Summary
여기에 제시된 방법의 목적은 미세 환경 마이크로어레이(MEMA)가 배양된 세포의 표현형에 대한 수천 개의 간단한 조합 미세 환경의 영향을 심문하기 위해 제조되고 사용될 수 있는 방법을 보여주는 것입니다.
Abstract
미세 환경이 세포의 표현형에 미치는 영향을 이해하는 것은 생체 내 미세 환경에서 수용성 성장 인자와 매트릭스 관련 단백질의 복잡한 혼합물로 인해 어려운 문제입니다. 또한, 시험관 내 미세 환경의 모델링을 위해 쉽게 사용할 수 있는 시약은 일반적으로 불완전하게 정의되고 배치 가변성으로 고통받는 단백질의 복잡한 혼합물을 이용합니다. 미세 환경 마이크로어레이(MEMA) 플랫폼은 단일 분석에서 세포 표현형에 미치는 영향에 대해 수천 가지의 미세 환경 단백질 조합을 평가할 수 있습니다. MEMA는 배열된 세포외 매트릭스(ECM) 단백질을 포함하는 우물을 분리하기 위해 개별 리간드를 첨가할 수 있는 웰 플레이트에 제조됩니다. 각 인쇄 된 ECM과 수용성 리간드의 조합은 독특한 조합을 형성한다. 전형적인 MEMA 분석은 세포가 단 하나 분석에서 드러내는 2,500의 유일한 조합 마이크로환경을 포함합니다. 시험 사례로서, 유방암 세포주 MCF7은 MEMA 플랫폼에서 도금되었다. 이 분석법의 분석은 이 세포의 성장 그리고 증식을 강화하고 억제하는 둘 다 인자를 확인했습니다. MEMA 플랫폼은 매우 유연하며 암 연구 를 넘어 다른 생물학적 질문과 함께 사용하기 위해 확장 될 수 있습니다.
Introduction
2차원(2D) 단층에서 플라스틱에 암 세포주를 배양하는 것은 암 연구자들의 주요 주력 중 하나입니다. 그러나, 미세 환경은 점점 세포 표현형에 영향을 미치는 그것의 기능에 대 한 인식 되 고. 암에서, 종양 미세환경은 성장, 생존, 침습 및치료요법에대한 반응 1,2를포함하는 다중 세포 행동에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 전통적인 단층 세포 배양은 전형적으로 미세 환경 영향이 결여되어, 이는 시판되는 정제된 지하 막 추출물을 포함하여 세포를 성장시키기 위해 보다 복잡한 3차원(3D) 어설법의 발달을 주도하고 있다. 그러나, 이러한 정제된 행렬은 전형적으로 사용하기가 복잡하고 배치 가변성3 및 복잡한 조성물3과같은 기술적 문제로 고통받고 있다. 그 결과, 세포 표현형 3에 영향을 미칠 수 있는 특정 단백질에기능을 할당하는 것은 어려울 수 있습니다.
이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 세포 외 매트릭스 (ECM) 및 수용성 성장 인자 단백질4,5의 간단한 조합으로 미세 환경을 감소시키는 미세 환경 마이크로 어레이 (MEMA) 기술을 개발했습니다. . MEMA 플랫폼은 세포의 거동에 영향을 미치는 지배적인 미세 환경 요인을 식별할 수 있게 합니다. 배열 형식을 사용하면 단일 실험에서 수천 개의 미세 환경 요인 조합을 분석할 수 있습니다. 여기에 기술된 MEMA는 ~ 2,500개의 상이한 독특한 미세 환경 조건을 심문합니다. 잘 판에 인쇄된 ECM 단백질은 세포가 배양될 수 있는 성장 패드를 형성합니다. 수용성 리간드가 개별 우물에 첨가되어 세포가 노출되는 각 다른 지점에 고유한 조합 미세 환경(ECM + 리간드)을 생성합니다. 세포는 이러한 특정 미세 환경 조합에 노출의 결과로 세포 표현형을 평가하기 위해 며칠 동안 배양된 다음 고정, 염색 및 이미지화됩니다. 미세 환경은 간단한 조합이기 때문에 세포의 주요 현상형 변화를 유도하는 단백질을 식별하는 것은 간단합니다. MEMA는 세포 운명 결정 및 치료 4,5,6,7에대한 반응을 유도하는 요인을 포함하여 다중 세포 표현형에 영향을 미치는 요인을 확인하기 위해 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 반응은 간단한 2D 실험에서 검증될 수 있고 종양 미세 환경의 복잡성을 보다 완전하게 재입증하는 조건하에서 평가될 수 있다. MEMA 플랫폼은 좋은 표현형 바이오마커를 사용할 수 있는 경우 다양한 세포 유형 및 종점에 매우 적응할 수 있습니다.
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Protocol
참고: 예상 시간을 포함하여 전체 MEMA 프로세스의 개요는 그림1에 표시된 흐름 다이어그램에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 8웰 플레이트에서 MEMA의 제작에 대해 자세히 설명합니다. 프로토콜은 다른 플레이트 또는 슬라이드에 적용될 수 있다.
1. 단백질, 희석제 및 염색 완충제의 준비
- EPM, 리간드 및 사이토카인의 바이알을 실온(RT)에 평형화하고 잠시 원심분리기를 사용합니다. 제품 데이터 시트에 표시된 대로 적절한 RT 버퍼의 적절한 볼륨을 추가합니다. 재고 농도에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.
참고: 리간드 및 EPM의 전체 목록과 재고 및 최종 농도가 표 1 및 표2에 제공됩니다. 리간드와 EPM은 일반적으로 표준 2일 배양 어설슬에서 생물학적 효과를 유도하는 제조업체가 권장하는 범위의 가장 높은 농도로 사용됩니다. 오염을 방지하기 위해 라미나 흐름 아래의 생체 안전 캐비닛에서 단백질을 부드럽게 처리하십시오. - 1 시간 동안 RT에서 부드러운 흔들림으로 바이알을 배양하십시오. 이 변성 그들을 일으킬 수 있습니다 으로 소용돌이 단백질하지 마십시오.
- 모든 aliquots는 반복된 동결/해동 주기로 분해를 피하기 위해서만 일회용이 되도록 장기간 보관을 위한 Aliquot 단백질. 필요할 때까지 -80 °C (달리 명시되지 않은 경우)에서 동독화된 단백질을 저장합니다. (i) 단백질 이름, (ii) 준비된 날짜, (iii) 로트/배치 번호, (iv) 공급업체, (v) 카탈로그 번호, (vii) 농도, (vii) 볼륨 및 (viii) 준비자 등 향후 참조를 위해 모든 메타데이터를 수집하십시오.
- 글리세롤 20%(v/v) 글리세롤, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7.2, 및 필터 멸균을 포함하는 희석제 완충제를 준비합니다. 이 버퍼를 멸균 상태로 유지하고 RT에 보관하십시오.
- 인산완충식염수(PBS)에서 2%(w/v) BSA, 1 mM MgCl2및 0.02% NaN3를 함유하는 염색 완충액을 준비한다. 4°C에서 걸기 및 보관하십시오.
2. ECM 소스 플레이트 의 준비
- 인쇄할 ECM 단백질의 aliquoted 주식을 제거하고 얼음에 해동합니다. 메타데이터 추적을 위해 모든 로트 번호를 기록합니다.
- 해동된 단백질튜브를 부드럽게 톡톡하여 적절한 재서스펜션을 보장하고 원심분리기에서 스핀다운합니다.
-
ECM 인쇄 혼합물(EPM)과 형광 피덕스를 액체 처리 로봇이 사용하여 무작위 384웰 소스 플레이트를 만듭니다.
참고: 384웰 소스 플레이트는 터치 핀 어레이 프린터에서 8개의 웰 플레이트에 인쇄된 어레이를 만드는 데 사용됩니다.- 각 EPM 및 신탁에 대해 1.5 mL 미세 원심 분리튜브를 라벨로 지정합니다.
- 125 μL의 희석제 버퍼(1.4단계 참조)를 적절한 부피의 ECM 스톡과 결합하여 각 EPM을 준비하고 혼합물을 PBS와 함께 총 부피 250 μL까지 가져온다. 각 EPM 튜브의 최종 농도는 1x ECM 단백질, 5 mM EDTA, 10% 글리세롤 및 100 mM Tris일 것이다.
- 제조업체가 지정한 적절한 완충액으로 용해하여 형광 피럭을 준비하고 라벨이 부착된 신탁 튜브로 250 μL을 전달합니다.
3. 액체 핸들러를 사용하여 소스 플레이트 생성
- EPM의 위치를 임의화하고 사용 중인 어레이 프린터 핀 헤드에 최적화된 384웰 플레이트 레이아웃을 설계합니다. 배열 방향을 지원하기 위해 각 웰의 행 1, 열 1 위치에 인쇄되도록 신탁의 배치를 디자인합니다.
참고: 각 ECM의 총 14-15개의 복제가 강력한 데이터를 보장하는 데 사용됩니다. 결합의 균일성을 평가하기 위해 강력한 부착물을 생성하는 콜라겐 또는 다른 ECM의 추가 복제본을 포함합니다. 레이아웃은 관심 있는 EPM의 수에 따라 여러 개의 384웰 플레이트를 사용해야 할 수 있습니다. - EPM 튜브를 액체 핸들러로 옮기고 냉각 된 튜브 랙으로 튜브를 4 °C로 유지하거나 냉장실에있는 액체 처리 로봇을 사용하여 튜브를 유지하십시오.
- 액체 처리기의 소프트웨어를 사용하여 각 EPM의 15 μL과 384 웰 소스 플레이트 내의 미리 지정된 우물로 신탁을 전송하는 프로그램을 실행합니다.
- PBS를 사용하지 않은 우물에 파이펫하여 습도를 높이고 인쇄 공정 중 탈수방지를 방지합니다.
참고: 4 x 7 핀 헤드에 최적화되어 있고 콜라겐 I 블록 및 PBS를 포함하는 384 웰 소스 플레이트 세트의 예는 도 2를 참조하십시오. - 접시를 밀봉하고 인쇄 할 준비가 될 때까지 4 °C에서 유지하십시오.
4. 배열 인쇄 로봇을 사용하여 MEA 인쇄
참고: 프로토콜의 다음 부분은 특히 MCF7 세포의 성장 및 증식에 대한 상이한 미세 환경 단백질의 영향을 조사하기 위해 MEMA의 제조 및 사용을 설명합니다. 그러나, 프로토콜은 다른 리간드, EMS 및 세포를 사용하여 다른 세포주 및 관심 종점을 연구하도록 용이하게 적응될 수 있다.
-
터치 핀 프린터를 사용하여 Epm 과 fiducial 스팟을 8 개의 웰 플레이트에 인쇄하십시오. 재현성을 보장하기 위해 각 ECM 조건의 여러 복제본을 인쇄합니다.
참고: 다른 플레이트 형식이나 슬라이드를 인쇄에 사용할 수 있지만 최적의 스팟 형성을 위해 버퍼 최적화가 필요할 수 있습니다.- 4 x 7 프린트 헤드 구성으로 배열된 350 μm 직경 핀을 사용하여 MEMA용 EPM을 인쇄합니다. 8웰 플레이트의 배열을 35열로 20개의 열로 인쇄하여 총 ~700개의 지점을 지정합니다. 더 큰 배열은 이 격판덮개에서 가능하 그러나 세포 결합 과 염색 둘 다에 있는 증가한 가장자리 효력의 트레이드 오프와 함께 옵니다.
- 인쇄 후, 사용 하기 전에 최소 3 일 동안 건조기에서 접시를 저장 합니다.
5. 리간드 처리 플레이트 의 창조
- 관심 있는 리간드를 포함한 96웰 플레이트 레이아웃을 설계합니다. 한 번에 많은 MEMA 플레이트의 처리를 용이하게하기 위해, 8 웰 MEMA와 96 웰 플레이트의 우물 사이에 액체를 전송하는 4 간격 팁 멀티 채널 파이펫의 사용을 허용하는 간격으로이 플레이트를 설계합니다.
참고: 이 프로토콜에서는 표 2에 나열된 전체 리간드 세트가 활용됩니다. - 얼음에 리간드를 해동. 각 튜브를 짧게 쓸어 넘기고 회전시다.
- 제조업체의 권장 버퍼(일반적으로 PBS)를 사용하여 리간드를 200배 작업 재고로 희석합니다.
- 각 200x 리간드 스톡의 파이펫 10 μL은 96웰 플레이트 내에서 해당 웰내로 한다.
- -20 °C에서 접시를 밀봉하고 보관하십시오.
참고: 리간드 처리 플레이트를 일괄 처리하여 다운스트림 분석을 위한 모든 메타데이터를 캡처합니다.
6. MEMA에 세포 배양
- 20분 동안 MEMA를 20분 동안 블로킹 블로킹 버퍼당 2mL로 2%의 비파울 링 블로킹 을 함유하고 있는 비오염 차단제(재료표)를 이중 증류수(ddH2O)에서포함시켰다.
- PBS로 차단 버퍼 및 트리플 린스 웰을 흡인합니다. 건조를 방지하기 위해, 셀 도금준비가 될 때까지 우물에 PBS의 최종 부피를 둡니다.
참고: MEMA에서 세포 배양 단계를 위해 두 명의 벤치 작업자를 두는 것이 매우 유용합니다. 한 벤치 작업자는 포인더스 단계를 수행할 수 있으며 두 번째 작업자는 추가 단계를 수행할 수 있습니다. 파이펫팅을 위한 8웰 플레이트와 두 개의 파스퇴르 파이펫이 있는 Y-스플리터와 일치하는 팁이 있는 1mL 멀티채널 파이펫을 사용하여 한 번에 여러 웰을 흡인하는 것이 좋습니다. - 종자 2 x 105 MCF7 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS)을 함유하는 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM) 배지의 2 mL에서 잘 당한다.
참고: 전체 MEMA 실험에 앞서, MEMA 스팟이 원하는 실험 기간의 끝에 높은 세포 수(그러나 수렴되지 않음)를 갖도록 세포 수를 최적화하기 위해 세포 적정 실험을 수행한다. - 접착 의 2-18 시간 후, 배지를 흡인하고 감소 성장 매체의 2 mL로 교체 (0.1 % FBS와 DMEM).
참고: 감소된 혈청(예를 들어, 0.1% FBS) 또는 성장 인자 고갈 조건은 이때 특정 리간드의 자극적 영향을 격리하는데 사용될 수 있다. - 얼음에 리간드 처리 플레이트를 해동. 원심분리기는 1 분 동안 200 x g에서 플레이트를 해동했습니다.
- 배양플레이트에서 각각의 웰로부터 배지의 200 μL을 처리 플레이트에서 적절한 웰로 이송한다. 리간드 부피를 중간 크기로 혼합하고 이 혼합물을 MEMA 플레이트의 적절한 우물로 다시 이송하기 위해 위아래로 피펫을 피펫합니다.
- 손으로 가볍게 흔들고 MEMA 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 보냅니다. 37°C 및 5% CO2에서 리간드/ECM 조합의 존재 상태에서실험의 지속 기간 동안 배양.
참고: 일반적인 MEMA 실험은 72시간 동안 실행됩니다. 더 긴 기간 실험은 리간드로 배지 및 재처리를 대체해야 할 수 있습니다. - 펄스 MEMA는 100x 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)과 함께 71시간에서 10 μM의 최종 농도를 위해 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 EdU와 실험 조건에서 인큐베이션한다.
참고: 다른 라이브 세포 치료는 또한 이 때 사용될 수 있다.
7. 메마의 고정 및 염색
- 72 시간 및 모든 라이브 세포 치료 후, 우물을 흡인. RT에서 15분 동안 2% 파라포름알데히드(PFA)의 웰당 2 mL에 MEMA를 고정합니다.
- 흡인 PFA. 15 분 동안 0.1 % nonionic 계면 활성제의 웰 당 2 mL로 퍼메아빌화하십시오.
- 난비 계면 활성제를 흡인하고 PBS의 웰 당 2 mL로 세척합니다. 흡인 PBS. 0.05% 폴리소르베이트 20(PBS-T)으로 2mL의 PBS로 세척합니다.
참고: MEMA 표면은 소수성이며, 얼룩 및 항체 배양 전에 PBS-T로 씻지 못하면 배양 단계 동안 우물에서 공극이 형성되고 염색 아티팩트가 발생합니다. - 흡인 PBS-T. EdU 검출 반응 시약을 추가합니다. RT에서 1 시간 동안 배양하고 흔들며 빛으로부터 보호하십시오. 1 시간 배양 후, 제공된 상업적 담금질 완충액으로 반응을 담금질한다.
참고: EdU 검출 및 염색/항체 단계는 비용을 절감하기 위해 웰당 1.5 mL에서 수행될 수 있다. - 담금질 완충제를 흡기하고 얼룩 또는 항체로 배양하기 전에 PBS-T로 세척합니다.
- MEMA를 히스톤 H3K9me3(1:1,000) 및 피브리알라린(1:400)에 대한 항체와 함께 배양하여 2%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA), 1 mMM MgCl2 및 0.02% NaN3을 4°C에서 밤새 염색완충충제에 함유하였다.
참고: 전체 MEMA 세트에서 항체 적정을 사용하여 최적의 농도를 결정합니다. - 1 차 적인 항체 또는 얼룩 인큐베이션에 따라, PBS로 2 x 및 PBS-T로 한 번 우물을 씻으소서.
- 보조 항체 (당나귀 안티 마우스 IgG와 당나귀 안티 토끼 IgG, 모두 1:300) 및 0.5 μg / mL 4′ 6-diamidino-2-페니 날린 돌 (DAPI). 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- PBS의 웰당 2 mL로 우물을 2x 씻어 최종 2 mL PBS에 남깁니다.
- 빛으로부터 보호된 4°C에서 PBS에서 나중에 이미징을 위해 얼룩진 MEMA를 이미징또는 저장하십시오.
8. MEMAS의 이미징
- 적절한 형광 검출 채널을 갖춘 자동화된 이미징 시스템의 이미지 MEMA.
- 결과 이미지 데이터를 이미지 관리 시스템에 출력합니다. 셀 프로파일러 8을 사용하여셀을 분할하고 강도 수준을 계산합니다.
9. 데이터 분석
참고: 데이터 분석은 Raw CellProfiler 파생 데이터의 정규화, 변형 보정 및 요약으로 구성됩니다. 이 경우 사용자 지정 코드가 있는 R-환경은 모든 단계를 수행하는 데 사용됩니다. 그러나 모든 통계 환경 또는 소프트웨어 프로그램을 사용하여 동등한 작업을 수행할 수 있습니다. 분석을 위한 R 환경에 대한 오픈 소스 사용자 지정 코드의 예는 https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486 .
- 분할된 이미지 데이터를 사전 처리하고 정규화합니다.
- DAPI 염색 핵을 사용하여 스팟 세포 수를 결정합니다.
- 자동 게이트 EdU 강도를 사용하여 셀을 EdU+로 레이블지정합니다. 각 스팟에서 EdU+ 셀의 비율을 사용하여 증식을 측정합니다.
- 중앙값은 스팟 수준에서 세포질 얼룩 및 핵 형태 측정을 요약합니다.
- 데이터 품질 향상을 위해 데이터에 대한 원치 않는 변형(RUV) 정규화 제거를수행합니다.
참고: 이 접근법은 앞서9에설명된 바와 같이 행및 스팟을 사용하는 배열이 있는 매트릭스로서 각 강도 및 형태학적 신호에 독립적으로 적용된다. - 공간 또는 강도 관련 효과를 수정하기 위해 배열 행 및 배열 열을 독립 변수로 사용하여 RUV 정규화 된 잔류에 이변량 대류 정규화를 적용합니다.
- 정규화가 완료되면 중앙값은 보고 및 추가 분석을 위해 각 미세 환경 조건에 대한 복제를 요약합니다.
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Representative Results
세포 성장 및 증식에 대한 미세 환경적 영향을 단순화하고 세포 성장 및 증식을 촉진 또는 억제하는 조건을 식별하기 위해, 유방암 세포주 MCF7은 프로토콜에 기재된 바와 같이 8개의 8-well MEMA 세트에 시드되었다. 이 분석은 총 2736개의 조합 미세 환경 조건에 대해 48개의 상이한 EPM 및 57개의 다른 리간드에 세포를 노출하였다. 배양 에서 71 시간 후, 세포는 EdU, 고정, 투과 및 DAPI로 염색, EdU 검출에 대한 반응, 항-피브릴린 항체 및 항 H3K9me3 항체로 펄스하였다. 세포는 고함량 현미경으로 영상화하였다. 이미지는 오메로 서버10에업로드되었고, 셀프로파일러8을 사용하여 분할되었으며 R9에서정규화 및 분석되었습니다. 아래에 설명된 결과는 DAPI 및 EdU 신호에 중점을 둡니다.
MEMA의 이미지 분석 플랫폼은 DAPI에 기초하여 주어진 리간드(그림3A)로 치료된 세포에 대해 2N 및 4N 분획을 나타내는 DNA 함량 플롯과 같은 유세포분석 접근법에서 사용할 수 있는 것과 유사한 일부 결과를 산출합니다. 강도와 영역. 이 플롯은 G1 또는 G2 상에서 세포에 해당하는 명확한 바이모달 피크대 성장 체포 된 세포에 의해 표시된 바와 같이 활성 세포 사이클링을 촉진하는 조건에 대한 증거를 제공, 이는 제어 조건에 비해 피크의 변화를 보여 줄 것이다. 우리는 세포 번호와 염색 강도 데이터를 사용하여 데이터를 요약하고, 여기서 마이크로 환경의 영향 (한 축에 리간드, 두 번째 축에 ECM) 두 셀 번호 (그림3B) 및 EdU 통합 (그림3C) 히트맵 색상과 강도의 변화로 더 쉽게 볼 수 있습니다. 이러한 플롯에서 볼 수 있듯이, ECM 조건이 셀 수 또는 EdU 양성에 강하게 영향을 미치지 않았기 때문에 많은 효과가 리간드 구동된다. Nidogen-1은 이 ECM 분자의 존재가 MCF7의 세포 결합 및 성장을 억제하기 때문에 명백한 예외이다. FGF6 및 NRG1α(플롯의 NRG1.1)와 같은 리간드들은 세포 수를 향상시키고 EdU 통합비율이 높은 반면, AREG 및 NRG1-smdf(플롯의 NRG1.10)와 같은 리간드들은 세포 결합 및/또는 세포의 성장을 억제합니다. 이러한 발견은 세포 수와 EdU 양성의 명확한 차이가 분명한 반점 상에서 성장하는 세포의 이미지에 의해 뒷받침된다(도 3D의 예 참조).
MEMA 플랫폼은 새로운 기술이기 때문에 별도의 검사에서 결과가 검증되었습니다. MCF7 세포를 10% FBS로 DMEM 배지에 콜라겐 I로 코팅한 24웰 플레이트에 시드하였다. 18시간 후, 배지를 감소된 성장 배지(0.1% FBS를 가진 DMEM)로 교환하고 세포를 NRG1α, FGF6, 또는 AREG로 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 세포는 DAPI로 염색하고 EdU 편입, 이미지화, 분별, 분석하였다. MEMA 플랫폼에서 얻은 결과와 유사하게, FGF6 및 NRG1α 는 모두 AREG 처리 된 세포에 비해 더 높은 세포 수 (그림4A) 및 EdU 통합 비율 (그림4B)을 발생시켰으며, 우리의 관찰을 검증 원래 MEMA 실험.
그림 1 : 일반적인 MEMA 실험의 다양한 단계에 대한 워크플로우 및 타임라인을 보여주는 플로우 차트입니다. MEMA가 인쇄되면 사용하기 전에 몇 달 동안 건조된 실온에서 보관할 수 있습니다. 전형적으로, 실험 단계는 3-4 일 지속되고, 그러나 몇몇 느린 성장 1 차적인 세포는 최대 2 주 동안 MEMAs에 배양되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 어레이 인쇄를 위한 ECM 소스 플레이트 레이아웃. 콜라겐 블록은 그리드로 MEMA에 인쇄되어 우물 간에 보다 강력한 정규화를 허용하는 매우 반복적인 조건 세트를 제공합니다. PBS 충전 웰은 인쇄 공정 중 증발을 방지할 수 있도록 습도를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 일반적인 MEMA 실험에서 생성된 데이터의 예. (a) Binned DAPI 강도 값의 세포 주기 프로파일과 다른 리간드로 처리된 1개의 8웰 플레이트로부터의 세포 수, G1 대 G2 세포 주기 단계에서 세포를 나타내는 이중 DAPI 강도 염색을 나타낸다. (B) 계층적 클러스터링을 사용하여 유사성에 의해 군집된 정규화된 스팟 셀 수를 보여주는 히트맵입니다. 빨간색은 셀 수가 더 많고 파란색은 셀 수가 더 낮음을 나타냅니다. 리간드는 x축에 있고, EPM은 y축에 있습니다. (C) 정규화 된 EdU 통합을 보여주는 히트 맵, 빨간색은 높은 것을 나타내고 파란색은 낮은 EdU 통합을 나타냅니다. 리간드는 x축에 있고, EPM은 y축에 있습니다. (D) NRG1-α로 처리된 MEMA 스팟상에서 성장하는 MCF7 세포의 예로, EdU 혼입(분홍색 핵)의 높은 비율을 나타냈다. 녹색 얼룩은 셀 마스크이고 파란색은 DAPI입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : MEMA의 유효성 검사로 세포 배양이 발생합니다. (A) 상이한 리간드를 가진 MCF7의 처리로부터 발생하는 세포 수의 정량화. MCF7 세포의 동등한 숫자는 다중 벽 플레이트로 도금된 후 AREG, FGF6, 또는 NRG1α로 처리하였다. AREG로 처리된 웰은 72시간 후 리간드 치료에서 FGF6(** 학생의 t-test p-값 0.01 미만) 또는 NRG1α(* 0.05의 p-값)로 처리된 세포보다 훨씬 적은 세포를 가졌다. (B) 패널 A에서와같이 다른 리간드를 가진 처리로 인해 MCF7에 EdU 혼입의 수준을 정량화한다. AREG 처리 결과는 FGF6 (**, p< 0.01) 또는 NRG1α (*** , p= 0.01)로 처리된 세포보다 EdU를 통합하는 세포의 비율이 현저히 낮다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 단백질 이름 | 유니프로트 ID | 주식 농도 (μg/mL) |
최종 농도 (μg/mL) |
| 앙프1|1 | Q15389|1 | 100개 | 0.04 |
| 앙PT2|1 | O15123|1 | 100개 | 0.2 |
| 아레그 (주) | P15514 | 100개 | 0.02 |
| BMP2 | P12643 | 100개 | 0.1 |
| BMP3 | P12645 | 1000년 | 0.1 |
| BMP4 | P12644 | 100개 | 0.1 |
| BMP5|1 | P22003|1 | 100개 | 0.1 |
| BMP6 | P22004 | 100개 | 0.1 |
| BMP7 | P18075 | 100개 | 0.1 |
| CSF2 | P04141 | 100개 | 0.02 |
| CTGF |1 | P29279|1 | 100개 | 0.05 |
| CXCL12| 알파 | P48061|2 | 100개 | 0.01 |
| CXCL12| Beta | P48061|1 | 100개 | 0.03 |
| CXCL1 | P09341 | 100개 | 0.004 |
| CXCL8|1 | P10145|1 | 100개 | 0.3 |
| DLL1|1 | O00548|1 | 500개 | 0.5 |
| DLL4 | Q9NR61 | 200개 | 0.6 |
| EGF|1 | P01133|1 | 500개 | 0.01 |
| FASLG |1 | P48023|1 | 10개 | 0.02 |
| FGF2|3 | P09038|2 | 100개 | 0.01 |
| FGF6 | P10767 | 100개 | 0.01 |
| FLT3LG |1 | P49771|1 | 50개 | 0.001 |
| GPNMB|1 | Q14956|1 | 100개 | 0.5 |
| HGF|1 | P14210:1 | 50개 | 0.04 |
| IGF1 |1 | P05019|1 | 200개 | 0.01 |
| IGFBP2 | P18065 | 100개 | 0.05 |
| IGFBP3|1 | P17936|1 | 100개 | 0.1 |
| IL13 | P35225 | 100개 | 0.01 |
| IL15 | IL15S48AA | P40933|1 | 50개 | 0.01 |
| 일1B | P01584 | 25개 | 0.001 |
| IL6 | P05231 | 100개 | 0.01 |
| IL7|1 | P13232|1 | 100개 | 0.01 |
| JAG1|1 | P78504|1 | 200개 | 0.5 |
| JAG2 | 긴 | Q9Y219|1 | 100개 | 0.5 |
| 키티그|1 | P21583|1 | 100개 | 0.005 |
| KNG1 | Hmw | P01042|1 | 100개 | 0.2 |
| Lep | P41159 | 1000년 | 0.002 |
| 리브 1 | Q9Y5Y7 | 100개 | 0.05 |
| NRG1|10 | Q02297|10 | 100개 | 0.01 |
| NRG1|1 | Q02297|1 | 100개 | 0.05 |
| NRG1|6 | Q02297|6 | 100개 | 0.01 |
| PDGFAB | go1990265 | 100개 | 0.05 |
| PDGFB|1 | P01127|1 | 100개 | 0.05 |
| Ptn | P21246 | 100개 | 0.5 |
| 쉿 | Q15465 | 100개 | 0.5 |
| TGFB1 | | 체미누스 | P01137 | 체미누스 | 20개 | 0.01 |
| TGFB1 | | 무릎 | P01137 | 무릎 | 100개 | 0.15 |
| TGFB2 | A. | P61812|1 | 20개 | 0.01 |
| THPO |1 | P40225|1 | 50개 | 0.002 |
| TNFRSF11B | O00300 | 100개 | 0.02 |
| TNFSF11|1 | O14788|1 | 100개 | 0.01 |
| Tnf | P01375 | 100개 | 0.01 |
| 베그파 | VEGF206 | P15692|1 | 100개 | 0.01 |
| WNT10A | Q9GZT5 | 100개 | 0.1 |
| WNT3A |1 | P56704|1 | 200개 | 0.1 |
| Wnt5a|1 | P22725|1 | 100개 | 0.1 |
표 1: MEMA 실험에 사용되는 리간드의 전체 목록. 유니프로트 ID, 재고 농도 및 최종 작업 농도가 제공됩니다.
| ECM 단백질 | 유니프로티드 | 재고 농도 (μg/mL) |
최종 농도 (μg/mL) |
노트 |
| 알캠|1 | Q13740:1 | 100개 | 30개 | |
| CDH20 | Q9HBT6 | 300개 | 80 | |
| CDH6|1 | P55285|1 | 100개 | 40 | |
| CDH8 | P55286 | 100개 | 20개 | |
| CD44|1 | P16070|1 | 100개 | 30개 | |
| 체아캠6 | P40199 | 100개 | 30개 | |
| COL1A1 | P02453 | 5000 | 200개 | 여러 개의 유니프로트 ID가 있는 여러 하위 단위 |
| COL2A1|2 | P02458|2 | 1000년 | 200개 | |
| COL3A1|1 | P02461:1 | 1000년 | 200개 | |
| COL4A1|1 | P02462|1 | 1000년 | 200개 | 여러 개의 유니프로트 ID가 있는 여러 하위 단위 |
| COL5A1 | P20908 | 1000년 | 200개 | |
| COL23A1|1 | Q86Y22|1 | 200개 | 80 | |
| DSG2 | Q14126 | 100개 | 30개 | |
| CDH1|1 | P12830|1 | 100개 | 40 | |
| ECM1|1 | Q16610:1 | 100개 | 40 | |
| FN1|1 | P02751|1 | 1000년 | 200개 | |
| GAP43|1 | P17677|1 | 158년 | 40 | |
| HyA-500K | 1000년 | 200개 | LOR-0005 | |
| HyA-50K | 1000년 | 200개 | LOR-0007 | |
| ICAM1 | P05362 | 400개 | 80 | |
| 알캠|1 | Q13740:1 | 100개 | 30개 | |
| CDH20 | Q9HBT6 | 300개 | 80 | |
| CDH8 | P55286 | 100개 | 20개 | |
| CD44|1 | P16070|1 | 100개 | 30개 | |
| 체아캠6 | P40199 | 100개 | 30개 | |
| DSG2 | Q14126 | 100개 | 30개 | |
| CDH15 | P55291 | 100개 | 20개 | |
| VCAM1|1 | P19320:1 | 1000년 | 200개 | |
| 라마1 | P25391 | 500개 | 200개 | 여러 개의 유니프로트 ID가 있는 여러 하위 단위 |
| 라마3|2 | Q16787|2 | 130명 | 40 | |
| Lum | P51884 | 200개 | 80 | |
| CDH15 | P55291 | 100개 | 20개 | |
| NID1|1 | P14543:1 | 100개 | 9.3 μg/mL Nid, 130 μg/mL Lam, 46.5 μg/mL COL4 | +COL4 및 라미닌 |
| Omd | Q99983 | 100개 | 40 | |
| SPP1 | A. | P10451|1 | 100개 | 40 | |
| CDH3|1 | P22223|1 | 100개 | 40 | |
| 페캄1 | 긴 | P16284|1 | 150개 | 40 | |
| TNC|1 | P24821|1 | 500개 | 200개 | |
| VCAM1|1 | P19320:1 | 1000년 | 200개 | |
| VTN | P04004 | 100개 | 40 | |
| Bgn | P21810 | 100개 | 40 | |
| DCN | A. | P07585|1 | 300개 | 80 | |
| 포스트엔|1 | Q15063|1 | 100개 | 40 | |
| Sparc | P09486 | 100개 | 40 | |
| THBS1|1 | P07996|1 | 100개 | 40 | |
| BCAN |1 | Q96GW7|1 | 100개 | 40 | |
| ELN|3 | P15502|3 | 1000년 | 200개 | |
| FBN1 | P35555 | 254 | 80 |
표 2: MEMA 실험에 사용되는 ECM 단백질 및 조건의 전체 목록. 유니프로트 ID, 재고 농도 및 최종 작업 농도가 제공됩니다. 일부 예에서, 인쇄된 조건은 Notes 열에 표시된 단백질 복합체 또는 다중 단백질의 조합을 나타낸다.
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Discussion
"차원성"과 맥락의 중요성은 미세 환경(11)과의상호 작용을 통해 암세포의 특성화에 도구로서 시험관 내 배양 시스템의 개발에 동기 부여 요인이되었습니다 11, 및 생체 외에서의 능력 생체 내 환경을 모방하는 문화 시스템은 이러한 문화 시스템을 개선하기 위한 탐구의 원동력입니다. 그러나 체외 시스템은 복잡한 생체 내 상황을 단순화된 모델12로증류하는 능력 때문에 암 연구의 중요한 도구로 남아 있다.
2D 시스템에는 EPM과 리간드가 포함될 수 있지만, 전통적으로 광범위한 조합 관문 패널을 심문할 수 있는 처리능력이 부족했습니다. 인기있는 상업용 지하 막 추출물은 3D로 배양할 수 있지만 신중하게 정의된 단백질 패널의 출처가 부족합니다. 상업적 추출물은 전형적으로 불완전하게 정의된 조성물로 고통받아 분석을 혼동하고 상당한배치 대 배치 변동 3,13을초래할 수 있다. MEMA 플랫폼은 이러한 장벽을 극복하여 세포 표현형, 대사 활동, 분화 상태 및 세포 성장 및 증식의 변이에 대한 연구를 통해 구체적이고 정의된 내인성에 의해 조절됩니다. 요인.
MEMA 플랫폼은 세포의 표현형에 대한 미세 환경(ECM 및 용해성 인자 모두)의 영향을 평가하기 위한 강력한 중간-처리량 접근법입니다. 이 플랫폼은 활용 될 수있는 세포와 세포의 유형에 대한 큰 유연성을 보여줍니다. 우리는 세포가 노출되는 수용성 리간드 와 ECM 단백질 모두에서 효과를 관찰 할 수 있습니다. 실제로, 우리는 최근에 리간드가 HER2 표적 억제제에 저항의 주요 동인이었다는 것을 것을을 발견했습니다, 그러나 이 효력은 ECM5에의해 변조될 수 있었다. 폐, 방광, 전립선, 유방 및 췌장을 포함한 다른 세포 유형에서 유래된 1차 세포 및 세포주를 비롯한 다양한 세포뿐만 아니라 유도된 만능 줄기(iPS) 세포는 MEMA 플랫폼에서 성공적으로 배양되었습니다(참조) 참조 5,7,14)의예입니다. 다른 얼룩의 사용은 세포 성장, 분화 및 신진 대사를 포함하여 여러 세포 종점의 판독을 허용합니다. 다른 연구자들은 강성 또는 탄성 계수의 영향을 심문하기 위해 플랫폼을 확장하여 MEMA 플랫폼15에추가 차원을 추가했습니다. 마지막으로, 플랫폼은 약물 효능을 향상시키거나 억제하는 미세 환경 조건을 식별하기 위해 약물 스크린을 수행할 수 있으며, 최근 5,14,15가 보고되었습니다. .
MEMA 실험의 성공을 위한 가장 중요한 단계는 셀 도금 밀도를 최적화하는 것입니다. 셀의 밀도를 최적화하면 강력한 데이터를 제공하기에 충분한 세포가 존재하지만 스팟이 지나치게 혼잡해지는 것은 아닙니다. 동시 성 지점은 크게 결과를 혼동 할 수 있습니다, 특히 증식이 종점으로 사용되는 경우, 낮은 확산 속도가 미세 환경 요인과의 상호 작용의 결과인지 또는 접촉 억제로 인해 결정하는 것은 불가능 높은 세포 밀도. 세포 적정 실험은 스팟당 평균 세포 수가 도금된 셀의 수가 증가함에 따라 선형 증가를 나타내기 때문에 이러한 문제를 나타낼 수 있지만 결국에는 고원이 될 것입니다. 최적의 셀 번호는 곡선의 선형 범위에서 선택해야 합니다.
위에서 언급한 바와 같이, MEMA 플랫폼은 유연하고 상이한 표면을 가진 다양한 기판상에서 제조될 수 있다. 여기에는 유리 슬라이드 와 멀티 월 플레이트 형식이 포함됩니다. 우리의 경험에서, 모든 표면 화학은 MEMA 인쇄에 의무가 없습니다, 우리는 때문에 가난한 접착 특성과 다른 높은 접착 표면에 세포 접착을 차단하는 무능력일부 표면에 자리 분리를 관찰했다. 또한, 서로 다른 기판 간에 변경하려면 동일한 인쇄 버퍼를 사용하는 인쇄의 성능이 표면 화학에 따라 달라질 수 있으므로 버퍼 조건의 최적화가 필요합니다.
인쇄된 ECM 스폿의 직경은 데이터 품질에 중요한 역할을 합니다. 일반적으로 사용 중인 어레이에 사용할 수 있는 가장 큰 직경의 인쇄 핀을 사용하는 것이 좋습니다(현재 350 μm 직경 핀사용). 직경이 클수록 더 많은 수의 셀이 스팟을 차지할 수 있으며, 이는 더 작은 직경의 핀으로 생성되는 것보다 더 강력한 데이터를 생성시키는 경향이 있습니다. 세포의 결합은 스토스 과정이기 때문에, 각 스폿에 원래 부착된 셀의 수와 관련된 데이터에 높은 수준의 가변성이 있는 경향이 있다. 따라서 각 ECM 조건에 대해 많은 수의 복제를 인쇄하는 것이 좋습니다. 우리는 강력한 통계를 보장하기 위해 현재의 인쇄 조건과 함께 각 우물에서 10-15 ECM 복제를 인쇄합니다.
우리는 우리의 과거 실험에서 대부분의 경우, 리간드 효과 ECM 효과 지배 하는 경향이 지적 했다. 이것은 모든 ECM 반점에 콜라겐 I을 추가하기로 결정했기 때문일 수 있으며, 이는 강력한 세포 결합을 보장합니다. 그러나, 우리는 이것이 또한 ECM 효력을 균질화할 수 있다고 믿습니다, 대부분의 반점이 교원질 과 매우 유사한 방식으로 동작하는 경향이 있기 때문에 I. 콜라겐을 제외하기 위하여 반점 조성물을 변경하는 것은 와의 상호 작용결과로 차등 세포 행동귀착될 수 있습니다 ECM은 세포 결합에 크게 영향을 미치며, 이로 인해 더 많은 빈 반점이 발생합니다. 사용자는 이러한 차이를 염두에 두고 ECM 조성물을 맞춤화해야 하며, 특히 줄기 및 전구 세포 및 분화에 관심이 있는 사람들은 매트릭스가 상당한 영향을 미칠 수 있는16을조정한다.
우리는 전형적으로 상대적으로 짧은 시간 동안 MEMA 검술을 수행한다(예를 들어, 최대 72시간). 이것은 세포가 반점에 구속되기 때문입니다 (차단 버퍼는 우리의 경험에서 반점 밖에서 성장을 허용하지 않습니다). 급속하게 분할하는 세포로, 72 h 보다는 더 긴 성장은 세포가 혼잡해지고 서로에 쌓이게 될 때 이미지 분절을 복잡하게 하는 반점의 자라나는 달릴 것이고, 또한 성장 체포가 접촉 억제로 생길 수 있기 때문에 데이터에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 매우 느린 성장 1 차 세포와 더 긴 치료를 수행 (10−14 일), 하지만 주의 하 고 미디어를 변경 하 고 리간드를 보충 하는 이 분석에서 주의 해야 합니다 3−4 일.
MEMA 플랫폼을 개발하기 위한 지속적인 노력은 작은 배양 용기 내에서 이미징 및 최적화를 위한 광학 품질의 극대화, 관심 분야 의 두 가지 영역에 초점을 맞추고 있습니다. 광학 질은 연구원이 관심있는 그들의 마커의 세포내 외 현지화를 확인하기 위하여 고해상도 현미경 검사법을 요구할 때 결정적인 요인이 됩니다. 초기 스크린은 고해상도 현미경의 낮은 해상도에서 수행될 수 있고 고해상도 기기에서 특정 스팟을 이미징한 후, 기판의 광학적 특성이 좋지 않으면 이미지 품질이 저하될 수 있습니다. 기판의 광학적 특성을 개선하면 연구원은 선택한 이미지를 더 높은 해상도로 재획득할 필요 없이 고해상도 이미징 시스템에서 초기 스크린을 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 96웰 플레이트와 같은 작은 배양 용기에서 MEMA를 수행하는 능력은 치료 량을 감소시키고 심문된 리간드 및 복제물의 확장을 허용할 것입니다. 이러한 전이에는 새로운 배양 용기 내에서 기질 버퍼-단백질 상호 작용 및 어레이 프린팅의 최적화가 필요합니다. 이러한 지속적인 노력은 MEMA 플랫폼을 개선하고 다양한 세포 유형에 대한 세포 표현형을 변경하는 관련 미세 환경 단백질을 식별하는 강력한 기능을 확장하여 이후에 조사 될 수 있습니다. 확약어를
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 네트워크 셀룰러 서명 (LINCS) 보조금 HG008100 (J.W.G., L.M.H., 및 J.E.K)의 NIH 공통 기금 라이브러리에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| Vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
References
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