マイクロアレイを用いてがん細胞型に及ぼす微小環境への影響を調知る
Summary
ここで提示される方法の目的は、マイクロ環境マイクロアレイ(MEMA)を作製し、培養細胞の表現型に対する何千もの単純な組み合わせ微小環境の影響を調べるために使用する方法を示すことです。
Abstract
細胞の表現型に対する微小環境の影響を理解することは、生体内の微小環境における可溶性成長因子とマトリックス関連タンパク質の両方の複雑な混合物による困難な問題である。さらに、インビトロでの微小環境のモデリングに容易に利用可能な試薬は、通常、不完全に定義され、バッチからバッチの変動に苦しむタンパク質の複雑な混合物を利用します。マイクロ環境マイクロアレイ(MEMA)プラットフォームは、単一のアッセイにおける細胞表現型への影響について、マイクロ環境タンパク質の数千もの単純な組み合わせの評価を可能にします。MEMAはウェルプレートで調製され、個々のリガンドをアレイされた細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を含むウェルを分離することができます。各印刷されたECMとの可溶性リガンドの組み合わせは、ユニークな組み合わせを形成します。典型的なMEMAアッセイには、細胞が単一のアッセイでさらされている2,500を超えるユニークな組み合わせ微小環境が含まれています。試験ケースとして、乳癌細胞株MCF7をMEMAプラットフォーム上でメッキした。このアッセイの分析は、これらの細胞の増殖および増殖を増強および阻害する因子を同定した。MEMAのプラットホームは非常に適用範囲が広く、癌の研究を超えて他の生物学的質問と使用するために拡張することができる。
Introduction
2次元(2D)単層におけるプラスチック上の癌細胞株の培養は、がん研究者にとって依然として主要な主力の1つである。しかし、微小環境は、細胞の型示しに影響を与える能力のためにますます認識されています。癌において、腫瘍微小環境は、成長、生存、侵侵入、および治療1、2への応答を含む複数の細胞行動に影響を与える知られている。従来の単層細胞培養は、通常、微小環境の影響を欠き、市販の精製基膜抽出物を含む細胞を成長させるより複雑な3次元(3D)アッセイの開発につながっている。しかし、これらの精製行列は、通常、使用が複雑であり、バッチ変動3や複雑な組成3などの技術的な問題に苦しむ。その結果、細胞表現型3に影響を与える可能性のある特定のタンパク質に機能を割り当てるのは困難な場合があります。
これらの限界に対処するため、微小環境マイクロアレイ(MEMA)技術を開発し、微小環境を細胞外マトリックス(ECM)と可溶性成長因子タンパク質の単純な組み合わせにまで削減する4,5.MEMAプラットフォームは、細胞の挙動に影響を与える主要な微小環境因子の同定を可能にします。配列形式を使用することで、何千もの微小環境因子の組み合わせを1回の実験でアッセイすることができます。ここで説明するMEMAは、約2,500の異なるユニークな微小環境条件を尋問する。ウェルプレートに印刷されたECMタンパク質は、細胞を培養できる成長パッドを形成します。可溶性リガンドは個々のウェルに添加され、細胞が露出する各異なるスポットにユニークな組み合わせ微小環境(ECM +リガンド)を作成します。細胞は数日間培養され、次いで固定され、染色され、これらの特定の微小環境の組み合わせへの曝露の結果として細胞表現型を評価するために画像化される。微小環境は単純な組み合わせであるため、細胞の主要な現象的変化を駆動するタンパク質を特定するのは簡単です。MEMAは、細胞の運命決定と治療4、5、6、7への応答を駆動するものを含む、複数の細胞表現型に影響を与える因子を同定するために正常に使用されている。これらの応答は、単純な2D実験で検証することができ、腫瘍微小環境の複雑さをより完全に要約する条件下で評価することができます。MEMAプラットフォームは、良好なプノチピックバイオマーカーが利用可能である場合、様々な細胞タイプおよびエンドポイントに非常に適応可能です。
Protocol
Representative Results
Discussion
「次元性」と文脈の重要性は、微小環境11との相互作用を通じて癌細胞の特性評価のツールとしてのインビトロ培養システムの開発の動機付け要因となっている11、およびインビトロの能力インビボ環境を模倣する文化システムは、これらの文化システムを改善するための探求の原動力です。しかし、インビトロシステムは、単純化されたモデル12にインビ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIHコモン・ファンド・ライブラリー・オブ・ネットワーク・セルラー・シグネチャー(LINCS)助成金HG008100(J.W.G.、L.M.H.、J.E.K)によって支援されました。
Materials
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
References
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