Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Uzun ömürlü plazma hücreleri insan Normal bellek B hücrelerine vitro farklılaştırma modelinde

Published: January 20, 2019 doi: 10.3791/58929
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3
1IGH, CNRS, Univ Montpellier, 2Laboratory for Monitoring Innovative Therapies, Department of Biological Hematology, CHU Montpellier, 3UFR de Médecine, Univ Montpellier

Summary

Çok adımlı kültür sistemleri kullanarak, biz in vitro bir B hücre plazma hücre farklılaşması modeli için rapor.

Abstract

Plazma hücreleri (adet) antikorlar büyük miktarda salgılar ve aktive edilmiş B hücrelerinden geliştirmek. PC'ler kemik iliği veya mukoza bulunan nadir hücrelerdir ve humoral bağışıklık sağlamak. Düşük frekans ve konumu nedeniyle, PC'ler çalışmanın zor olduğunu insan. Biz PC için bir B rapor tüp bebek farklılaşma modeli içinde vivo meydana gelen sıralı hücre farklılaşması çoğaltmak izin sitokinler ve harekete geçirmek molekülleri seçili kombinasyonları kullanarak. Tüp bebek bu modelde, B hücreleri (MBCs) öncesi plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs) erken adet ayırt bellek ve son olarak, uzun ömürlü içine PC'ler, sağlıklı bireyler. kendi muadilleri için bir fenotip ile kapatın Ayrıca bir açık erişim Biyoinformatik GEP verilerin PC farklılaşma ile ilgili en önemli bilgiler analiz araçları inşa. Bu kaynakların insan B PC farklılaşma ve çalışmada çalışma için kullanılabilir, biz epigenetik faktörler gen ifade düzenlemesi sırasında PC farklılaşma için insan B araştırdık.

Introduction

Plazma hücreleri (adet) B hücrelerine farklılaşma humoral bağışıklık için zorunludur ve şirket ana bilgisayar enfeksiyonları1karşı korumak. B PC farklılaşma için transkripsiyon kapasite ve metabolizma antikor salgılanması için karşılamak için önemli değişiklikler ile ilişkilidir. B PC farklılaşma için kontrol transkripsiyon faktörleri kapsamlı bir şekilde inceledik ve B ve PC özel transkripsiyon dahil olmak üzere ortaya özel ağlar faktörler (TFs)2. B hücreleri, PAX5, BCL6 ve BACH2 TFs B hücre kimliği2,3koruyucularıyız. IRF4, BLIMP1 ve XBP1 PC TF kodlama PRDM1 indüksiyon B hücresi genleri söndürmek ve bir eşgüdümlü antikor salgılayan hücre transkripsiyon programı3,4,5teşvik. Koordine bu transkripsiyon değişiklikleri IG genlerin transkripsiyon aktivasyonu ile birlikte salgılanan formun immünglobulin ağır zincir2,3, membran-ilişkili form bir geçiş ile ilişkili 4. PC farklılaşma B'ye indüksiyon genlerin endoplazmik retikulum içinde yer ile bağlantılı ve Golgi aygıtı sentezi accomodating tarafından PC içinde önemli bir rol oynamak için bilinen gelişeceğini protein yanıt (UPR) harekete geçirmek ile eşlik eden işlevleri immünoglobulinler6,7salgılanan. TF XBP1 bu hücresel adaptasyon8,9,10' önemli bir rol oynar.

B hücreleri ve PC'ler humoral bağışıklık anahtar oyuncu var. Biyolojik anlama denetleyen üretim ve normal plazma hücrelerinin yaşaması gereken verimli immün yanıt-e doğru sağlamak ve otoimmünite veya bağışıklık yetersizliği önlemek için tedavi edici müdahalelere kritik işler. PC tam biyolojik karakterizasyonu, özellikle de insan engel anatomik konumlarda yer alan erken farklılaşma aşamaları ile nadir hücreler. Çok adımlı kültür sistemleri kullanarak, PC farklılaşma modeli için bir tüp bebek B bildirdin. Bu model sıralı hücre farklılaşma ve olgunlaşma vivo11,12,13. farklı organlarda meydana gelen üretir İlk adım, bellek B hücreleri dört gün boyunca CD40 ligand, oligodeoxynucleotides ve sitokin kombinasyonuna göre ilk aktif hale gelir ve preplasmablasts (PrePBs) ayırt etmek. İkinci adımda, preplasmablasts plasmablasts (PBs) ayırt etmek için CD40L ve oligodeoxynucleotides dürtme kaldırma ve sitokin kombinasyon değişen indüklenir. Üçüncü adımda, plasmablasts erken adet sitokin birlikte11,12değiştirerek ayırt etmek için indüklenir. Dördüncü adım tam olgun PC'ler bu erken adet kemik iliği stromal hücreler şartına orta ile kültür tarafından almak için kullanılmaya başlanan veya büyüme faktörleri13seçili. Bu olgun PC'ler birkaç ay Tüp Bebek hayatta kalmak ve immünglobulin (Şekil 1) yüksek miktarda salgılar. İlginçtir, tüp bebek modelimiz koordine transkripsiyon değişiklikler ve algılanan içinde vivo11,12,13,14-ebilmek var olmak PC aşamaları için farklı B fenotip tablodur ,15. Adet nadir hücrelerdir ve tüp bebek farklılaşma modelimiz insan B PC farklılaşma için çalışmaya izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokol kuralları Helsinki Bildirgesi ve Montpellier Üniversitesi hastane merkezi Sözleşmesi Biyolojik kaynakların doğrultusunda izler.

1 vitro Normal plazma hücre farklılaşması modeli.

Not: PC'ler bir dört adımlı kültür11,12,13-oluşturulur.

  1. B hücre amplifikasyon ve farklılaşma
    1. Periferik kan hücreleri sağlıklı gönüllülerden bellek B hücre arıtma için kullanın.
    2. Kan 7.5 mL ile RPMI 1640 orta 24.5 mL seyreltik.
    3. Oda sıcaklığında yoğunluk gradient (örneğin, Ficoll) 12.5 mL steril 50 mL konik tüp ekleyin. Yavaşça 32 mL sulandırılmış kan ile yoğunluk gradient overlay. İki aşamasını karıştırma en aza indirmek.
    4. 500 x g de 20 dk kapalı tut ile santrifüj kapasitesi. PBMCs seyreltilmiş plazma/yoğunluk gradient arabiriminden toplamak ve hücreleri bir steril 50 mL tüp içinde yer ve 45 ml Hank'in dengeli tuz solüsyonu ile tamamlayın.
    5. Hücreler için 500 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi. Dikkatle süpernatant kaldırın ve Pelet tutun.
    6. RPMI1640/10% fetal buzağı serum (FCS) ve santrifüj 5 dk 45 mL de 500 x gekleyin. Dikkatle süpernatant kaldırın ve Pelet tutun. PBS/2% FCS 30 mL ekleyin.
    7. Anti-CD2 manyetik boncuklar kullanılarak CD2 + hücre kaldırma. Bir hedef hücre için 4 boncuklu ekleyin. 4 ° C'de 30 dk kuluçkaya
      1. Hücre ayrılık uygulama için bir mıknatıs kullanarak ilişkisiz hücrelerden ayrı boncuk bağlı hücreler. İlişkisiz hücreleri toplamak ve 4 ° c (antikor 106 hücreler için 2 µL) 15 dakika boyunca hücre Pelet CD19 APC anti ve anti CD27 PE antikorlar ile kuluçkaya.
      2. İki kez PBS/10% keçi serum içinde yıkayın.
      3. FSC ve SSC ağır etkileri bulaşıcı olaylar kaldırın. Gömlek FSC-A vs FSC-H ve SSC-A vs SSC-H enkaz kaldırmak için ve toplam lökosit nüfus seçmek için arsalar arsa. CD19/CD27 ve CD19 bellek B hücreleri seçin+CD27+.
      4. Bir hücre sıralayıcısı % 95 saflığı ile kullanarak MBCs arındırmak.
    8. IMDM ve % 10 FCS, 50 mg/mL insan transferrin ve 5 mg/mL insan insülin ile desteklenmiş kullanarak tüm kültür adımları gerçekleştirin.
    9. Plaka saf MBCs altı-şey kültür levha (1.5 x 105 MBCs/mL 5 mL/iyi), 4 gün, IL-2 için (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL) ve IL-15 (10 ng/mL).
      1. Phosphorothioate CpG ODN 2006, rekombinant insan çözünür CD40L histidin öğesini eklemek (sCD40L; 50 ng/mL) ve anti-polyhistidine mAb (5 mg/mL) için MBCs harekete geçirmek (Şekil 1). SCD40L veya ODN harekete geçirmek aynı sitokin kokteyl ile yalnızca alt amplifikasyon12' ye verir. Burada en fazla sayısını Kurşunlu harekete geçirmek sinyalleri açıklanan birleşimi harekete geçirmek B hücreleri ve PrePBs11,12 (Şekil 1).
      2. Gen ifade profil oluşturma için CD38 arındırmak-/CD20- gün 4, bir hücre sıralayıcısı (Şekil 2) kullanarak PrePBs.
  2. Plasmablastic hücre üretimi
    1. Gün 4, hücreleri saymak.
    2. 12-şey kültür plakaları, 2.5 x 2 mL/iyi 105/mL plaka hücrelerde.
    3. KSY oligonucleotides ve sCD40L kaldırılmasını ve yeni sitokin IL-2 de dahil olmak üzere kokteyl ile yeni bir kültür orta ilavesi farklılaşma teşvik (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) ve IL-15 (10 ng/mL) (Şekil 1). Kültür hücreleri 37 ° C'de (4 gün 7 gün) 3 gün için
    4. Gen ifade profil oluşturma için CD38 arındırmak+/CD20- , gün 7, bir hücre sıralayıcısı (Şekil 2) kullanarak PBs.
  3. Erken plazma hücre üretimi
    1. Gün 7, hücreleri saymak.
    2. 12-şey kültür plakaları 5 x 105/mL 2 ml, hücrelerde plaka/iyi.
    3. Erken adet taze kültür orta Il-6 ile kullanarak karton kapak ayırt etmek (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) ve IFN-α (500 U/mL) 37 ° C'de 3 gündür Gen ifade profil oluşturma için CD20 arındırmak-/CD38+/CD138+ gün 10, bir hücre sıralayıcısı (Şekil 2) kullanarak erken adet.
  4. Uzun ömürlü plazma hücre üretimi
    1. Erken adet uzun süreli adet kültür koşulları değiştirerek ayırt etmek.
    2. 12-şey kültür plakaları 5 x 105/mL 2 ml, hücrelerde kültür/iyi veya 24-şey kültür plakaları 1 mL/de 37 ° C'de Il-6 ve stromal hücre kullanarak orta ve Nisan şartına (200 ng/mL).
    3. Stromal hücre şartına orta kültür orta ile 5 gün boyunca stromal hücre kültürü çalışmalarının tarafından elde etmek. Stromal hücre kültürü süpernatant (0.2 µm) filtre uygulama ve Don.
    4. Stromal hücre şartına medya % 50'si her hafta yenileme ile PC kültürleri ekleyin. Oluşturulan uzun ömürlü PC'ler için13ay muhafaza olabilir. Uzun vadede hayatta PC'lerin Il-6 ve Nisan ile bildirilen13elde edilebilir.
    5. Ölçü IG salgı akış sitometresi üzerinden PC'ler sıralanmış.
    6. 106 hücre/mL 24 h ve hasat kültür süpernatant kültür adet. IgG ve IgA insan enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) kitleri11,12,13kullanarak ölçer. Medyan IgG salgı 10 pg/cep/gün gün 10-17 pg/cep/gün gün 6013arasında değişiyordu.

2. moleküler PC farklılaşma B'ye Atlası

Not: Biyoinformatik araçlarını ayıklayın ve PC farklılaşma (GenomicScape)15' e ilgili Affymetrix GEP verilerden en önemli bilgileri görselleştirmek için uygun ve açık erişim yaptık. GEP arıtılmış MBCs, PrePBs, PBs ve EPCs gibi ArrayExpress veritabanından (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) kamuya: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 ve E-MEXP-3034 ve BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape serbestçe kullanılabilir bir webtool olduğunu.

  1. PC veri kümesine b seçimi
    1. B PC veri kümesi Veri Gözat menüsündeki insan B hücreler plazma hücreleriadı verilen GenomicScape açık erişim aracında bioinformatic (http://www.genomicscape.com) seçin. Görselleştirme gen ifade profil benzersiz gen veya gen listesi Analiz araçları ana sayfa kullanılabilir İfade-Coexpression rapor Aracı'nı kullanarak kullanılabilir.
  2. Denetimli Analizi ve asıl bileşen analizi (PCA)
    1. Seçin analiz araçları | webSAM SAM aracı yüklemek için.
    2. İnsan B hücreleri plazma hücrelerine veri kümesi seçin ve örnekleri karşılaştırmak için grupları seçin.
    3. İlgi filtreleme seçenekleri uygulamak kullanılabilir farklı filtreleri kullanın.
    4. Gen ifade profilleri SAM aracı ile karşılaştırmak için kat Değiştir, permütasyon, yanlış bulma oranı ve karşılaştırma türünü de dahil olmak üzere filtreleme seçenekleri değiştirin. GenomicScape analiz hesaplar ve genler differentially Seçili gruplar arasında ifade sağlar.
    5. Asıl bileşen analizi Temel bileşen analizi Analiz araçları menüsünden seçerek çalıştırın.
    6. İnsan B hücreleri plazma hücrelerine veri kümesi seçin ve ilgi grupları seçin.
    7. Genler ilgi veya select genler göre varyans listesini yapıştırın. Genlerin liste Yapıştır, genler/ncRNA'lar, listesi analiz için buraya tıklayınız... Genomicscape seçmek için görüntülenir ve indirilen PCA hesaplar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tüp Bebek normal PC farklılaşma genel yordamı Şekil 1' de temsil edilir. Burada sunulan iletişim kuralını kullanarak, yeterli miktar ile ex vivo insan örnekleri elde edilemedi hücre oluşturabilir. Transkripsiyon faktörleri PC farklılaşma ilgili karmaşık ağın rolünü araştırıldı rağmen anahtar PC farklılaşma transkripsiyon ağlar düzenleyen mekanizmalar kötü bilinen kalır. Hücresel başkalaşım çoğunlukla epigenetik ve transkripsiyon değişiklikleri tarafından tahrik edilmektedir. Tüp bebek modelimiz ve PC GEP atlas B kullanarak, biz ifade değişiklikler normal plazma hücre ayrımında epigenetik faktörlerin araştırdık.

Normal plazma hücre farklılaşması ifadede epigenetik faktörü
Biz aşağıdaki ailelerine ait olanlar epigenetik faktörler tanımlanır: DNA methyltransferases (DNMT), metil-KSY-bağlayıcı etki (MBD) proteinler, histon acetyltransferases (şapka), histon uyku (HDAC), histon methyltransferases (HMT) ve histon demethylases (HDM)16 (ekTablo 1) kanser hücreleri için daha önce açıklandığı gibi. Biz epigenetik araştırdık differentially saf bizim tüp bebek modeli kullanarak PC farklılaşma sırasında ifade edilen faktörler olgun kemik iliği PC'ler (BMPCs) ve "B PC atlas için" kullanılabilir kullanarak GenomicScape webtool (Şekil 2). Çok sınıf SAM çözümlemesi kullanarak, 71 genler önemli ölçüde differentially MBCs, PrePBs, PBs, erken adet ve BMPCs arasında bir yanlış keşif oranla bulduk < %5 (Şekil 3&3B vebir ekTablo 2). MBC sahne dahil histon acetyltransferases (şapka) %39.13, %30.43 histon methyltransferases (HMTs), histon demethylases (HDMTs) %21.74, metil proteinler %4,35 23 epigenetik oyuncu genlerin overexpression tarafından karakterize ve %4,35 HDACs (Şekil 4). 14 epigenetik oyuncu özellikle HMTs % 50'si, %14,28 DNMTs, HDACs %21.43, HDMTs % 7,14 ve şapka (Şekil 3) yüzde 7.14 gibi PrePBs aşamada overexpressed. PBs sahne 5 epigenetik oyuncu 2 HDMTS, 2 HMTs ve 1 DNMT overexpression tarafından ayırt edilir. 4 epigenetik oyuncu erken adet (1 HDAC, 1 şapka, 1 HMT ve 1 metil bağlayıcı protein) overexpressed. BMPCs içinde epigenetik faktörler %10 50'sini HMT (ekTablo 2) de dahil olmak üzere özel olarak overexpressed.

Epigenetik faktör ifade en önemli değişiklikler sırasında MBCs PrePBs 23 MBCs genler ve geçiş upregulation 14 PrePBs epigenetik gen (Şekil 4) için bir downregülasyon ile gerçekleşir. MBCs önemli ölçüde şapka histon ardından değişiklikler dahil overexpressed. Histon asetilasyon kromatin decondensation ortaya çıkan ve epigenetically kromatin sıkıştırma tarafından susturulması genlerin transkripsiyon artan kromatin yapısı etkiler. MBCs PrePBs geçiş için de önemli bir downregülasyon şapkalar, HMTs ifade büyük bir kayma ve HDACs ve DNMTs gen ekspresyonu zenginleştirme ile ilişkili. İlginçtir, PrePB sahne MMSET HMT overexpression ile karakterizedir. MMSET/WHSC1/NSD2 di - ve trimethylate histon H3, lizin 36 olabilir histon lizin metiltransferaz içeren bir küme etki alanıdır. MMSET multipl miyelom kötü prognoz ile ilişkili olan karşılıklı t(4;14)(p16;q32) translocation bir alt grubu olarak ilgilenmektedir. Bu MMSET ilgili rapor edildi üzerinde DNA çift kişilik kırılmalara çevresinde histon metilasyonu H4K20 indüksiyon düzenleyen DNA tamiri hangi, sırayla, 53BP1 işe alım17kolaylaştırır. PrePBs son derece PrePBs sahne yüksek ikileştirici stres ile ilişkili olabilir öne S faz11 hücrelerde % 50'si ile MBCs ile karşılaştırıldığında Proliferasyona. MMSET overexpression çoğaltma stres kaynaklı DNA hasarına PrePBs önlenmesinde katılabilecek.

PB ve erken adet benzer epigenetik faktör ifade profilleri (Şekil 2) sundu. BMPCs belirli bir overexpression HMT ve IG salgı stres adaptasyon EHMT2 ve HDAC6de dahil olmak üzere ilgili HDAC karakterizedir. Olgun BMPCs özelliği synthetize için var ve büyük miktarda antikor salgılar. Bu yüksek sentez immünglobulin misfolded protein kaynaklı stres ve endoplazmik retikulum (ER) yanıt-e doğru bu üretim karşılamak gelişimi ile ilişkilidir. Sonuçlarımız için PC farklılaşma programlama olaylar epigenetik aracılı ile B sırasında önemli bir rol oynayabilir epigenetik faktörlerin önemli gen ifade yapılan değişiklikleri göstermektedir.

Figure 1
Resim 1 : In vitro plazma hücre farklılaşması modeli. PC farklılaşma modeli insan PC üretimi çeşitli adımlar beyannamedir. İlk adım, bellek B hücreleri dört gün boyunca CD40 ligand, oligodeoxynucleotides ve sitokin kombinasyonuna göre ilk aktif hale gelir ve preplasmablasts ayırt etmek. İkinci adımda preplasmablasts plasmablasts CD40L ve oligodeoxynucleotides dürtme kaldırma ve sitokin kombinasyon değişen ayırt etmek için indüklenir. Üçüncü adımda, plasmablasts sitokin birlikte11,12değiştirerek erken plazma hücrelerine ayırt etmek için indüklenir. Dördüncü adım iki ay13için erken bu plazma hücreleri kemik iliği stromal hücreler veya SC şartına orta ve Nisan kültür tarafından tam olgun plazma hücreleri almak için kullanılmaya başlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : İnsan PC farklılaşma modeli ön plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs) CD20, CD38 ve CD138 ifade vurgulayarak ve plazma hücreleri (adet) arıtma izin kullanarak hücre sıralayıcısı ve Affymetrix gen ifade profilleme. GenomicScape webtool B ilgi PC farklılaşma veri kümesi için bir veya birden çok gen ifade profil görselleştirmek ve hücre altgrupları arasında differentially ifade gen analiz için izin verir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Çok sınıf SAM çözümlemesi. Sinyalleri 71 epigenetik faktörlerin önemli ölçüde differentially ifade B sırasında PC farklılaşma (SAM Analizi; FDR < 0,05) bellek B hücreleri (MBCs, n = 5), preplasmablasts (PrePBs, n = 5), plasmablasts (PB, n = 5), erken plazma hücreleri (erken adet, n = 5) ve normal kemik iliği plazma hücreleri (BMPCs, n = 5) düşük (koyu mavi) için yüksek (derin kırmızı) ifadesi görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 4
Şekil 4 : Yüzde DNMTs, metil-KSY-bağlayıcı etki (MethylBP) proteinler, histon acetyltransferases (şapka), histon uyku (HDAC), histon methyltransferases (HMT) ve histon demethylases Kategoriler önemli ölçüde ait epigenetik gen MBCs veya PrePBBs overexpressed. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 1: Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 2: Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İnsanda, PC hücreler nadir farklılaşma kademeli tam biyolojik karakterizasyonu engel anatomik yerlerde yer alıyor. Bir tüp bebek B nerede harekete geçirmek molekülleri ve sitokinler çeşitli birleşimleri ardından gerçekleşen sıralı hücre farklılaşması çoğaltmak için uygulanan multi-step kültür sistemleri kullanarak PC farklılaşma modeli için geliştirdiğimiz farklı organlar/dokularda vivo11,12,13.

Diğer verimli tüp bebek B adet farklılaşma modelleri için bildirilen18,19idi. Model Le Gallou tarafından geliştirilen vd CD19 başlayan bir iki adım kültür metodolojisi ile PC farklılaşma T-hücre bağımlı B keşfedilmeyi+/CD27- naif B hücreleri. Cocco vd uzun ömürlü adet toplam B hücreleri19başlayan oluşturmak için bir tüp bebek modeli bildirdi. Bizim strateji harekete geçirmek ve germinal Merkez CD40 ve Toll benzeri reseptör ile meydana gelen başkalaşım taklit eden sitokinler ile birlikte kullanılan T hücre yardım ve antijen aktivasyon taklit eden harekete geçirmek dendritik hücreler, makrofajlar ve T yardımcı tarafından üretilen . Lenf düğümleri, bademcik ve kemik iliği insan11,20saptanmıştır PrePBs nesil için harekete geçirmek ile sCD40L ve CpG ODN verir. Bu geçiş aşamasında CD20, CD38 ve CD138 işaretleri ve coexpression B ve PC TFs ama PBs, B hücreleri ile karşılaştırıldığında düşük düzeyde yokluğu ile karakterize ya da PC11. Multipl miyelom hasta20,21proteasome inhibitörü direniş için ilişkili olduğundan bu geçiş aşamasında belirli vade farkı olur. Adet IL-1518,19oluşturulabilir bile, IL-15 ek olarak, bizim ellerimizde sağlanan sonuçları CD20 üretimi optimize-CD38++ hücreleri 4 gün11,12. Ayrıca IL-21 IL-21 PC farklılaşma yanında STAT3 harekete geçirmek daha önce raporlanmış19,22olarak aracılı keşif balonu indüksiyon yoluyla teşvik özel ilgi olacaktır. Olarak Cocco vd tarafından karmaşık rapor kültür içeren IL-21, IFN-α, IL6 ve stromal hücre şartına Orta destek uzun ömürlü PC'ler nesil koşulları. Adet uzun vadeli yaşama olabileceğini desteklenen, tüp bebek, IL-6, Nisan ve stromal hücre şartına orta veya yalnızca iki büyüme faktörleri kullanarak bildirdi. Stromal hücreler büyük PC büyüme faktörleri, özellikle Il-6 ve galectin13,19,23,24,25 üretmek ve hematopoetik arasındaki etkileşimler sürdürmek hücreleri ve PC'ler26. Ayrıca, Nisan önemli büyüme faktörler hematopoetik hücrelerin27,28tarafından üretilen PC'ler hayatta katılan biridir. Stromal hücreler farklı kaynaklar için ilgili heterojenite önlemek için geliştirilen ve Karin Tarte'nın lab tarafından sağlanan Resto-6 stromal hücreler, pasajlar 8 ve 1513,29arasında kullanıldı. Resto-6 hücre CD90, CD73 ve CD105 stromal hücre işaretleri hızlı ve verimli bir şekilde normal ve malign B hücreleri29gelişimini desteklemek.

Ancak, bir orta heterojenite aktif B hücreleri, PrePBs, PBs ve sağlıklı donör kanı B hücre arıtma11,12,13bellek için kullanılan bağlı olarak adet yüzdesi olarak görülmektedir. Oluşturulan uzun ömürlü adet sigara-hayatta kalan ve üç aydan fazla in vitro kendi içinde vivo muadili13immünglobulin üreten PC'ler, Bisiklet vardır. Uzun ömürlü adet CD138 gen ifade profilleri içinde vivo ile ilgili adet ve13son derece hızlı. Ayrıca, IRF4 ve PRDM1 adet transkripsiyon faktörlerin daha yüksek ifadesi ile birlikte spliced unspliced için XBP1 daha yüksek bir oranı elde edilen vitro erken PC'ler için karşılaştırıldığında, elde edilen uzun ömürlü PC'ler ile karakterize 10. gün13.

Epigenetik düşünülmektedir ve transkripsiyon değişiklikleri hücresel geçişler geliştirme sırasında kontrol. Ancak, plazma hücreleri B lenfosit farklılaşması terminal kimin epigenetik değişiklikler büyük ölçüde bilinmeyen kalır benzersiz bir süreçtir. Göre biz son zamanlarda normal PC farklılaşma miRnome analiz ve ağlar normal PC farklılaşma14için önemi düzenleyen roman anahtar miRNAs teşhis etti. Biz birkaç miRNAs da anahtar transkripsiyon faktörleri ifade sırasında PCD, IRF4, PRDM1, ELL2 ve ARID3A14dahil olmak üzere düzenlenmesi içine katılmak gösterdi. Göre biz burada GenomicScape açık erişim platformu kullanarak PC farklılaşma için B sırasında ilişkili epigenetik gen profilleri karakterizasyonu genişletilmiş. Bu yaklaşım özellikle PC farklılaşma farklı aşamalarında ifade enzim genler değiştirerek kromatin tanımlamak izin verdi. MBCs önemli ölçüde nuleosomal, transkripsiyon bağlayıcı siteleri ortaya çıkaran remodeling neden olduğu bilinen şapka overexpressed. Histon asetilasyon dahil olmak üzere histon çoğu değişiklik PAX5, CIITA, SPIB ve BCL630,31dahil olmak üzere büyük B hücreli TFs organizatörü bölgede bildirilmiştir. Ayrıca, proteomik analiz CREBBP ve EP300 (MBCs içinde overexpressed) BCL6 ile etkileşim içinde olduğunu gösterdi ve BCL632transkripsiyon Yönetmelikte bir rol oynayabilir. PAX5, aynı zamanda hedef gen ekspresyonu kromatin remodeling ve histon proteinleri33değiştirme işe düzenleyen gösterildi. Pax5 H3K4 metilasyonu ve H3K9 asetilasyon ve onların harekete geçirmek hedef genlerin33, ikna etmek için gösterildi.

Önemli epigenetik faktör GEP değişiklikleri sırasında MBCs şapkalar PrePBs geçiş HMTs ifade ve HDACs ve DNMTs gen ekspresyonu zenginlik artışı ile birlikte-büyük bir downregülasyon ile tespit edilmiştir. Geçiş PrePB sahne son derece Proliferasyona hücre nüfus11yaşında. Ki göre bilinen DNMT134, EZH235,36,37,38 ve MMSET39,40 hücre çoğalması için kontrol Fuarı dahil olmak üzere çeşitli epigenetik faktörler tespit edilmiştir ve hücre harekete geçirmek ve nükleer silahların yayılmasına karşı indüksiyon PrePB aşamasında dahil olabilir.

Son aşamada B için PC farklılaşma, BMPCs EHMT2 ve HDAC6ER stres yanıt olarak dahil olduğu bilinen, epigenetik etmenler, overexpressed. ER ve Golgi aygıtı PC salgılanan IG sentezi karşılamak için önemli bir rol oynamaktadır. Mesane kanseri hücrelerinde EHMT2 inhibisyonu ER stres uyarır ve Apoptozis41neden olmaktadır. HDAC6 HDACs sınıf 2b ailesine ait. Protein homeostazı bir rol oynamaya bilindiği ve UPR42,43 ve HDAC6 inhibitörleri çoklu miyelomayla malign PC'ler hedeflemek için klinik çalışmalarda test edilir. Epigenetik faktörler PC'ler salgılayan uzun ömürlü IG homeostazı bir rol oynamak bizim veri alt çizgi.

Lentiviral vektörel çizimler ve/veya belirli inhibitörleri kullanarak, bu biyolojik yollar ve enzimler, kromatin remodeling, PC farklılaşma ve daha önce bizim grup tarafından açıklandığı gibi işlevler değiştirme kromatin rolünü araştırmak ilginç olabilir 44.

Bu araştırma elde edilen bilgi bilgilendirmek ve PC bozuklukları, tanı ve tedavi stratejileri gibi multipl miyelom söz konusu olduğunda, bir kanser hangi daha iyi prognoz ve geliştirilmiş tedavi stratejileri için kesin bir tedavi olmadan talimat eleştirel ihtiyaç vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa yoktur

Acknowledgments

Bu eser Fransız Inca (Institut National du kanser) gelen hibe tarafından desteklenmiştir Enstitüsü (PLBIO15-256), ANR (Tie-atla) ve ITMO kanser (MM ve TT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-CD2 magnetic beads Invitrogen 11159D
Anti-CD138-APC Beckman-Coulter  B49219
Anti-CD19-APC BD 555415
Anti-CD20-PB Beckman-Coulter  B49208
Anti-CD27-PE BD 555441
Anti-CD38-PE Beckman-Coulter  A07779
Anti-histidine R&D Systems MAB050
CpG ODN(PT) Sigma T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human Transferin Sigma-Aldrich T3309
IFN-α Merck Intron A
IMDM Gibco 31980-022
Recombinan Human CD40L-hi R&D Systems 2706-CL
Recombinant Human APRIL R&D Systems 5860-AP-010
Recombinant Human IL-10 R&D Systems 217-IL-
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-
Recombinant Human IL-6 Peprotech 200-06

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
  2. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
  3. Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
  4. Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
  5. Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
  6. Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
  7. Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
  8. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  9. Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
  10. Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
  11. Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
  12. Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
  13. Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
  14. Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
  15. Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077 (2015).
  16. Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).
  17. Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
  18. Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
  19. Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
  20. Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
  21. Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
  22. Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
  23. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
  24. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
  25. Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
  26. Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
  27. Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
  28. Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
  29. Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
  30. Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
  31. Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
  32. Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
  33. McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
  34. Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
  35. Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
  36. Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
  37. Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877 (2017).
  38. Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121 (2018).
  39. Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
  40. Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
  41. Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4 (2015).
  42. Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
  43. Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
  44. Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı 143,
Uzun ömürlü plazma hücreleri insan Normal bellek B hücrelerine vitro farklılaştırma modelinde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jourdan, M., de Boussac, H.,… More

Jourdan, M., de Boussac, H., Viziteu, E., Kassambara, A., Moreaux, J. In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells. J. Vis. Exp. (143), e58929, doi:10.3791/58929 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter