו בלוטות הלימפה, שקדים, מח עצם האדם11,20. שלב זה מאופיין על-ידי היעדר סמנים CD20, CD38, CD138, את coexpression של B ו- PC TFs, אבל ברמה מצומצמת בהשוואה בתאי B, PBs, או PC11. שלב זה הוא עניין מיוחד שכן הוא משוייך ההתנגדות מעכבי פרוטאוזום מיאלומה נפוצה בחולים20,21. גם אם מחשבים יכולים להיווצר ללא18,IL-1519, IL-15 תוספת סיפק, בידיים שלנו, תוצאות באופן מיטבי הדור של CD20–CD38++ תאים יום 411,12. תוספת של IL-21 יהיה עניין מיוחד מאז IL-21 מקדמת PC בידול באמצעות אינדוקציה בלון מתווכת על-ידי הפעלת STAT3 כפי שדווחה בעבר19,22. כפי שדווח על ידי. Cocco et al. מתחם תרבות תנאים המכיל IL-21, IFN-α, IL6 ותמיכה סטרומה תאים ממוזגים בינוני הדור של מחשבים חיים ארוכים. דיווחנו כי ההישרדות לטווח ארוך של המחשבים יכול להיות נתמך, במבחנה, באמצעות IL-6, אפריל, בינוני סטרומה תאים ממוזגים או גורמי גדילה שני בלבד. תאי סטרומה לייצר גורמים עיקריים של צמיחה PC, במיוחד IL-6, galectin13,19,23,24,25 ולקיים את האינטראקציות בין hematopoietic התאים, מחשבים26. יתר על כן, אפריל הוא אחד הגורמים המרכזיים צמיחה מעורבת הישרדות מחשבים, מיוצר על ידי תאים hematopoietic27,28. כדי להימנע הטרוגניות הקשורים מקורות שונים של תאי סטרומה, שימשו Resto-6 תאי סטרומה, פיתח, שסופקו על-ידי המעבדה של קארין טארט, בין קטעים 8 ו- 1513,29. Resto-6 תאים אקספרס סמני סטרומה תא CD90, CD73, CD105, ותמיכה ביעילות את הצמיחה של נורמלי וממאירים B תאים29.
עם זאת, הזה מתון יכול להיות שנצפו באחוזים של תאי B מופעל, PrePBs, PBs, מחשבים בהתאם הדם של התורם בריא משמש זיכרון תא B טיהור11,12,13. מחשבים מאריכים שנוצר אי-הביתא של מחשבים, ששרדו והפקת immunoglobulins במבחנה, כמו עמיתו ויוו שלהם13יותר מ-3 חודשים. מחשבים מאריכים אקספרס מאוד CD138 וג'ין ביטוי פרופילים הקשורים ויוו מחשבים13. יתר על כן, יחס גבוה יותר של משולבים כדי unspliced XBP1 יחד עם ביטוי גבוה יותר של גורמי שעתוק IRF4 ו- PRDM1 מחשבים מאופיין מחשבים מאריכים שהושג במבחנה לעומת מחשבים מוקדם לקבלו יום 1013.
הוא חשב epigenetic ושליטה שינויי תעתיק מעברים הסלולר במהלך הפיתוח. אולם, הבידול מסוף של לימפוציטים B לתאי פלזמה היא תהליך ייחודי של מי שינויים epigenetic נשאר ברובו לא ידוע. לפי זה, אנחנו לאחרונה ניתח את miRnome של בידול PC רגיל ולא זיהה הרומן miRNAs מפתח ויסות רשתות משמעות עבור PC רגיל בידול14. הראינו כי מספר miRNAs יכול גם להשתתף לתוך ברגולציה של ביטוי של גורמי שעתוק מפתח במהלך יהלומים, כולל IRF4, PRDM1, ELL2 ו- ARID3A14. לפי זה, אנחנו האריכו כאן אפיון פרופילים ג'ין קשורים epigenetic במהלך B ל PC בידול באמצעות פלטפורמת גישה פתוחה GenomicScape. גישה זו מאפשרת לנו לזהות כרומטין שינוי גנים אנזים במיוחד ביטוי בשלבים שונים של בידול PC. MBCs overexpressed באופן משמעותי כובעים ידוע כגורם nuleosomal שיפוץ שחושף אתרי קישור שעתוק. השינויים post-transcriptional היסטון, כולל היסטון acetylation דווחו באזור יזם שר גדולים תא B כולל30, PAX5, CIITA, SPIB , BCL631. יתר על כן, ניתוח פרוטיאומיה מבנית הדגימו כי CREBBP ו- EP300 (overexpressed ב- MBCs) אינטראקציה עם BCL6, יכול לשחק תפקיד מרכזי בויסות תעתיק BCL632. PAX5, הוצגה גם לווסת את היעד גנים על-ידי גיוס כרומטין ואבו היסטון שינוי חלבונים33. Pax5 הוצגה לזירוז מתילציה H3K4 ו- H3K9 acetylation-היזמים של הגנים שלהם היעד מופעל33.
מרכיב משמעותי epigenetic GEP שינויים אותרו במהלך MBCs המעבר PrePBs עם downregulation הגדולות של כובעים יחד עם עלייה HMTs ביטוי והעשרה של ביטוי גנים HDACs ו- DNMTs. שלב PrePB היא אוכלוסיית תאים מאוד proliferating11. לפי זה, מספר גורמים epigenetic ידוע להיות מעורבת בשליטה התפשטות תאים כולל DNMT134,38 37,36,35,EZH2, MMSET39,40 זוהו, יכול להיות מעורב אינדוקציה הפעלה והתפשטות תאים בשלב PrePB.
בשלב הסיום של B ל PC בידול, BMPCs overexpressed epigenetic גורמים, כולל EHMT2 , HDAC6, ידוע להיות מעורב תגובת המתח בחדר המיון. ER, גולג'י ממלאים תפקיד מרכזי ב- PC כדי להכיל את הסינתזה של Ig המופרש. בתאי סרטן שלפוחית השתן, עיכוב EHMT2 מעוררת מתח בחדר המיון ומשרה אפופטוזיס41. HDAC6 שייך למשפחת 2b מחלקה של HDACs. זה ידוע כדי לשחק תפקיד חלבון הומאוסטזיס, UPR42,43 של מעכבי HDAC6 נבדקים בניסויים קליניים למטרה מחשבים ממאיר ב מיאלומה. הנתונים שלנו תחתון כי גורמים epigenetic עשוי לשחק תפקיד הומאוסטזיס של Ig מאריכים מפריש מחשבים אישיים.
באמצעות וקטורים lentiviral ו/או מעכבי ספציפי, זה יכול להיות מעניין לחקור את התפקיד של מסלולים ביולוגיים אלה כרומטין שינוי אנזימים כרומטין שיפוץ, בידול PC, פונקציות כאמור מתוארת על ידי הקבוצה שלנו 44.
הידע נגזר המחקר הזה יכול ליידע, להורות על אסטרטגיות האבחון והטיפול בהפרעות PC, כמו למשל במקרה של מיאלומה נפוצה, סרטן ללא תרופה סופית אילו פרוגנוזה טובה יותר, שיפור אסטרטגיות טיפוליות יש צורך אנושות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים צרפתית האינקה (Institut סרטן דו לאומית) המכון (PLBIO15-256), ANR (תיקו-דלג) וסרטן ITMO (מ מ & TT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD2 magnetic beads | Invitrogen | 11159D | |
| Anti-CD138-APC | Beckman-Coulter | B49219 | |
| Anti-CD19-APC | BD | 555415 | |
| Anti-CD20-PB | Beckman-Coulter | B49208 | |
| Anti-CD27-PE | BD | 555441 | |
| Anti-CD38-PE | Beckman-Coulter | A07779 | |
| Anti-histidine | R&D Systems | MAB050 | |
| CpG ODN(PT) | Sigma | T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T |
|
| human Transferin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| IFN-α | Merck | Intron A | |
| IMDM | Gibco | 31980-022 | |
| Recombinan Human CD40L-hi | R&D Systems | 2706-CL | |
| Recombinant Human APRIL | R&D Systems | 5860-AP-010 | |
| Recombinant Human IL-10 | R&D Systems | 217-IL- | |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15-10ug | |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL- | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 |
References
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
- Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
- Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
- Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
- Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
- Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
- Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
- Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
- Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
- Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
- Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
- Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
- Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
- Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077 (2015).
- Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).
- Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
- Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
- Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
- Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
- Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
- Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
- Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
- Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
- Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
- Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
- Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
- Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
- McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
- Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
- Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
- Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
- Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877 (2017).
- Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121 (2018).
- Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
- Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
- Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4 (2015).
- Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
- Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
- Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).
