Summary
Använda flera steg kultur system, rapportera vi en in vitro-B-cellen till plasma cell differentiering modell.
Abstract
Plasma celler (st) utsöndrar stora mängder antikroppar och utveckla från B-celler som har aktiverats. Datorer är sällsynta celler i benmärgen eller slemhinna och säkerställa humorala immuniteten. På grund av deras lågfrekventa och läge, studiet av datorer är svårt i mänskliga. Vi rapporterade ett B till PC in vitro-differentiering modell med valda kombinationer av cytokiner och aktivering molekyler som möjligt för att reproducera den sekventiella celldifferentiering inträffar invivo. I denna in vitro-modell, minne B-celler (MBCs) kommer att differentieras till före plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), tidigt datorer och slutligen in i långlivade nära datorer, med en fenotyp sina motsvarigheter hos friska individer. Vi har också byggt en öppen tillgång bioinformatik verktyg för att analysera de mest framträdande informationen från GEP data relaterade till PC differentiering. Dessa resurser kan användas för att studera mänskliga B till PC differentiering och i den aktuella studien, undersökte vi gen uttryck regleringen av epigenetiska faktorer under mänskliga B till PC differentiering.
Introduction
Differentieringen av B-celler till plasmaceller (st) är viktigt för humoral immunitet och skydda värden mot infektioner1. B till PC differentiering är förknippat med stora förändringar i transkription kapacitet och metabolism för att rymma till antikropp sekretion. De transkriptionsfaktorer som styr B till PC differentiering har studerats och avslöjade exklusiva nätverk inklusive B - och PC-specifika transkription faktorer (TFs)2. I B-celler är PAX5, BCL6 och BACH2 TFs väktare av B-cell identitet2,3. Induktion av IRF4, PRDM1 BLIMP1 och XBP1 PC TF-kodning kommer att släcka B cell gener och framkalla en samordnad antikropp-utsöndrar cell transkriptionell program3,4,5. Dessa samordnade transkriptionell förändringar är associerade med Ig gener transkription aktivering tillsammans med en switch från formuläret membran-bundna till formuläret utsöndras av immunglobulin tung kedja2,3, 4. B till PC differentiering är länkad med induktion av gener involverade i endoplasmatiska retiklet och Golgi apparaten fungerar samtidig med ovikta protein svar (UPR) aktiveringen känd för att spela en nyckelroll i PC av tillmötesgående syntesen av utsöndras immunglobuliner6,7. Den TF XBP1 spelar en viktig roll i denna cellulära anpassning8,9,10.
B-celler och datorer är nyckelaktörer av humorala immuniteten. Förstå biologiska processer som styr produktionen och överlevnaden av normala plasma celler är kritisk i terapeutiska interventioner som behöver säkerställa effektivt immunsvar och förhindra autoimmunitet eller immunbrist. PC är sällsynta celler med differentiering tidigt äger rum på anatomiska platser som hindrar fullständig biologisk karakterisering, särskilt i mänskliga. Använda flera steg kultur system, har vi rapporterat en in vitro-B till PC differentiering modell. Denna modell återger den sekventiella celldifferentiering och mognad som förekommer i de olika organ i vivo11,12,13. I ett första steg, minne B celler aktiveras först fyra dagar av CD40 ligand, oligodeoxynucleotides och cytokin kombination och differentieras till preplasmablasts (PrePBs). I ett andra steg förmås preplasmablasts att differentieras till plasmablasts (PBs) genom att ta bort CD40L och oligodeoxynucleotides stimulering och ändra kombinationen cytokin. I ett tredje steg induceras plasmablasts differentieras till tidiga datorer genom att ändra de cytokin kombination11,12. Ett fjärde steg infördes för att få fullt mogen datorer genom att odla dessa tidiga datorer med benmärgens stromaceller luftkonditionerade medium eller valda tillväxtfaktorer13. Dessa mogna datorer kunde överleva flera månader in vitro- och utsöndrar stora mängder immunglobulin (figur 1). Intressant, recapitulates vår in vitro-modell samordnade transkriptionell ändringarna och fenotypen av olika B till PC-stadier som kan vara upptäckta invivo11,12,13,14 ,15. Datorer är sällsynta celler och vår in vitro-differentiering modell gör det möjligt för att studera mänskliga B till PC differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet följer riktlinjer enligt Helsingforsdeklarationen och överenskommelsen av Montpellier universitet sjukhus centrum för biologiska resurser.
1. i Vitro Normal Plasma Cell differentiering modell
Obs: Datorer genereras genom en fyra steg kultur11,12,13.
-
B-cell amplifiering och differentiering
- Använd perifert blod celler från friska frivilliga för minne B cell rening.
- Späd 7,5 mL blod med 24,5 mL RPMI 1640 medium.
- Tillsätt 12,5 mL rumstemperatur täthetlutning (t.ex. Ficoll) till en steril 50 mL koniska tub. Försiktigt overlay täthetlutningen med 32 mL utspädd blod. Minimera blandning av de två faserna.
- Centrifugera 20 min vid 500 x- g med broms. Samla PBMC från gränssnittet utspädda plasma/täthet lutning och placera cellerna i en steril 50 mL tub och slutföra till 45 mL med Hanks balanserad saltlösning.
- Centrifugera cellerna under 5 minuter vid 500 x g. Försiktigt avlägsna supernatanten och hålla pelleten.
- Tillsätt 45 mL RPMI1640/10% fetalt kalvserum (FCS) och centrifugera 5 min vid 500 x g. Försiktigt avlägsna supernatanten och hålla pelleten. Tillsätt 30 mL PBS/2% FCS.
-
Ta bort CD2 + celler med anti-CD2 magnetiska pärlor. Lägga till 4 pärlor för en målcell. Inkubera i 30 minuter vid 4 ° C.
- Separat pärla-bundna celler från obundna celler med en magnet för cell separation ansökan. Samla obundna celler och inkubera cellpelleten med anti CD19 APC och anti CD27 PE antikroppar i 15 minuter vid 4 ° C (2 µL av antikropp för 106 celler).
- Tvätta två gånger i PBS/10% get serum.
- Ta kontaminerande händelser på både FSC och SSC tomter. Rita undertröjor på FSC-A vs FSC-H och SSC-A vs SSC-H tomter att avlägsna skräp och markera den totala leukocyt befolkningen. Välj B minnesceller på CD19/CD27 och CD19+CD27+.
- Rena MBCs använder en cell sorterare med en 95% renhet.
- Utför alla kultur steg med IMDM och 10% FCS, kompletterat med 50 mg/mL mänskliga transferrin och 5 mg/mL humant insulin.
-
Plattan renade MBCs i sex-väl kultur plattor (1,5 x 105 MBCs/mL i 5 mL per brunn), 4 dagar, med IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL), och IL-15 (10 ng/mL).
- Lägg till Phosphorothioate CpG ODN 2006, histidin-taggade rekombinant humant lösliga CD40L (sCD40L; 50 ng/mL) och anti-polyhistidine mAb (5 mg/mL) för MBCs aktivering (figur 1). Aktivering av sCD40L eller ODN endast med den samma cytokin cocktail avkastningen till lägre förstärkning12. Kombinationen av aktiveringen signaler beskrivs här blyad till det maximala antalet aktiverade B-celler och PrePBs11,12 (figur 1).
- För gen uttryck profilering, rena CD38–/CD20– PrePBs, på dag 4, använder en cell sorterare (figur 2).
-
Plasmablastic cell generation
- På dag 4, räkna cellerna.
- Platta celler i 12-väl kultur plattor på 2,5 x 105/ml i 2 mL per brunn.
- Inducerar differentiering genom borttagning av CpG oligonukleotider och sCD40L och tillägg av ett nytt odlingsmedium med en ny cytokin cocktail inklusive IL-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) och IL-15 (10 ng/mL) (figur 1). Kultur celler för 3 dagar (från dag 4 till dag 7) vid 37 ° C.
- För gen uttryck profilering, rena CD38+/CD20– PBs, dag 7, använder en cell sorterare (figur 2).
-
Tidig plasma cell generation
- Dag 7, räkna cellerna.
- Platta celler i 12-väl kultur plattor på 5 x 105/ml i 2 mL/väl.
- Differentiera PB i tidiga datorer genom att använda färskt odlingssubstrat med IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) och IFN-α (500 U/mL) i 3 dagar vid 37 ° C. För gen uttryck profilering, rena CD20–/CD38+/CD138+ tidiga datorer, på dag 10, genom att använda en cell sorterare (figur 2).
-
Långlivat plasma cell generation
- Differentieras tidiga datorer till länge levde datorer genom att ändra villkor som kultur.
- Odla cellerna i 12-väl kultur plattor på 5 x 105/ml i 2 mL/väl eller i 24-väl kultur plattor i 1 mL/väl vid 37 ° C, med hjälp av IL-6 och stromal cell luftkonditionerade medium och APRIL (200 ng/mL).
- Få stromal cell-villkorade medium genom odling stromaceller i 5 dagar med odlingsmedium. Filtrera den stromal cellkulturen supernatant (0,2 µm) och frysa.
- Till 50% av stromal cell-villkorade media PC kulturer med förnyelse varje vecka. Genererade långlivat datorer kunde upprätthållas för månader13. Långsiktig överlevnad av datorer kunde erhållas med IL-6 och APRIL endast som rapporterade13.
- Åtgärd Ig sekretion från flödescytometri sorterade datorer.
- Kultur St på 106 celler/mL för 24 h och skörda kultur supernatanten. Mät IgG och IgA använder mänskliga enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit11,12,13. Median IgG utsöndringen varierade från 10 pg/cell/dag på dag 10 till 17 pg/cell/dag dag 6013.
2. molekylär Atlas b till PC differentiering
Obs: Vi byggde en bekväm och öppen tillgång bioinformatiska verktyg för att extrahera och visualisera den mest framträdande informationen från Affymetrix GEP data relaterade till PC differentiering (GenomicScape)15. GEP är offentligt tillgängliga från ArrayExpress databas (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) inklusive renat MBCs, PrePBs, PBs och EPCs: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 och E-MEXP-3034 och BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape är en fritt tillgänglig webtool.
-
Urval av B till PC datamängd
- Välj B till PC datamängd i menyn Bläddra Data i GenomicScape öppna bioinformatiska verktyg (http://www.genomicscape.com) kallas humant B celler till plasmaceller. Visualisering av gen uttryck profil av unika gen eller en lista över gener finns verktyget Expression-Coexpression rapport i de Analysverktyg som finns på hemsidan.
-
Övervakade analys och principalkomponentanalys (PCA)
- Välj analysverktyg | webSAM att ladda verktyget SAM.
- Välj mänskliga B-celler till plasmaceller datamängden och välja grupperna med prover att jämföra.
- Använd olika filter finns att tillämpa filtreringsalternativ av intresse.
- För att jämföra gen uttryck profiler med SAM-verktyg, ändra filtrering alternativ inklusive Fold change, antalet permutationer, falsk upptäckten hastighet och vilken typ av jämförelse. GenomicScape kommer att beräkna analysen och ge gener differentially uttryckt mellan de markerade grupperna.
- Kör principalkomponentanalys genom att välja Principal Komponentanalys i Verktyg -menyn.
- Välj den mänskliga B-celler till plasmaceller datamängden och välja grupperna med intresse.
- Klistra in en lista av gener av intresse eller Välj gener enligt variansen. Att klistra in en lista av gener, Välj för att analysera en lista över gener/ncRNAs, klicka här... Genomicscape kommer att beräkna PCA som skulle kunna visualiseras och hämtade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det övergripande förfarandet av in vitro-normala PC differentiering är representerade i figur 1. Med hjälp av protokollet som presenteras här, kan vi generera tillräcklig mängd celler som inte kunde erhållas med ex vivo mänskliga prover. Även om rollen av det komplexa nätverket av transkriptionsfaktorer som är inblandade i PC differentiering har undersökts, fortfarande de mekanismer som reglerar viktiga PC differentiering transkription nätverk dåligt kända. Celldifferentiering drivs främst av epigenetiska och transkriptionell förändringar. Använder vår in vitro-modell och B till PC GEP atlas, undersökte vi uttrycket ändringarna av de epigenetiska faktorerna i normal plasma celldifferentiering.
Epigenetiska faktor uttryck i normal plasma celldifferentiering
Vi definierat som epigenetiska faktorer sådana som hör till följande familjer: DNA-metyltransferaser (DNMT), methyl-CpG-bindande domän (MBD) proteiner, Histon acetyltransferaser (HAT), Histon deacetylases (HDAC), Histon metyltransferaser (HMT) och Histon demethylases (HDM) som tidigare beskrivits för cancer celler16 (kompletterandetabell 1). Vi undersökte den epigenetiska faktorer Differentiellt uttryckta under PC differentiering genom vår in vitro-modell, renat mogen benmärgen datorer (BMPCs) och ”B till PC atlas” tillgängliga med den GenomicScape webtool (figur 2). Använda flera klass SAM analys, Vi hittade 71 gener betydligt differentially mellan MBCs, PrePBs, PBs, tidiga datorer och BMPCs med en falsk upptäckten hastighet < 5% (figur 3A&3B och kompletterandetabell 2). MBC Stadium kännetecknas av överuttryck av 23 epigenetiska spelare gener inklusive 39.13% av Histon acetyltransferaser (hattar), 30.43% av Histon metyltransferaser (HMTs), 21,74% av Histon demethylases (HDMTs), 4,35% av metyl-bindande proteiner och 4,35% av HDAC (figur 4). 14 epigenetiska spelare var i ökad utsträckning speciellt skede PrePBs inklusive 50% av HMTs, 14,28% av DNMTs, 21,43% av HDAC, 7.14% av HDMTs och 7.14% av hattar (figur 3). PBs Stadium kännetecknas av överuttryck av 5 epigenetiska spelare med 2 HDMTS, 2 HMTs och 1 DNMT. 4 epigenetiska spelare är i ökad utsträckning hos tidiga datorer (1 HDAC, 1 hatt, 1 HMT och 1 metyl-bindande protein). I BMPCs var 10 epigenetiska faktorer specifikt överuttryckt inklusive 50% av HMT (kompletterandetabell 2).
De viktigaste förändringarna i epigenetiska faktor uttryck inträffa under MBCs att PrePBs övergång med en nedreglering av 23 MBCs gener och uppreglering av 14 PrePBs epigenetiska gener (figur 4). MBCs i signifikant ökad utsträckning hattar inblandade i posttranslationell modifieringar av histoner. Histon acetylering påverkar kromatinstrukturen resulterar i decondensation av kromatin och ökad transkription av gener som är epigenetiskt tystas av kromatin packning. MBCs till PrePBs övergången är också associerat med en betydande nedreglering av hattar, en stor förändring i HMTs uttryck och anrikning i HDAC och DNMTs genuttryck. Intressant, kännetecknas PrePB Stadium också av överuttryck av MMSET HMT. MMSET/WHSC1/NSD2 är en uppsättning domän som innehåller Histon lysin methyltransferase som kan di- och trimethylate Histon H3 på lysin 36. MMSET är involverad i den ömsesidiga t(4;14)(p16;q32) translokationen i en undergrupp av multipelt myelom som är associerat med dålig prognos. Det rapporterades att MMSET är inblandat i DNA-reparation reglera induktion av H4K20 metylering på histoner runt DNA double strand raster, vilket i sin tur underlättar 53BP1 rekrytering17. PrePBs breder mycket jämfört med MBCs med 50% av celler i S fas11 tyder på att PrePBs scenen kunde associeras med en hög replikationsförmåga stress. Överuttryck av MMSET kunde delta i förebyggande av replikering stressinducerade DNA-skador i PrePBs.
PB och tidiga datorer fram liknande epigenetiska faktor uttryck profiler (figur 2). BMPCs karakteriseras av en specifik överuttryck av HMT och HDAC som är relaterade till Ig sekretion stress anpassning inklusive EHMT2 och HDAC6. Mogen BMPCs har egenskapen att syntetisera och utsöndra stora mängder antikroppar. Denna hög syntes av immunglobuliner är associerade med en felveckning protein-inducerad stress och utvecklingen av endoplasmatiska nätverket (ER) svar att rymma denna produktion. Våra resultat visar stora gen uttryck förändringar av epigenetiska faktorer som kan spela en viktig roll under B till PC differentiering genom epigenetiska-medierad omplanering evenemang.
Figur 1 : In vitro-plasma cell differentiering modell. Den PC differentiering modellen sammanfattas de olika stegen i mänskliga PC generation. I ett första steg, minne B celler aktiveras först fyra dagar av CD40 ligand, oligodeoxynucleotides och cytokin kombination och differentieras till preplasmablasts. I ett andra steg induceras preplasmablasts differentieras till plasmablasts genom att ta bort CD40L och oligodeoxynucleotides stimulering och ändra kombinationen cytokin. I ett tredje steg förmås plasmablasts att differentieras till tidig plasma celler genom att ändra de cytokin kombination11,12. Ett fjärde steg infördes för att få fullt mogna plasmaceller genom att odla dessa tidiga plasma celler med benmärgens stromaceller eller SC luftkonditionerade medium och APRIL för två månader13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Differentiering av mänskliga datormodell, som belyser CD20, CD38 och CD138 uttryck i före plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs) och plasma celler (st) att tillåta rening med hjälp av cell sorterare och Affymetrix gen uttryck profilering. GenomicScape webtool tillåter att visualisera uttryck profilen av en eller flera gener av intresse i B till PC differentiering datauppsättning och analysera Differentiellt uttryckta gener mellan cell subpopulations. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Multi-klass SAM analys. Signalerar av de 71 epigenetiska faktorer betydligt Differentiellt uttryckta under B till PC differentiering (SAM analys; FDR < 0,05) i B-minnesceller (MBCs, n = 5), preplasmablasts (PrePBs, n = 5), plasmablasts (PB, n = 5), tidig plasmaceller (tidiga datorer, n = 5) och normal plasma benmärgsceller (BMPCs, n = 5) visas från låg (blå) för hög (djupröd) uttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Andel av epigenetiska gener tillhör DNMTs, methyl-CpG-bindande domän (MethylBP) proteiner, Histon acetyltransferaser (HAT), Histon deacetylases (HDAC), Histon metyltransferaser (HMT) och Histon demethylases kategorier betydligt i ökad utsträckning hos MBCs eller PrePBBs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande tabell 1: Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande tabell 2: Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I mänskliga, PC är sällsynta celler med differentiering arrangerar äger rum i anatomiska platser som hindrar fullständig biologisk karakterisering. Vi har utvecklat en in vitro-B i PC differentiering modell med flera steg kultur system där olika kombinationer av aktiveringen molekyler och cytokiner tillämpas därefter för att reproducera den sekventiella celldifferentiering som förekommer i den olika organ/vävnader i vivo11,12,13.
Andra effektiva in vitro-B St differentiering modeller var rapporterade18,19. Modellen som utvecklats av Le Gallou et al. utforskade T-cells beroende B till PC differentiering med en två-stegs kultur metodik start från CD19+/CD27– naiva B-celler. Cocco et al. rapporterade en in vitro-modell att generera långlivat St start från totala B celler19. Vår strategi härmar aktivering och differentiering förekommer i germinal center med CD40 och Toll-like receptor aktiveringen härma T cell hjälp och antigen aktivering används i kombination med cytokiner produceras av dendritiska celler, makrofager och T helper . Aktivering med sCD40L och CpG ODN avkastningar till generation av PrePBs som har identifierats i lymfkörtlar, tonsill och benmärg i mänskliga11,20. Denna övergångsfas kännetecknas av avsaknad av CD20 och CD38 CD138 markörer och coexpression av PC TFs och B, men på en lägre nivå jämfört med B-celler, PBs, eller PC11. Denna övergångsfas är av särskilt intresse eftersom den är associerad till proteasom-hämmare motstånd i multipelt myelom patienter20,21. Även om datorer kan genereras utan IL-1518,19, IL-15 tillägg enligt, i våra händer, optimerade resultat i generation av CD20–CD38 +++ celler på dag 411,12. Tillägg av IL-21 skulle vara av särskilt intresse eftersom IL-21 främjar PC differentiering genom BLIMP induktion medieras av STAT3 aktivering som tidigare rapporterats19,22. Som rapporterats av Cocco et al. komplexa villkor kultur som innehåller IL-21, IFN-α, IL6 och stromal cell-villkorade medium stöd generering av långlivade datorer. Vi rapporterade att långsiktiga överlevnad av datorer kan stödjas, in vitro med IL-6, APRIL och stromal cell-villkorade medel eller två tillväxtfaktorer endast. Stromaceller producera stora PC tillväxtfaktorer, särskilt IL-6 och galektinbindande13,19,23,24,25 och upprätthålla samverkan mellan hematopoetiska celler och datorer26. APRIL är dessutom en av de viktigaste tillväxt faktorerna inblandade i St överlevnad, producerad av hematopoetiska celler27,28. För att undvika heterogenitet relaterade till olika källor av stromaceller, användes Resto-6 stromaceller, utvecklats och tillhandahålls av Karin Tarte's lab, mellan passager 8 och 1513,29. Resto-6 celler uttrycker CD90, CD73 och CD105 stromal cell markörer och stödja effektivt tillväxten av normala och maligna B celler29.
En måttlig heterogenitet kunde dock observeras i procentandelen av aktiverade B-celler, PrePBs, PBs och datorer beroende på friska donatorns blod används för minne B cell rening11,12,13. Den genererade långlivat datorer icke-cykling datorer, överlevande och producerar immunglobuliner för mer än tre månader in vitro som deras invivo motsvarighet13. Långlivat St uttrycka mycket CD138 och gen uttryck profiler relaterade till i vivo PCs13. Dessutom kännetecknas en högre andel av skarvade till Osplitsat XBP1 tillsammans med högre uttryck för IRF4 och PRDM1 St transkriptionsfaktorer långlivat PCs erhållna in vitro- jämfört med tidiga datorer erhålls vid Dag 1013.
Det är tänkt epigenetiska och transkriptionell förändringar styr cellulära övergångar under utveckling. Den terminal differentieringen av B-lymfocyter till plasmaceller är dock en unik process vars epigenetiska förändringar är fortfarande till stor del okända. Enligt det, vi nyligen analyserat miRnome normala PC differentiering och identifierade roman nyckel MicroRNA reglera nätverk med betydelse för normala PC differentiering14. Vi visade att flera MicroRNA också kunde delta i regleringen av uttrycket av viktiga transkriptionsfaktorer vid PCD, inklusive IRF4, PRDM1, ELL2 och ARID3A14. Enligt att utökat vi här karakterisering av epigenetiska relaterade gen profiler under B till PC differentiering genom GenomicScape öppna plattform. Detta tillvägagångssätt tillät oss att identifiera kromatin ändra enzym gener specifikt uttryckt i olika stadier av PC differentiering. MBCs i signifikant ökad utsträckning hattar känt för att orsaka nuleosomal remodeling som exponerar transkription bindningsställen. Histon post-transcriptional ändringar, inklusive Histon acetylering har rapporterats i promotor regionen stora B-cell TFs inklusive PAX5, CIITA, SPIB och BCL630,31. Dessutom proteomiska analys visat att CREBBP och EP300 (i ökad utsträckning hos MBCs) samverkar med BCL6 och kunde spela en roll i transkriptionell reglering av BCL632. PAX5, visade också att reglera mål genuttryck genom rekrytering av kromatin remodeling och Histon ändra proteiner33. Pax5 visades att inducera H3K4 metylering och H3K9 acetylering på främjare av deras aktiverat objekt gener33.
Epigenetiska huvudfaktor GEP förändringar identifierades under MBCs att PrePBs övergång med en större nedreglering av hattar tillsammans med en ökning av HMTs uttryck och anrikning av HDAC och DNMTs genuttryck. PrePB övergångsfas är en mycket prolifererande cell befolkningen11. Enligt det, flera epigenetiska faktorer som är kända för att vara inblandade i cell spridning kontroll inklusive DNMT134, EZH235,36,37,38 och MMSET39,40 har identifierats och kunde engageras i cell aktivering och spridning induktion under den PrePB fasen.
Skede slutet B till PC differentiering, BMPCs i ökad utsträckning epigenetiska faktorer, inklusive EHMT2 och HDAC6, kända för att vara inblandade i ER stressreaktionen. ER och Golgi apparaturen spela en viktig roll i PC att rymma syntesen av utsöndrade Ig. I urinblåsan cancerceller, EHMT2 hämning stimulerar ER stress och inducerar apoptos41. HDAC6 tillhör familjen klass 2b av HDAC. Det är känt att spela en roll i protein homeostas och de UPR42,43 och HDAC6-hämmare testas i kliniska prövningar att rikta maligna PCs i multipelt myelom. Våra data understryker att epigenetiska faktorer kan spela en roll i homeostas av långlivade Ig utsöndrar datorer.
Använder lentiviral vektorer eller specifika hämmare, kan det vara intressant att undersöka betydelsen av dessa biologiska spridningsvägar och kromatin ändra enzymer i kromatin remodeling, PC differentiering och funktioner som tidigare beskrivits av vår grupp 44.
Den kunskap som härrör från denna forskning kunde informera och instruera om diagnostiska och terapeutiska strategier för PC störningar, såsom vid myelom, en cancer utan en definitiv botemedel för vilka bättre prognos och förbättrade terapeutiska strategier Det krävs kritiskt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från franska INCA (Institut National du Cancer) Institutet (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) och ITMO Cancer (MM & TT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD2 magnetic beads | Invitrogen | 11159D | |
| Anti-CD138-APC | Beckman-Coulter | B49219 | |
| Anti-CD19-APC | BD | 555415 | |
| Anti-CD20-PB | Beckman-Coulter | B49208 | |
| Anti-CD27-PE | BD | 555441 | |
| Anti-CD38-PE | Beckman-Coulter | A07779 | |
| Anti-histidine | R&D Systems | MAB050 | |
| CpG ODN(PT) | Sigma | T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T |
|
| human Transferin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| IFN-α | Merck | Intron A | |
| IMDM | Gibco | 31980-022 | |
| Recombinan Human CD40L-hi | R&D Systems | 2706-CL | |
| Recombinant Human APRIL | R&D Systems | 5860-AP-010 | |
| Recombinant Human IL-10 | R&D Systems | 217-IL- | |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15-10ug | |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL- | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 |
References
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
- Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
- Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
- Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
- Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
- Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
- Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
- Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
- Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
- Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
- Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
- Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
- Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
- Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077 (2015).
- Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).
- Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
- Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
- Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
- Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
- Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
- Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
- Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
- Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
- Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
- Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
- Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
- Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
- McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
- Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
- Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
- Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
- Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877 (2017).
- Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121 (2018).
- Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
- Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
- Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4 (2015).
- Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
- Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
- Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).
