استخدام المصفوفات الدقيقة لاستجواب الأثر البيئي الدقيق على الأنماط الظاهرية الخلوية في السرطان
Summary
الغرض من الطريقة المعروضة هنا هو إظهار كيف يمكن تصنيع النُفَج ّة الدقيقة للبيئة الدقيقة (MEMA) واستخدامها لاستجواب تأثير آلاف البيئات الدقيقة المؤتلفة البسيطة على النمط الظاهري للخلايا المستزرعة.
Abstract
فهم تأثير البيئة الدقيقة على النمط الظاهري للخلايا مشكلة صعبة بسبب الخليط المعقد من كل من عوامل النمو القابلة للذوبان والبروتينات المرتبطة بالمصفوفة في البيئة الدقيقة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن الكواشف المتاحة بسهولة لنمذجة البيئات الدقيقة في المختبر تستخدم عادة خليطا معقدا من البروتينات التي يتم تعريفها بشكل غير كامل وتعاني من تقلب الدفعة إلى الدفعية. تسمح منصة microarray microenvironment (MEMA) بتقييم الآلاف من التركيبات البسيطة من بروتينات البيئة الدقيقة لتأثيرها على الأنماط الظاهرية الخلوية في اختبار واحد. يتم إعداد MEMAs في لوحات جيدا، والذي يسمح بإضافة الأربطة الفردية لفصل الآبار التي تحتوي على مصفوفة مصفوفة مصفوفة مصفوفة مصفوفة (ECM) البروتينات. مزيج من الرباط القابلة للذوبان مع كل ECM المطبوعة تشكل مزيجا فريدا من نوعه. يحتوي اختبار MEMA النموذجي على أكثر من 2500 بيئة صغيرة مؤتلفة فريدة من نوعها تتعرض لها الخلايا في اختبار واحد. كحالة اختبار، تم طلاء خط خلايا سرطان الثدي MCF7 على منصة MEMA. وقد حدد تحليل هذا التحليل العوامل التي تعزز وتعوق نمو وانتشار هذه الخلايا. منصة MEMA مرنة للغاية ويمكن تمديدها للاستخدام مع المسائل البيولوجية الأخرى خارج أبحاث السرطان.
Introduction
يبقى زراعة خطوط الخلايا السرطانية على البلاستيك في الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) واحدة من خيول العمل الرئيسية للباحثين عن السرطان. ومع ذلك، يتم الاعتراف بشكل متزايد البيئة الدقيقة لقدرتها على التأثير على الأنماط الظاهرية الخلوية. في السرطان، ومن المعروف أن البيئة الدقيقة الورم تؤثر على السلوكيات الخلوية متعددة، بما في ذلك النمو، والبقاء على قيد الحياة، والغزو، والاستجابة للعلاج1،2. عادة ما تفتقر ثقافات الخلايا أحادية الطبقة التقليدية إلى تأثيرات البيئة الدقيقة، مما أدى إلى تطوير تجارب ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) أكثر تعقيداً لزراعة الخلايا، بما في ذلك مستخلصات غشاء الطابق السفلي النقي المتاحة تجارياً. ومع ذلك، فإن هذه المصفوفات النقية عادة ما تكون معقدة للاستخدام وتعاني من مشاكل تقنية مثل تقلب الدفعة3 والتركيبات المعقدة3. ونتيجة لذلك، قد يكون من الصعب تعيين وظيفة لبروتينات محددة قد تؤثر على الأنماط الظاهرية الخلوية3.
لمعالجة هذه القيود، قمنا بتطوير تقنية microarray microenvironment (MEMA)، مما يقلل من البيئة الدقيقة وصولا ً إلى تركيبات بسيطة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) وبروتينات عامل النمو القابلة للذوبان4،5 . منصة MEMA تمكن من تحديد العوامل البيئية الصغرية المهيمنة التي تؤثر على سلوك الخلايا. باستخدام تنسيق صفيف، يمكن وضع حد لآلاف المجموعات من عوامل البيئة الدقيقة في تجربة واحدة. ال [مّا] يوصف هنا يستجوب ~2,500 مختلفة فريدة [ميكروفيول] شروط. البروتينات ECM المطبوعة في لوحات جيدا تشكل منصات النمو التي يمكن أن تكون المستزرعة الخلايا. يتم إضافة الأربطة القابلة للذوبان إلى الآبار الفردية، مما يخلق بيئات صغيرة مؤتلفة فريدة من نوعها (ECM + ligand) على كل بقعة مختلفة تتعرض لها الخلايا. يتم زراعة الخلايا لعدة أيام، ثم ثابتة، ملطخة، وصورة لتقييم الأنماط الظاهرية الخلوية نتيجة للتعرض لهذه تركيبات البيئة الدقيقة المحددة. وبما أن البيئات الدقيقة هي تركيبات بسيطة، فمن السهل تحديد البروتينات التي تدفع التغيرات الفينوتية الرئيسية في الخلايا. وقد استخدمت MEMAs بنجاح لتحديد العوامل التي تؤثر على الأنماط الظاهرية الخلويةالمتعددة، بما في ذلك تلك التي تدفع قرارات مصير الخلية والاستجابة للعلاج 4،5،6،7. ويمكن التحقق من صحة هذه الاستجابات في تجارب بسيطة 2D ومن ثم يمكن تقييمها في ظل ظروف أن يلخص بشكل أكمل تعقيد البيئة الدقيقة الورم. منصة MEMA قابلة للتكيف إلى حد كبير مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ونقاط النهاية، شريطة أن تتوفر علامات حيوية فينوتيبيك جيدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
كانت أهمية “الأبعاد” والسياق عاملاً محفزاً في تطوير أنظمة الثقافة المختبرية كأدوات في توصيف الخلايا السرطانية من خلال تفاعلها مع البيئة الدقيقة11،وقدرة المختبر نظم الثقافة لتقليد البيئة في الجسم الحي هو القوة الدافعة وراء السعي لتحسين تلك النظم الثقافية. في النظم المختبرية،…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مكتبة الصندوق المشترك للشبكات (LINCS) منحة HG008100 (J.W.G., L.M.H., وJ.E.K).
Materials
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
- Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
- Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
- Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , (2013).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a “normal” cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
- Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
- Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
- Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
